يحدد مقياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة نمطًا معينًا من الغانغليوزيد في مرض الكلى السكري المبكر لدى مرضى السكري من النوع 2 Ⅱ

2.2. التحليل الهيكلي التفصيلي للأنواع متعددة السيالات المرتبطة بالبيلة الألبومينية الكبيرة بواسطة HCD MS/MS

أظهر فحص HR-MS أن الغانغليوزيد لدى مرضى الزلال الزلالي يتميز بارتفاع محتوى حمض السياليك بشكل عام. تم تحديد ما لا يقل عن أربعة عقدية خماسية من فئة GQ1 في العينة A3 بدقة جماعية عالية. تم تعيين الأيون عند m/z 812.7{{10}}68، الذي تم اكتشافه فقط في طيف الكتلة الغربلة لـ A3، وفقًا لحساب الكتلة، إلى GQ1 (d18:1/18) المنزوع البروتونات والصودا :0). من أجل التوصيف الهيكلي لهذه الأنواع المرتبطة بالبيلة الألبومينية الكبيرة بالتفصيل، قمنا بعزل الأيون عند m/z 812.7068 وأرسلناه إلى HCD MS/MS في HR في وضع الأيون السالب. وكانت أهداف هذه التجربة MS جنبا إلى جنب: (ط) التحقيق في هيكل سلسلة قليل السكاريد؛ (2) تأكيد تكوين سيراميد، الذي تم افتراضه بالنظر إلى كتلة جزيئات GQ1 بأكملها؛ (3) جمع بيانات محددة حول توطين السكريات الأحادية Neu5Ac على طول العمود الفقري قليل السكاريد، مما يؤدي إلى تمييز الأيزومر من الهياكل الخمسة الأكثر شيوعًا GQ1(d18:1/18:0) (الشكل 3) التي قد تكون موجودة في بول مرضى الزلال الزلالي الكبير.

تم توضيح طيف التجزئة لأيون السلائف [M-4H+Na]3− المكتشف عند m/z 812.7068، والذي تم إنشاؤه من خلال الجمع بين TIC المكتسب لمدة دقيقتين تحت طاقة تصادم متغيرة ضمن نطاق 30-80 فولت. في الشكل 4.

الشكل 3. الأيزومرات الخمسة الأكثر شيوعًا لـ GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) iso mer؛ (ب) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) أيزومر؛ (C) GQ1c(d18:1/18:0) أيزومر؛ (د) GQ1d(d18:1/18:0) أيزومر؛ (E) أيزومر GQ1e(d18:1/18:0).

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

انقر هنا للحصول على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى.

تتحقق بيانات MS/MS من صحة تركيبة (d18:1/18:0) للسيراميد بواسطة Y0 عند m/z 564.8704 وY1 عند m/z 726.5845 المطابق لتسلسل Glc-Cer، وكذلك أيون الانقسام الداخلي، S، عند m/z 325.1828 المطابق للحمض الدهني C18:0 (الشكل 5). وبالمثل، يتم أيضًا توثيق حالة التحلل الشامل للجزيء. ومن ثم، من خلال أيون B1 المكتشف عند m/z 290.0868 ونظيره المعالج بالصودا عند m/z 312.0686 المطابق لفصل بقايا Neu5Ac واحدة من الأيون الأصلي، مع العنصر البعيد المكتشف عند m/z 581.1807 وm/z 603.1626 ، تأكد من حدوث الارتباط Neu5Ac-Neu5Ac.

الشكل 5. مخطط التجزئة بواسطة HCD MS/MS الذي تمت تجربته بواسطة سلائف [M-4H++Na+ ] 3− عند m/z 812.7068 وتشخيص الأيونات التسلسلية للأيزومر الهيكلي GQ1d.

بالنظر إلى موضع الارتباط الأكثر شيوعًا لبقايا Neu5Ac سواء في Gal الداخلي أو الخارجي، هناك خمسة مرشحين هيكليين محتملين لـ GQ1(d18:1/18:0)، كما هو موضح في الشكل 3. ومع ذلك، فإن الأيون عند m/z 1032.3662 يتكون من رابطة مزدوجة وانقسامات داخلية متقاطعة ومخصصة لـ Z4 /Y0/ 2,4A2، مع الأيون المكتشف عند m/z 936.7894 كـ Y2 / 3,5A1، يدعم ربط جميع بقايا Neu5Ac الأربعة بالغال الداخلي. على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد حدوث أيزومرات هيكلية أخرى بشكل كامل، إلا أن هذين الأيونين الشظيين يوضحان أن الشكل الهيكلي يتوافق مع المرشح (D)، والذي يتوافق مع الأيزومر d لـ GQ1(d18:1/18:0) ، موجود بالتأكيد في عينة A3. المخطط في الشكل 5 يصور مسار التجزئة الذي يعاني منه أيون السلائف المطابق لـ GQ1d(d18:1/18:0).

