GRP78 الإفراط في التعبير يطلق PINK 1- IP3R بوساطة الالتهام العصبي الجزء 1

خلاصة:

يعد النموذج التجريبي لقلع الجذر الشوكي (RA) مفيدًا لدراسة البرامج الجزيئية السببية التي تؤدي إلى التنكس العصبي الرجعي بعد انقطاع اتصال الخلايا العصبية المستهدفة.

يعد خلع جذر العمود الفقري إصابة قاتلة في الجهاز العصبي المركزي والتي قد يكون لها تأثير كبير على حياة المريض اليومية وقدرته الإدراكية. ولكن لحسن الحظ، لا تتأثر الذاكرة بالضرورة، ويمكن لمعظم المرضى تحسين ذاكرتهم من خلال بعض طرق إعادة التأهيل المعرفي الفعالة.

أظهرت العديد من الدراسات أن قلع الجذر الشوكي لا يؤثر بشكل مباشر على ذاكرة الشخص، ولكنه يؤثر بشكل أساسي على القدرة الإدراكية لدماغ المريض، بما في ذلك الانتباه والإدراك والتعلم. وهذا يعني أنه حتى لو تأثروا بقلع الجذر الشوكي، فإن العديد من الأشخاص ما زالوا يتمتعون بذاكرة جيدة.

لذلك، بالنسبة لأولئك المتأثرين بقلع الجذر الشوكي، فإن تحسين القدرة الإدراكية هو المفتاح لتحسين الذاكرة. إعادة التأهيل المعرفي هو وسيلة فعالة يمكن أن تساعد المرضى على إعادة بناء القدرة المعرفية للدماغ وبالتالي تحسين ذاكرتهم. وتشمل هذه الأساليب إغلاق العمليات الحسابية وما إلى ذلك، والتي يمكن أن تساعد المرضى على تحسين تركيزهم وحساسيتهم وسرعة رد فعلهم.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن الموقف الإيجابي هو أيضًا عامل مهم في تحسين الذاكرة. يجب على المرضى الذين يعانون من قلع جذر العمود الفقري، عند مواجهة التحديات والصعوبات، أن يحاولوا الحفاظ على موقف متفائل ومواجهة تحديات الحياة المختلفة بشجاعة لتحقيق أفضل النتائج في عملية إعادة التأهيل.

باختصار، لا تؤثر إصابة قلع جذر الحبل الشوكي بشكل مباشر على ذاكرة الشخص. يمكن لمعظم الناس تحسين ذاكرتهم من خلال طرق فعالة مثل إعادة التأهيل المعرفي. وفي الوقت نفسه، فإن الموقف المتفائل هو أيضًا المفتاح لتحسين الذاكرة. خلال عملية إعادة التأهيل، يجب أن نؤمن إيمانًا راسخًا بأننا قادرون على التغلب على الصعوبات والتحرك نحو مستقبل صحي خطوة بخطوة. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche هي مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية Cistanche من مكوناته النشطة المختلفة، بما في ذلك حمض التانيك، والسكريات، وجليكوسيدات الفلافونويد، وما إلى ذلك. ويمكن لهذه المكونات تعزيز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق تعرف على 10 طرق لتحسين الذاكرة

تشترك هذه العملية التنكسية العصبية في خصائص مشتركة مع العمليات المرتبطة بالأمراض العصبية مثل وجود إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) وانسداد تدفق الالتهام الذاتي.

لقد وجدنا سابقًا أن الإفراط في التعبير عن GRP78 يعزز الحماية العصبية الحركية بعد التهاب المفاصل الروماتويدي. بعد ذلك، سعينا إلى كشف الآلية الأساسية من خلال إجراء تحليل بروتيني مقارن وغير متحيز والتدخلات الدوائية والوراثية.

بشكل غير متوقع، تبين أن عوامل الميتوكوندريا هي الأكثر تغيرًا عندما تم الإفراط في التعبير عن GRP78، كما لوحظت وفرة الميتوكوندريا المغمورة، وهي السمة المميزة للميتوفاجي، بواسطة المجهر الإلكتروني في الخلايا العصبية الحركية المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي بعد الإفراط في التعبير عن GRP78.

بالإضافة إلى ذلك، أدى الإفراط في التعبير عن GRP78 إلى زيادة علامات الميتوكوندريا LC3-، وتعزيز إزاحة PINK1، وتحريض الميتوكوندريا، واستعادة وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا المجهدة ER.

