GRP78 الإفراط في التعبير يطلق اللون الوردي 1- الالتهام العصبي بوساطة IP3R الجزء 2

2.5. لطخة غربية

قمنا بتخدير الفئران بعمق باستخدام Dolethal (n=4) عند 7 نقطة في البوصة للحصول على شرائح الحبل الشوكي L4 – L5 (طول 5- مم) لتحليل اللطخة الغربية. قمنا بتجميد العينات في النيتروجين السائل.

في السنوات الأخيرة، أظهرت المزيد والمزيد من نتائج الأبحاث أن هناك علاقة وثيقة بين نشاف البروتين والذاكرة. نشاف البروتين هو أسلوب تحليلي للكشف عن التعبير البروتيني، والذي تم استخدامه على نطاق واسع في أبحاث علم الأعصاب.

يرتبط الاتصال بين الخلايا العصبية ارتباطًا وثيقًا بتخزين الذاكرة. يمكن أن يكتشف نشاف البروتين حالة الاتصال بين الخلايا العصبية والتعبير عن البروتينات قبل وبعد التشابك العصبي، مما يكشف أيضًا عن الدور الهام للبروتينات في تكوين الذاكرة وتخزينها.

لقد وجدت الدراسات أن التعبير عن البروتينات العصبية قبل المشبكي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتكوين الذاكرة وتخزينها. على سبيل المثال، أثناء عملية التعلم والذاكرة، تغير الخلايا العصبية تعبير بروتينات ما قبل المشبكي، ويرتبط هذا التغيير بتكوين وتخزين ذكريات جديدة. بالإضافة إلى ذلك، وجدت بعض الدراسات أيضًا أن التغيرات في التعبير عن بعض البروتينات ترتبط بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر.

لذلك، يمكن أن يوفر نشاف البروتين فهمًا متعمقًا لحالة الاتصال بين الخلايا العصبية والتغيرات في التعبير عن البروتينات ذات الصلة، مما يكشف عن الآلية الجزيئية للخلايا العصبية. وهذا له أهمية كبيرة لدراسة آلية تكوين الذاكرة والأمراض التنكسية العصبية.

باختصار، تظهر العلاقة بين نشاف البروتين والذاكرة دور البروتينات في الاتصال بين الخلايا العصبية وتخزين الذاكرة. وهذا يوفر أفكارًا واتجاهات جديدة لدراسة آلية تكوين الذاكرة والأمراض التنكسية العصبية. دعونا نعمل بنشاط على تعزيز أبحاث علم الأعصاب والمساهمة في الصحة وطول العمر! يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لسيستانش أن يحسن الذاكرة بشكل كبير لأنه يحتوي على تأثيرات مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ومضادة للشيخوخة، والتي يمكن أن تساعد في تقليل الاستجابات التأكسدية والالتهابية في الدماغ، وبالتالي حماية صحة الجهاز العصبي. نظام. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Cistanche أيضًا تعزيز نمو وإصلاح الخلايا العصبية، وبالتالي تعزيز اتصال الشبكات العصبية ووظيفتها. يمكن أن تساعد هذه التأثيرات في تحسين الذاكرة والقدرة على التعلم وسرعة التفكير، كما يمكنها أيضًا منع حدوث الخلل المعرفي والأمراض التنكسية العصبية.

انقر فوق معرفة طرق تحسين وظائف المخ

تم تخزين العينات أو معالجتها بشكل أكبر عن طريق التجانس في المخزن المؤقت للتحلل (20 ملي هيبيس، درجة الحموضة 7.7، 251 ملي سكروز، 1 ملي EDTA، 1 ملي EGTA، وكوكتيل من البروتياز (سيجما ألدريتش) ومثبطات الفوسفاتيز (روش، بازل، سويسرا) ) مع الخالط بوتر على الجليد.

بعد الطرد المركزي لل ليساتيس عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية، قمنا بجمع المادة الطافية ككسر ما بعد النووي، والبروتينات الكمية بواسطة BCAassay (شركة بيرس كيميكال).

بالنسبة للنشاف الغربي، قمنا بتحميل 30 ميكروغرام من أجزاء ما بعد النووية من شرائح L4-L5 من كل حيوان على 12٪ من المواد الهلامية SDS-polyacrylamide لإجراء فصل كهربائي مغذٍ للبروتينات متبوعًا بنقلها إلى غشاء PVDF في نظام BioRadcuvette في 25 مم تريس، درجة الحموضة 8.4، 192 ملي جليكاين، 20٪ (حجم / حجم) ميثانول.

لقد قمنا بحظر الأغشية باستخدام 5% من BSA في PBS بالإضافة إلى 0.1% توين-20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم تم تحضينها عند درجة حرارة 4 ◦ مئوية طوال الليل باستخدام الجسم المضاد الأولي: مضاد الفأر - - أكتين ( 1:10000؛ SigmaAldrich)، مضاد الماوس لـ GRP78 (1:500، Sigma-Aldrich)، مضاد السيرة الذاتية للماوس (1:1000، Invitrogen)، مضاد الأرنب لـ HSP60 (1:500، الأجسام المضادة عبر الإنترنت)، مضاد الماوس NDUFA9 (1:1000، Invitrogen)، مضاد الماوس لـ OPA1 (1:1000، BD Biosciences)، مضاد باركين الأرنب (1:500، Abcam، كامبريدج، المملكة المتحدة)، مضاد الماوس PINK1 (1:500، Abcam)، أرنب مضاد لـ NRF2 (1:500، Abcam)، مضاد MNF2 (1:500، Abcam)، أرنب مضاد GRP75 (1:500، Abcam).

بعد عدة عمليات غسل، تم تحضين الأغشية لمدة ساعتين مع جسم مضاد ثانوي مناسب مترافق مع بيروكسيداز الفجل (1:5000، Vector). تم تصور الغشاء باستخدام مزيج كيميائي من 1: 1 (0.5 م لومينول، 79.2 ملي مولار من حمض الكوماريك، 1 مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك، الرقم الهيدروجيني 8.5) و (8.8 مولار هيدروجين بيروكسيد، 1 مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك؛ الرقم الهيدروجيني 8.5)، و تم التقاط الصور باستخدام جهاز Gene Genome وتم تحليلها باستخدام برنامج Gene Snap وGene Tools (Syngene).

2.6. في نموذج المختبر

تم استزراع خلايا NSC34 في نسبة الجلوكوز المرتفعة المتوسطة في إيجل (DMEM، Biochrom، كامبريدج، المملكة المتحدة) مكملة بـ 1 0٪ من مصل الأبقار الجنيني (Sigma-Aldrich)، و100 وحدة / مل بنسلين، و0.5 × محلول بنسلين / ستربتومايسين. (Sigma-Aldrich) ويتم الحفاظ عليه في حاضنة مرطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تحت 5% من ثاني أكسيد الكربون، بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا [26].

بعد 4 أيام من زراعة الخلايا دون تغيير الوسط، كان لخلايا NSC34 نمط ظاهري متباين يتميز بوجود الخلايا العصبية الطويلة. وفي اليوم الرابع، تمت إضافة الأدوية إلى الخلايا. تم تحضير محاليل Tun (Sigma-Aldrich، Missouri، USA) و EFV (Bristol-Myers Squibb، New York، USA) بتركيز 10X وتم إذابتها في DMEM.

بعد 24 ساعة، تم تقييم جدوى الخلية عن طريق احتضان الخلايا بمحلول MTT 4 ملغ/مل لمدة 3 ساعات. تم إذابة بلورات الفورزان الزرقاء المشكلة في DMSO، وتم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروية (Elx800، Bio-tek، Winooski، VT، USA).

2.7. النواة

قمنا بنقل مليون خلية باستخدام بلازميد 2 ميكروغرام للتعبير عن GFP، وGRP78، وHAPARK، والماوس sh-eGFP، والماوس sh-PINK1 (ID 68943، Tebu-bio)، والماوس sh-Hspa5 (ID 14828، Tebu-bio)، و / أو الماوس sh-IP3R (ID 16440، Tebu-bio) باستخدام Amaxa Nucleofector II TM (Lonza، Basel، Switzerland) ومجموعة Nucleofactor V (Lonza) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة.