وأخيرًا، وجدنا أن GRP78-يعزز التخفيف من الالتهام المؤيد للبقاء على قيد الحياة تم بوساطة PINK1 وIP3R في نموذجنا المختبري لموت العصب الحركي. تشير هذه البيانات إلى وجود علاقة جديدة بين مرافق GRP78 والتخفيف، مما يفتح خيارات علاجية جديدة لتصميم الأدوية لتحقيق الحماية العصبية.

الكلمات الرئيسية: GRP78/BiP؛ ميتوفاجيا. العصبونات الحركية. التنكس العصبي. الحماية العصبية.

1. مقدمة

يعد تعطيل الاتصال العصبي الوظيفي من الخصائص المبكرة الشائعة لعمليات التنكس العصبي [1]. يؤدي التنكس المحوري إلى عزل الخلايا العصبية التي تخضع لعملية خلل وظيفي تراجعية وتقدمية.

في مواجهة الضرر، تتفاعل الخلايا العصبية، وتنشط الآليات الداخلية للوقاية العصبية مثل استجابة البروتين غير المطوي (UPR)، والاستجابة للصدمة الحرارية، ومسار الالتهام الذاتي، ونظام اليوبيكويتين-البروتيزوم، وتعبير المرافقة، وآلية التحلل المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية (ER). (ERAD)، والدفاع المضاد للأكسدة.

على الرغم من أن تنشيطها الدقيق فعال في استعادة الخلية، إلا أن الضرر المفرط، وكذلك الشيخوخة، يمكن أن يؤدي إلى خلل في أداء واحد أو أكثر من هذه البرامج.

لقد فكرنا في أن محاكاة الطبيعة وتعزيز هذه الآليات الداخلية قد تكون استراتيجية فعالة للوقاية العصبية [2،3]. GRP78، المعروف أيضًا باسم BiP أو بروتين الصدمة الحرارية 5a (HSP5a)، هو بروتين متعدد الوظائف له وظائف مهمة في الآليات الداخلية للوقاية العصبية [4 ]. يقوم GRP78 بتنظيم UPR، الذي يتم تنشيطه بعد إجهاد ER، وله نشاط ATPase وهو بروتين رابط Ca 2+ [5،6].

كما أنه يعمل على تعزيز الطي المناسب للبروتينات المركبة حديثًا أو غير المطوية واستهداف البروتينات المفككة للتحلل بواسطة آلة ERAD (تمت المراجعة في [7]).

تشير الدلائل أيضًا إلى أن GRP78 يشارك في تحفيز الالتهام الذاتي الكلي، الذي يزيل كلاً من الأشكال القابلة للذوبان والمجمعة من البروتينات غير المطوية والعضيات المختلة وظيفياً [8-15].

لقد ثبت أن الإفراط في التعبير عن GRP78 يحمي الأعصاب في العديد من نماذج التنكس العصبي [16-23]، وقد لوحظ انخفاض في مستويات GRP78 أثناء الشيخوخة وطوال تطور الاضطرابات التنكسية [24].

ذكرت بعض هذه الدراسات أن الحماية العصبية تتم عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك، نادرًا ما يكون موت الخلايا المبرمج هو السبب الرئيسي لموت الخلايا العصبية أثناء عمليات التنكس العصبي [20،25-27].

وبالتالي، فإن هدفنا الرئيسي هو إنشاء الآليات التي يؤدي من خلالها الإفراط في التعبير عن GRP78 إلى الحماية العصبية باستخدام نماذج التنكس العصبي غير المعدلة وراثيًا.

على وجه الخصوص، استغلال المزايا التشريحية والتقنية لعدة نماذج من بضع العصبون الحركي الشوكي (MN)، أبلغنا سابقًا أن قلع جذر العصب (RA) يبدأ عملية تراجعية من التنكس العصبي الحركي (80٪ من فقدان MN على مدار شهر بعد الإصابة) تتميز بـ وجود إجهاد ER، وانسداد تدفق الالتهام الذاتي، والحويصلات، واعتقال تهريب البروتين، وتزامن موت الخلايا المبرمج / مضاد الخلايا المبرمج / anoikisinitiation ولكن عدم وجود تنفيذ فعال لموت الخلايا المبرمج [20،25،28].

لقد اكتشفنا أن التعبير عن GRP78 يُفقد بعد حوالي 5 أيام من التهاب المفاصل الروماتويدي داخل MNs التالفة وأن الإفراط في التعبير القسري يسمح لهم بالبقاء على قيد الحياة بعد بضع الفأس. كما وصفنا سابقًا، فإن دقة الالتهام الذاتي الصحيحة تزيد من بقاء الخلايا العصبية بعد التهاب المفاصل الروماتويدي [26]، ونحن نتساءل عما إذا كان من الممكن فك رموز ما إذا كان للالتهام الذاتي الانتقائي تأثير وقائي.

ومن ثم، استخدمنا نموذج RA لتوضيح الآليات التي تتوسط الحماية العصبية لـ GRP78 باستخدام تحليل بروتيني غير متحيز، وقمنا أيضًا بالتحقق من صحة الفرضية الناتجة عن طريق تحليل عمق المختبر باستخدام علاج التونيكاميسين الذي يؤدي إلى كل من إجهاد ER واعتقال تهريب البروتين، وهما خاصيتان رئيسيتان لنموذج RA [26].

2. المواد والأساليب

2.1. الإجراءات الجراحية

تم الاحتفاظ بفئران سبراغ داولي البالغة من العمر 12 أسبوعًا تحت ظروف قياسية من الضوء ودرجة الحرارة وتم إعطاؤها الطعام والماء حسب الرغبة. أجرينا عمليات جراحية تحت التخدير باستخدام مزيج من الكيتامين/زايلازين (0.1 مل/100 جم من الوزن) داخل الصفاق، بشكل أساسي كما ورد سابقًا [26،27].

لإجراء خلع إضافي للجذر العصبي الفقري للجذور L4-L5، قمنا بعمل شق جلدي في خط الوسط لتحديد كل جانب من العصب الوركي وقمنا بتطبيق جر معتدل على جذور مختارة بعيدًا عن الثقبة الفقرية، وحصلنا على الأعصاب الشوكية المختلطة التي تحتوي على الجذور الحركية والحسية. العقد الجذرية الظهرية.

تمت خياطة الجرح بالطائرات وتطهيره باستخدام البوفيدون اليود، وتم السماح للحيوانات بالتعافي في بيئة دافئة. واستخدمت الحيوانات التي تديرها الشام كعناصر تحكم.

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تتعلق بالحيوانات من قبل الإسبانية (Real Decreto 53/2013) والأوروبية (2010/63/UE)، وتمت الموافقة عليها من قبل Departament d'Agricultura، Ramaderia، Pesca، Alimentació i MediNatural التابعة للحكومة الكاتالونية (Generitat de كاتالونيا) التشريع.

2.2. البناء والتنقية والعدوى بالنواقل الفيروسية

تم استنساخ ترميز cDNA GRP78 (ATCC، LGC Promochem، Teddington، UK) في ناقل المكوك pAC.CMV. تم بناء الفيروسات الغدية المؤتلفة عن طريق إعادة التركيب المتماثل في خلايا HEK293.

كان الفيروس الغدي المتحكم الذي يعبر عن الجالاكتوزيداز البكتيري (Ad- -gal) بمثابة هدية لطيفة من CB Newgard (جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولاينا، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت تنقية الفيروسات باستخدام مجموعة Vivapure AdenoPackTM 20 وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Sartorius، Göttingen، Germany).

بالنسبة لبناء المتجهات المرتبطة بالغدة الغدية، تم استنساخ GRP78 cDNA في مواقع NheI وHindIII بين نطاقات ITR الخاصة بـ AAV2 بموجب تنظيم مروج CMV والعنصر المستجيب لفيروس التهاب الكبد الخشبي [29].

تم إنشاء ناقل AAVrh10 كما هو موصوف سابقًا [30] عن طريق ترنسفكأيشن ثلاثي لخلايا HEK 293- AAV (ستراتاجين، بيلينجهام، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية) مع بولي إيثيلين أمين متفرع (سيجما ألدريتش، سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) مع البلازميد الذي يحتوي على ITRs لـ AAV2، والبلازميد المساعد AAV الذي يحتوي على Rep2 وCapfor rh10 (يرجى توفيره بواسطة JM Wilson، جامعة بنسلفانيا، فيلادلفيا، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)، والبلازميد pXX6 الذي يحتوي على جينات الفيروسة الغدانية المساعدة [31]. تم توضيح النواقل المؤتلفة بعد معالجة البنزوناز (50 وحدة / مل، نوفاجين، ماديسون، ويسكونسن، الولايات المتحدة الأمريكية) وهطول الأمطار بولي إيثيلين جلايكول (PEG 8000، سيجما ألدريتش).

تمت تنقية المتجهات بواسطة تدرج اليوديكسانول بواسطة وحدة إنتاج المتجهات في CBATEG-UAB باتباع إجراءات التشغيل القياسية. تم قياس كمية الجينومات الفيروسية لكل مل (VG / مل) باستخدام PicoGreen (Invitrogen، Waltham، MA، USA).