من أجل التحليل الخلوي الثابت، قمنا بزرع الخلايا في {{0}} صفائح جيدة مغطاة بالكولاجين بنسبة 10%. بعد الاستزراع، قمنا بإصلاح الخلايا بنسبة 4% من PFA، وشطفناها مرتين باستخدام PBS، وقمنا بتخزينها أو إضافتها لاحقًا إلى حاجز مانع يحتوي على PBS 0.3% (v/v)Triton X-100 و10% من مصل الأبقار الجنيني. بعد 3 أيام من زراعة الخلايا، تمت إضافة الأدوية المذابة في DMEM.

بالنسبة لهذه التجارب، استخدمنا 1 ميكرومتر Tun (Sigma-Aldrich)، أو 1 0 μMCCCP (Sigma-Aldrich)، أو 5 ميكرومتر CsA (Sigma-Aldrich)، أو 1 0 ميكرومتر BAPTA-AM (Sigma) -Aldrich). بعد 5 ساعات من العلاج، قمنا إما بإصلاح الخلايا للكيمياء المناعية باستخدام 4% PFA أو مجانستها في المخزن المؤقت RIPA المعدل (5 0 ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.5،150 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EGTA ، 1% NP-40، 0.5% ديوكسيكولات الصوديوم، 0.1% SDS، كوكتيلات البروتياز والفوسفاتيز) للتطعيم المناعي. تم إجراء الكيمياء المناعية عن طريق شطف العينات مرتين باستخدام PBS واحتضانها باستخدام عازلة مانعة تحتوي على PBSplus 0.3% (v/v) Triton X-100 و10% من مصل الأبقار الجنيني.

تم تحضيننا بالأجسام المضادة الأولية التالية: مضاد لـ IP3R للأرنب (1:200، Abcam)، ومضاد لـ HA (1:2000، Abcam)، ومضاد لـ GRP78 للفأر (1:200، Sigma-Aldrich)، ومضاد لـ HSP60 للأرنب. (1:500، الأجسام المضادة على الإنترنت). لتقييم الجدوى من MTT كما هو موضح أعلاه، تركنا العلاج لمدة 24 ساعة.

2.8. قياس إنتاج أكسيد الميتوكوندريا الفائق و∆ψM

تم تحضين الخلايا باستخدام 2.5 ميكرومتر MitoSOX لتحليل الأكسيد الفائق أو مع 2.5 ميكرومتر MTMRM لتحليل ∆ψM، سواء من المجسات الجزيئية أو Invitrogen خلال آخر 30 دقيقة من العلاج. تم الكشف عن الإسفار باستخدام مجهر IX81 Olympus وقياسه باستخدام برنامج القياس الخلوي الثابت.

2.9. القياس الكهروكيميائي لاستهلاك الأكسجين

تم تحريك الخلايا (1 × 106 لكل 1 مل في HBSS) في غرفة محكمة الغلق بالغاز عند 37 درجة مئوية. تم أخذ القياسات باستخدام قطب O2 من نوع Clark (Rank Brothers، Cambridge، UK) وتم تسجيلها باستخدام بيانات Dup.18 جهاز الاقتناء (WPI) مباشرة بعد 5-hالمعالجة بالمركبة أو Tun.

2.10. الميتوكوندريا والتجزئة الخلوية

تم تجانس الخلايا في المخزن المؤقت للتحلل (10 ملم HEPES، درجة الحموضة 7.4، 1 ملم EGTA، 250 ملم سكروز، وكوكتيل من البروتياز (Sigma-Aldrich) ومثبطات الفوسفاتيز (روش)) مع الخالط بوتر على الجليد.

بعد الطرد المركزي للسائل عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق، تم طرد الطاف عند 10000 × جم لمدة 12 دقيقة. تم اعتبار الطاف الجزء القابل للذوبان (S2) ويحتوي على بروتينات عصاري خلوي وميكروسومات.

كان Thepellet (P2) هو جزء الميتوكوندريا المخصب، والذي تم إعادة تعليقه في المخزن المؤقت RIPA المعدل (5 0 ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.5، 15 0 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EGTA، 1٪ NP {{8) }}، 0.5% ديوكسي كولات الصوديوم، 0.1% SDS، كوكتيل البروتياز والفوسفاتيز) وتم تحديد تركيز البروتين بواسطة اختبار BCA. ثم تمت معالجة العينات لطخة غربية.

2.11. المجهر الإلكتروني النافذ

قمنا بغمر شرائح الحبل الشوكي L{{0}} L5 (شرائح 1- مم) في محلول تثبيت قدره 2% (وزن/حجم) PFA و2.5% (حجم/حجم) جلوتارالدهيد (درجة EM) في 0.1 M PBS، درجة الحموضة 7.4 ووضعها على منصة هزازة لمدة ساعتين، ثم تم تثبيتها في 1% (وزن/حجم) PFA ثم تم تثبيتها لاحقًا بـ 1% (وزن/حجم) رابع أكسيد الأوزميوم (مختبر TAAB) ) يحتوي على 0.08٪ (وزن / حجم) بوتاسيوم هيكساسيانوفيرات (سيجما الدريخ) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين.

أجرينا أربع عمليات غسل بالماء منزوع الأيونات والجفاف المتسلسل في الأسيتون. تم تنفيذ جميع الإجراءات عند 4 درجة مئوية، كما هو موضح سابقًا [33]. قمنا بتضمين العينات في راتنج EPON وتم بلمرها عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

تمت معالجة العينات للحصول على مقاطع شبه رفيعة (1 ميكرومتر) باستخدام مشراح Leicaultracut UCT، ملطخًا بمحلول أزرق طولويدين مائي بنسبة 1٪ (وزن / حجم)، وتم فحصها باستخدام مجهر ضوئي لتحديد مناطق القرن البطني المخصبة بالـ MNs.

تم قطع مقاطع سامسونج (70 نانومتر) بسكين ماسي، ووضعها على شبكات مطلية، ومقارنتها مع خلات اليورانيل التقليدية ومحاليل رينولدز سترات الرصاص.

أخيرًا، قمنا بمراقبة المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (Jeol 1400) المجهز بكاميرا GatanUltrascan ES1000CCD. اخترنا ثلاث شرائح لكل حالة، وقمنا بتحليل ثلاث MNs لكل قسم، وقمنا بقياس مناطق النوى مقارنة بالمساحة الإجمالية للMN باستخدام أدوات ImageJ.

2.12. المعلوماتية الحيوية والإحصاء

استخدمنا تحليلات التباين (ANOVA) لمقارنة القيم بين المجموعات التجريبية المختلفة للبيانات التي حققت الافتراض الطبيعي. تم تحليل الاختلافات بين المجموعات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعًا باختبار Tukey متعدد النطاقات بعد الاختبار، أو باستخدام اختبار الطالب. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism5 (n=3–5; p <0.05 للأهمية).

3. النتائج

3.1. نص

3.1.1. كشف التحليل البروتيني للإفراط في التعبير عن GRP78 أن الميتوكوندريا هي الهدف الرئيسي

من أجل تحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى الحماية العصبية بوساطة الإفراط في التعبير عن GRP78، أجرينا تحليلًا بروتينيًا مقارنًا خاليًا من الملصقات لتحديد الاختلافات الكمية والنوعية بين الحيوانات المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي والمصابة بالفيروسات الغدية بسبب الإفراط في التعبير عن GRP78 (Ad-GRP78)، الذي وجد سابقًا أنه وقائي للأعصاب. من MNs، أو بيتا جالاكتوزيداز (Ad-ß-Gal) كعنصر تحكم [20].

كانت سبعة أيام بعد الإصابة (dpi) هي النقطة الزمنية المختارة للتحليل وفقًا للدراسات السابقة التي أجريت في مختبرنا [20،25]. في مقارنة سابقة بين نموذج التجديد بعد فغر العصب الوركي البعيد وخياطة العصب الوركي مقابل نموذج RA التنكسي لدينا، لاحظنا أن أحداث الإشارة كانت متشابهة حتى 7 نقطة في البوصة، عندما ظهرت أحداث تنكسية مؤيدة متباينة بعد RA [20،25].

أدى التحليل الخالي من الملصقات LC-MS/MS للكسور ما بعد النووية من شرائح الحبل الشوكي L4- L5 إلى تحديد 1420 بروتينًا، مع ما لا يقل عن اثنين من الببتيدات لكل بروتين كما تم الإبلاغ سابقًا عن عينات ودراسات أخرى [25] .