مباشرة بعد التهاب المفاصل الروماتويدي، تم حقن الحيوانات بـ 14 ميكرولتر من فيروس Ad-GRP78 أو Ad-gal (108 pfu/mL) باستخدام إبرة قياس 33- وحقنة هاميلتون في المساحة القطنية في الموقع القطني.

بدلاً من ذلك، تم حقن الإدارة داخل القراب لـ 10 ميكرولتر من 4 × 10−10 جينومات فيروسية للفيروس المرتبط AAVrh10 adeno للإفراط في التعبير عن GFP أو GRP78 ببطء في CSF بين الفقرتين L3 وL4 للحيوانات المخدرة بالإيزوفلوران قبل ثلاثة أسابيع من RA [32].

استخدمنا AAVrh10 لأنه يصيب على وجه التحديد 30٪ من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري [32]. تم تأكيد الوصول المناسب إلى الفضاء داخل القراب من خلال نفض الغبار ذيل الحيوان. يتم تثبيت الإبر في مكان الحقن لمدة دقيقة واحدة، وبعد ذلك يتم خياطة العضلات والجلد.

2.3. تحضير العينات والتحليل البروتيني

قمنا بتخدير الفئران (ن=4–5) عند 7 نقطة في البوصة وحصلنا على عينات من شرائح الحبل الشوكي L4 – L5 (طول 5- مم)، والتي تم تجميدها في النيتروجين السائل. قمنا بتجانس الأنسجة في المخزن المؤقت للتحلل (20 ملي هيبيس، درجة الحموضة 7.7، 250 ملي سكروز، 1 ملي EDTA، 1 ملي EGTA، وكوكتيل من مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز) مع الخالط بوتر على الجليد.

بعد الطرد المركزي للسائل عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية، قمنا بجمع المواد الطافية الجزء ما بعد النووي والبروتين الكمي بواسطة اختبار BCA (شركة بيرس كيميكال، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية).

بالنسبة للتحليل البروتيني، قمنا بإذابة 75 ميكروغرام من كل عينة في 4% SDS،8 M يوريا، 0.1 M HEPES، الرقم الهيدروجيني 7.7، 0.1 M DTT، مضاف 0. 05 م يودو أسيتاميد، ويتم هضمه باستخدام التربسين (نسبة 1:10 من الإنزيم: الركيزة) باستخدام طريقة تحضير العينات بمساعدة التصفية (FASP).

تمت معالجة جميع العينات بالتوازي. قمنا بتحليل العينات باستخدام مطياف الكتلة LTQ-OrbitrapVelos (Thermo FisherScientific، Waltham، MA، USA) إلى جانب ProxeonEasyLC (Thermo Fisher Scientific). قمنا بتحميل مخاليط الببتيد مباشرة على العمود التحليلي (2 ميكرولتر) · دقيقة -1) والببتيدات المنفصلة بواسطة كروماتوجرافيا الطور العكسي باستخدام عمود 15- سم بقطر داخلي يبلغ 100 ميكرومتر معبأ بجزيئات 5- ميكرومتر C18 (شركة NikkyoTechnos، طوكيو، اليابان).

بدأت التدرجات الكروماتوغرافية عند 97% من المخزن المؤقت A (0.1% حمض الفورميك (FA) في الماء)، و3% المخزن المؤقت B (الأسيتونيتريل، 0.1% FA) بمعدل تدفق 500 nl ·min−1، وزيادة إلى 85% المخزن المؤقت A + 15% المخزن المؤقت B خلال 4 دقائق، وإلى 55% المخزن المؤقت A + 45% المخزن المؤقت B خلال 120 دقيقة.

قمنا بتشغيل الأداة في وضع TOP20 Data Dependent Acquisition مع مسح MS كامل في Orbitrap بدقة 60,000 ونطاق كتلة m/z 350–2000 متبوعًا بأطياف MS-MS للأيونات العشرين الأكثر كثافة . استخدمنا مصيدة الأيونات بطريقة التفكك الناجم عن الاصطدام لإنتاج أطياف الأيونات المجزأة واستخدمنا طاقة الاصطدام الطبيعية بنسبة 35٪. لقد حصلنا على جميع البيانات باستخدام برنامج Xcalibur v2.1.

استخدمنا مجموعة Proteome Discoverersoftware (الإصدار 1.3.0.339، Thermo Fisher Scientific) ومحرك بحث Mascot (الإصدار 2.3.01، Matrix Science50) لتحديد الببتيد وتحديد كميته.