تم تغيير إجمالي 566 و732 من البروتينات أو الببتيدات بشكل ملحوظ بسبب فرط التعبير Ad-GRP78 أو Ad-ß-Gal، على التوالي، في الحيوانات المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي فيما يتعلق بالحيوانات المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي غير المصابة بفيروس (p < 0 .05) (الجدولان S1 وS2).

لقد قارنا كلتا القائمتين ووجدنا أن 220 تم تغييرها بشكل فريد بسبب Ad-GRP78overexpression (الجدول S3). سمح لنا التعليق التوضيحي الوظيفي لهذه البروتينات باستخدام أداة قاعدة بيانات التعليقات التوضيحية والتصور والاكتشاف المتكامل (DAVID) بالتعرف على أهم الوظائف البيولوجية في مجموعة البيانات (FDR <0.05) [34،35].

أدى الإفراط في التعبير عن GRP78 إلى اختلافات في مستويات البروتينات المشاركة في عمليات الميتوكوندريا ووظيفتها ومكوناتها (الجدول S4A – C، الشكل S1A – C). كشفت مصطلحات علم الجينات (GO) وتحليل إثراء مسار KEGG لهذه البيانات أنه في الحيوانات المصابة بـ Ad-GRP78 كان هناك انخفاضات كبيرة في مستويات العديد من البروتينات ذات وظائف الميتوكوندريا، بما في ذلك البروتينات من وجه الميتوكوندريا الخارجي والداخلي، وبروتينات المجمع التنفسي، وبروتينات المصفوفة.

لقد تأكدنا من وجود اختلافات في مستويات البروتين التي تم الكشف عنها في القائمة البروتينية، مثل GRP75، الذي تم تنظيمه (p < 0.05)، والوحدة الفرعية للمركب V (CV )، ناقص التنظيم (p=0.03) في مجموعات GRP78 كما هو متوقع (الشكل 1A).

عبر القائمة بأكملها، كان البروتين الأكثر انخفاضًا في التنظيم هو 2-بروتين أوكسوغلوتارات/مالاتيك OGC (SCL25A11)، MT-ND3 (كابت للورم يشارك في مكوك الثيمالات-الأسبارتات ويجدد مجمع NADH في مصفوفة الميتوكوندريا للسماح بمركب أنا أعمل)، الوحدة الفرعية NADH dehydrogenase 3 من المركب I، وحمض gammaaminobutyric aminotransferase ABAT، وubiquinol-cytochrome C reductasesubunit من المركب III. في المقابل، تم تنظيم عدد قليل جدًا من البروتينات (الشكل 1B).

كان البروتين أحادي التنظيم هو GRP78 كما هو متوقع، والبروتينات المنتظمة الأخرى هي ناقل حمض الأمينو EAAT2، والذي يقع بشكل أساسي في غشاء البلازما وأحيانًا في الميتوكوندريا عند نقاط الاشتباك العصبي المثيرة، وهيدروكسي أسيل- CoA ديهيدروجينيز HADHA، الذي يحفز الخطوات الثلاث الأخيرة من بيتا الميتوكوندريا. - أكسدة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة.

قمنا بتوسيع التحليل لمعرفة ما إذا كانت البروتينات الأخرى في الميتوكوندريا أو البروتينات المرتبطة بوظيفة الميتوكوندريا قد تم تعديلها من القائمة البروتينية من أجل تأكيد تأثير الميتوكوندريا الوظيفية (الشكل 1C).

لاحظنا أن ضمور GTPase البصري 1 (OPA1) المرتبط بالدينامينات والميتوكوندريا، والذي يشارك في الاندماج [36]، قد تم تنظيمه (p <0.1)؛ أظهر LONP1، وهو بروتياز يعتمد على ATP ويتوسط التحلل الانتقائي للبولي ببتيدات غير المطوية، ميلًا إلى الزيادة، ولكن لم تلاحظ أي اختلافات في مستويات يوبيكوينون NDUFA9، عامل النسخ NRF2، الذي ينظم الجينات التي تحتوي على عناصر الاستجابة المضادة للأكسدة، أو الدينامينات الأخرى. GTPase المرتبطة بالتسريب، مثل ميتوفوسين 2 (MFN2) [36].

يظهر ملخص شامل للتغيرات الموجودة داخل الميتوكوندريا في المخطط في الشكل 1د. تعتبر ديناميكيات الميتوكوندريا مهمة لاستجابات الإجهاد حيث يمكن للميتوكوندريا التالفة أن تندمج لتبادل المواد، كما يسمح انشطار الميتوكوندريا بفصل الميتوكوندريا التالفة والميتوكوندريا اللاحقة [37].

مع الأخذ في الاعتبار أن العدد الرئيسي من البروتينات المنتظمة تتمركز في الميتوكوندريا ولم تتم ملاحظة أي تغييرات واضحة فيما يتعلق بنشاط اندماج الميتوكوندريا من خلال تحليل MFN2 ونسبة أشكال L / S OPA1 (الشكل 1C)، قمنا بالتحقق من العلامات المتعلقة بالميتوفاجي.

كلاسيكيًا، يحدث تدهور الميتوكوندريا المعتمد على الالتهام الذاتي بعد إزالة الاستقطاب، وعادةً ما ينجم عن زيادة تراكم الفوسفاتيز والتنسينهومولوغ (PTEN) الناجم عن الكيناز المفترض 1 (PINK1) بالطول الكامل في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا.

بعد ذلك، يتم تجنيد بروتين ليجاز باركين E3 الموجود بين الحلقات لتمييز بروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا من الميتوكوندريا منزوعة الاستقطاب عن طريق الانتشار في كل مكان [38-41]. لا يُظهر الجزء العلوي من الشكل 2A أي تغييرات في مستويات باركين ولكن انخفاضًا كبيرًا في PINK1 كامل الطول الناتج عن إصابة RA في قطاع الحبل الشوكي L4-L5 المماثل فيما يتعلق بالتحكم عند 7 نقطة في البوصة. في المقابل، أدى الإفراط في التعبير عن GRP78 إلى تقليل مستويات باركين ولكن تضاعف مستويات PINK1 بعد RA مقارنة بالتحكم في التعبير عن البروتين غير المرتبط -Gal (الشكل 2A، أسفل).

يتوافق تنظيم الطول الكامل لـ PINK1 مع تحفيز عملية البلعمة [42]، وقد يكون تقليل باركين مرتبطًا بحالة متقدمة من تفكيك العضية كما لوحظ في بقية بروتينات الميتوكوندريا.

نحن نحقق أيضًا في التوطين المشترك للميتوكوندريا والبروتينات المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة 1A / 1B من السلسلة الخفيفة 3 (LC3) - النقاط الإيجابية، وهي مكون رئيسي في آلية البلعمة الكبيرة الأساسية وضرورية لعملية التخفيف [43].

باستخدام المجهر متحد البؤر، لاحظنا زيادة كبيرة في التوطين المشترك للميتوكوندريا، المسمى باستخدام مضاد COX IV، مع نقاط LC3- إيجابية بعد RA فقط في MNs التالفة التي تزيد من تعبير GRP78 عند 7 نقطة في البوصة (الشكل 2B).

لقد أكدنا وجود ميتوفاجي في MNs المتضخمة فقط عند الإفراط في التعبير عن GRP78 من خلال تحليل العينات باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال.

لاحظنا فجوات وفيرة تحتوي على الميتوكوندريا، وهي السمة المميزة للميتوفاجي [37]، تشبه الميتوفاجوسومات، والعديد من ERcisternae على اتصال وثيق بالميتوكوندريا داخل MNs من حيوانات Ad-GRP78، لكننا لم نكتشفها في Ad- - Gal RA-injured عينات الفئران عند 5 نقطة في البوصة (الشكل 2C).

الشكل 1. الإفراط في التعبير عن GRP78 في الحيوانات المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي يستهدف بروتينات الميتوكوندريا. (A) الرسوم البيانية المناعية والشريطية التي توضح متوسط ​​تغيرات الطية (± SEM) لمستويات بروتين GRP78 وGRP75 وCV في شرائح الحبل الشوكي L4-L5 في GRP78 مقابل GRP78.