قمنا بتحليل البيانات مقابل قاعدة بيانات SwissProt Rat التي تحتوي على الملوثات الأكثر شيوعًا (599 إدخالًا). استخدمنا تسامحًا سلائفًا للكتلة الأيونية قدره 7 جزء في المليون عند مستوى MS1 وسمحنا بما يصل إلى ثلاثة انقسامات خاطئة للتربسين.

تم ضبط تسامح كتلة أيون الجزء على 0.5 Da. تم تعيين أكسدة الميثيونين وأستلة البروتين الطرفي N كتعديلات متغيرة، وتم تعيين سيستين كارباميدوميثيل كتعديل ثابت.

قمنا بتصفية الببتيدات بناءً على معدل اكتشافها الخاطئ (FDR > 5% لم يتم أخذه في الاعتبار). بالنسبة لتقدير كمية الببتيد، أخذنا في الاعتبار الذروة الكروماتوغرافية للببتيدات المحسوبة باستخدام ProteomeDiscoverer وقام الوسيط بتطبيع المناطق عن طريق تحويل log2 باستخدام R 3.0.2. قمنا بقياس البيانات باستخدام حزمة R MSstats (الإصدار 2.0.1).

لكل نسبة، قمنا بحساب القيمة الاحتمالية المعدلة (p < 0.05 للأهمية). أخيرًا، أجرينا تحليل الجينات ومسار البروتينات المنظمة باستخدام أدوات DAVID Annotation Web (https://david.ncifcrf.gov/ التي تم الوصول إليها في 28 مايو 2021) وKEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway). html، تم الوصول إليه في 28 مايو 2021)، كما قمنا سابقًا (انظر المزيد من التفاصيل في [25]).

2.4. الكيمياء المناعية وتحليل الصور

بعد التخدير العميق بالبنتوباربيتال، قمنا بإرواء الحيوانات عبر القلب بمحلول ملحي يحتوي على 10 وحدة/مل من الهيبارين، متبوعًا بارافورمالدهيد 4% في محلول فوسفات 0.1 مولار، ودرجة الحموضة 7.2 لتثبيت الأنسجة عند 7 نقطة في البوصة (n {{7) }} لكل حالة)، وإزالة القطع L4 وL5 (الطول الإجمالي 5- مم) من الحبل الشوكي، والتي تم تثبيتها بعد ذلك في نفس المثبت لمدة 4 ساعات وتم حفظها بالتبريد في 30٪ سكروز طوال الليل.

تم الحصول على المقاطع التسلسلية المستعرضة ({{0}} ميكرومتر) على شرائح جيلاتينية باستخدام مبضع البرد (لايكا، ويتزلار، ألمانيا) وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى التحليل. بالنسبة للكيمياء المناعية، قمنا بمعالجة الشرائح بمحلول مانع في محلول ملحي تريس (TBS) مع 0.03٪ TritonX -100 و 10٪ مصل بقري لمدة ساعة واحدة واحتضانها بعد ذلك بأجسام مضادة أولية مختلفة: أرنب مضاد LC3B (ab51520؛ أبكام) 1:200) أو مضاد فيروس كورونا (A21355; LifeTechnologies;1:500).

بعد عدة عمليات غسل باستخدام TBS، 0.05% Tween-20، تم تحضين المقاطع لمدة ساعتين باستخدام الأجسام المضادة للأرنب Cy-2 أو Cy-3 المترافقة مع الحمير (JacksonImmunoresearch, ويست جروف، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية).

قمنا بصبغ المقاطع باستخدام DAPI (Sigma، St Louis، MO، USA)، أو NeuroTrace Fluorescent Nissl Stain (Molecular Probes، Leiden، TheNetherlands) وقمنا بتركيب الشرائح باستخدام وسط تركيب Fluoromount-G (SouthernBiotech، Birmingham، AL، الولايات المتحدة الأمريكية) أو مويول صناعة يدوية.

تمت معالجة الأقسام المراد مقارنتها معًا على نفس الشريحة وفي نفس اليوم.

تم التقاط صور لعينات الحبل الشوكي من علاجات وضوابط مختلفة في نفس وقت التعرض والحساسية والدقة لكل علامة تم تحليلها بمساعدة مجهر متحد البؤر (Zeiss LSM 700). قمنا بتحليل كثافة الإشارة باستخدام برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة؛ متاح على http://rsb.info.nih.gov/ij/، تم الوصول إليه في 28 مايو 2021).

For more information:1950477648nn@gmail.com