-Gal overexpressing الفئران المصابة بـ RA بمقدار 7 نقطة في البوصة. تم تطبيع المستويات لقيم الأكتين (n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal، اختبار الطالب). (ب) رسم بياني لتغيرات طيات بروتين الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها عن طريق التحليل البروتيني لشرائح الحبل الشوكي L4- L5 من الحيوانات المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي والتي تزيد من تعبير GRP78 مقارنة بمجموعة Ad- - Gal بمقدار 7 نقطة في البوصة. (C) الكتل المناعية والرسوم البيانية الشريطية التي توضح متوسط ​​تغيرات الطية (± SEM) لـ NDUFA9، LONP1، NRF2، MFN2، OPA -1 التي تم تطبيعها إلى الأكتين. (لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات. اختبار الطالب). (D) الميتوكوندريا التخطيطية مع البروتينات التي تم تغييرها عن طريق الإفراط في التعبير عن GRP78 في شرائح الحبل الشوكي L 4- L5 من الحيوانات المصابة بـ RA والمظللة باللون الأصفر (انخفاض) أو باللون الأزرق (زيادة) عند 7 نقطة في البوصة.

الشكل 2. يتم تعديل ميتوفاجي في الجسم الحي بعد التهاب المفاصل الروماتويدي في الفئران التي تزيد من التعبير عن GRP78. ( A ) الكتل المناعية والرسوم البيانية الشريطية المقابلة لتحليل تغيير الطيات PINK1 و PARK لمستويات البروتين (يعني ± SEM) التي تم تطبيعها إلى مستويات الأكتين، في شرائح الحبل الشوكي L 4- L5 من RA-injuredrats مقابل.

التحكم (أعلى) أو من مجموعات Ad{{0}}Gal وAd-GRP78 (أسفل) بمقدار 7 نقطة في البوصة. (ن=4؛ * ع < 0.05، اختبار الطالب). (ب) على اليسار، صور مجهرية لممثلي MNs في الموقع المماثل من الحيوانات المصابة بـ RA التي تلقت حقنة داخل القراب من مجموعات AAVrh 10- GFP أو AAVrh 10- GRP78 عند 7 نقطة في البوصة. كانت العينات ملطخة بـ COX IV (أحمر) وLC3 (أخضر) وملطخة بفلورسنت نيسل (أزرق).

شريط المقياس=10 ميكرومتر والتكبير الرقمي في الإدخالات 10X.

لاحظ أنه يتم ملاحظة التوطين المشترك فقط في مجموعة AAVrh10-GRP78. على اليمين، رسم بياني شريطي يوضح تحليل النسبة المئوية لنقاط التوطين المشترك لـ COX IV وLC3. متوسط ​​± SEM لـ COX IV وLC3 التوطين المشترك (n=4؛ ** p < 0.01، اختبار الطالب). (ج) الصور المجهرية الإلكترونية للإرسال التمثيلي حيث تتميز الميتوكوندريا داخل MNs للحبال الشوكية: أ، صورة السيتوبلازم MN تظهر الميتوكوندريا وهي تتحكم في الحيوان؛ ب، صورة السيتوبلازم MN من الفئران المصابة بـ RA من مجموعة Ad- -gal؛ ج، صورة السيتوبلازم MN من الفئران المصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي من مجموعة Ad-GRP78 مع بعض الميتوكوندريا المغمورة المشار إليها بالعلامات النجمية الحمراء؛ د، تظهر صورة التكبير الأعلى في (C) مشيرة إلى اتصال كبير بالميتوكوندريا وER. يشار إلى أشرطة النطاق في الأشكال.

إجمالاً، تشير هذه النتائج إلى أن الإفراط في التعبير عن GRP78 قد يحفز MNs المنفصلة عن الميتوفاجين بعد التهاب المفاصل الروماتويدي، ويمكن أن يعزز الحماية العصبية.

3.1.2. يعيد التعبير الزائد GRP78 وظيفة الميتوكوندريا التالفة

قمنا بعد ذلك بالتحقيق بشكل أكبر في تأثير الإفراط في التعبير عن GRP78 على الميتوكوندريا باستخدام نموذج في المختبر لإجهاد ER نظرًا لأن هذه الإهانة تظهر مبكرًا بعد إصابة التهاب المفاصل الروماتويدي في الكائنات الحية التي تم الإبلاغ عنها سابقًا [20،26]، وهي طريقة موثوقة لفحص العوامل الوقائية العصبية الجديدة [2،44 ].

يستخدم هذا النموذج tunicamycin (Tun)، وهو محفز لإجهاد ER الذي يتسبب في تكوين وسيط N-acetylglucosamine-lipid، وبالتالي يمنع الارتباط بالجليكوزيل في البروتينات المركبة حديثًا ويؤدي إلى اختلال البروتينات. لقد استخدمنا ذلك لأنه تم أيضًا الإبلاغ عن أن المسار الإفرازي المتوقف هو المفتاح في عملية التنكس العصبي بعد التهاب المفاصل الروماتويدي [26].

لقد تحققنا أولاً من أن التكاثر النووي للخلايا العصبية الحركية NSC34 مع ناقل مناسب أدى إلى إنتاج GRP78 (الشكل 3A). في هذه الخلايا، أدى التعبير عن GRP78 إلى تعزيز البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ في الوسط الذي يحتوي على Tun (الشكل 3B).

على الرغم من أن علاج Tun يحفز عادةً GRP78 نفسه، إلا أن هذا التعبير الزائد الداخلي متأخر جدًا (بمقدار 24 ساعة) (الشكل S2). تساءلنا أيضًا عما إذا كان بإمكاننا تحديد ما إذا كان الإفراط في التعبير عن GRP78 له تأثيرات وقائية عصبية في نموذج مختبري آخر أبلغنا عنه سابقًا لإعادة إنتاج العديد من خصائص وفاة MN بعد إصابة RA [26].

يعتمد هذا النموذج على تلف الهيكل الخلوي الناجم عن النوكودازول، والذي يتداخل مع بلمرة الأنابيب الدقيقة. زاد التعبير GRP78 من صلاحية الخلايا المستزرعة في وجود النوكودازول أيضًا (الشكل 3B).

بعد ذلك، قمنا بتقييم وظيفة الميتوكوندريا عن طريق قياس توليد أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) في الميتوكوندريا باستخدام MitoSOX، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (∆ψm) باستخدام رباعي ميثيل رودامين ميثيل إستر (TMRM)، ومعدل استهلاك O2، في خلايا NSC34 لدينا المعرضة لضغط ER مع أو بدون تعبير GRP78 الزائد.

كعنصر تحكم إيجابي، استخدمنا efavirenz (EFV)، وهو عامل سام للانقسام الذي يغير جميع المعلمات الثلاثة [45]. لاحظنا أن مستويات MitoSOX زادت تدريجياً بعد إضافة Tun، ووصلت إلى دلالة إحصائية بمقدار 24 ساعة وأن توليد ROS زاد بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بـ EFV من الساعة الأولى بعد العلاج فيما يتعلق بالضوابط المعالجة بالمركبة (الشكل S3A).

أدى الإفراط في التعبير عن GRP78 إلى مستويات أقل بكثير من الميتوكوندريا ROSin فيما يتعلق بالخلايا المعبرة عن GFP عند 24 ساعة بعد علاج Tun أو EFV (الشكل 3C). تم انهيار ∆ψm بعد 5 و 24 ساعة من علاج Tun وبعد 24 ساعة من علاج EFV (الشكل S3B). تم تحقيق استعادة هذه المعلمة عن طريق GRP78 overexpressionin الخلايا المعالجة بـ Tun- أو EFV (الشكل ثلاثي الأبعاد).

انخفض معدل استهلاك O2 خلال 8 0 دقيقة من التحليل بعد إضافة Tun في الخلايا التي تعبر عن GFP (المنحدر −0.063,R2=0.98)، ولكن كان استهلاك O2 مستقر في خلايا GRP 78- المفرطة في التعبير على الرغم من وجود Tun (المنحدر −0.221، R 2=0.99) (الشكل 3E، يسار).

بعد 5 ساعات، كان التنفس طبيعيًا في خلايا GRP78- ذات التعبير الزائد وتعرض للخطر بشدة في الخلايا التي تعبر عن GFP (الشكل 3E، يمين). إجمالاً، تشير هذه النتائج إلى أن GRP78 يخفف من خلل الميتوكوندريا الناجم عن إجهاد ER أو السمية الميتوكوندرية.

For more information:1950477648nn@gmail.com