المرشح التالي المرتبط بالبيلة الألبومينية الكبيرة للتحليل الهيكلي التفصيلي هو الأيون [M-3H+ ] 3− المكتشف فقط في طيف كتلة الفحص لعينة A3 عند m/z 708.3379 وتم تعيينه، على أساس حساب الكتلة الدقيق، إلى GT1(d18:1/18:0). تم عزل هذا الأيون وتقديمه لتحليل التجزئة بواسطة MS ترادفيًا باستخدام HCD. يتم عرض طيف أيون المنتج الناتج عن تلخيص عمليات المسح التي تم الحصول عليها لمدة دقيقتين في طاقات تصادم متغيرة بين 30 و80 فولت في الشكل 6، إلى جانب التركيب الكيميائي لهذا النوع وتعيين الإشارات الرئيسية. يتم توضيح آلية التجزئة في ظل ظروف MS/MS المستخدمة، إلى جانب أيونات الأجزاء التشخيصية، في الشكل 7. لتعزيز رؤية جميع أيونات المنتج المخصصة، يكمل الجدول 3 قائمة الإشارات المحددة في الطيف المعروض في الشكل 6.

الشكل 6. التحليل الهيكلي بواسطة (-) nanoESI HR HCD MS/MS لأيون السلائف [M-3H+ ] 3− المكتشف في العينة A3 عند m/z 708.3379، والذي وفقًا للحساب الشامل، يتوافق مع GT1(d18:1/18:0). وقت الاقتناء: 2 دقيقة؛ طاقات تصادم متغيرة ضمن 30-80 فولت. أقحم: هيكل الأيزومر GT1b(d18:1/18:0) المستخلص من بيانات MS/MS.

أدى تجزئة HCD إلى ظهور العديد من الأيونات المتسلسلة، والتي حدثت نتيجة للروابط الجليكوسيدية والانقسامات المتقاطعة. تعتبر هذه الأيونات مفيدة للغاية لتعيين تسلسل الكربوهيدرات بأكمله، مع تحديد أيزومرات موضعية GT1، ولتأكيد تركيبة سيراميد أجليكون.

يتم الكشف عن نوع d18:1/18:0 من السيراميد بواسطة أيون Y0 عند m/z 564.5353 ويدعمه تسلسل Glc-Cer المحدد من خلال Y1 عند m/z 726.5879. علاوة على ذلك، فإن تخصيص الأيونات يدل على وجود الشكل الإسوي GT1. قد يتواجد الأيون عند m/z 493.1669، بتركيبة NeuAc-GalNAc، حصريًا من GT1، والذي يتميز بتفاعل سياليل بقايا GalNAc. تشير بقية الأيونات المجزأة إلى وجود الأيزومر الهيكلي GT1b في العينة A3. يتم دعم بنية GT1b بواسطة جميع الأيونات الناشئة من الطرف غير المختزل للجزيء، والتي تم توثيقها بواسطة سلسلة من النوع Y، مصحوبة بأيونات Z، يظهر أحدهما بوفرة أقل (الشكل 6). ومع ذلك، فإن Y2 /B2 الذي تم اكتشافه كأيون ذو وفرة معقولة عند m/z 888.6405 يعطي دليلاً على تسلسل Gal-Glc-Cer، والذي ربما نشأ من أيزومر GT1a أو GT1b بعد إزالة التحلل المعني بواسطة انفصال Neu5Ac أو Neu5Ac-Neu5Ac من Gal الداخلي أو من أيزومر يحتوي على Gal داخلي غير مستبدل، مثل GT1d.

من ناحية أخرى، Y2 المكتشف عند m/z 734.5701 يثبت توطين عنصر disialo Neu5AcNeu5Ac في Gal الداخلي، وهو تكوين يتوافق مع أيزومر GT1b. يتضح أيضًا وجود المجموعة البعيدة من خلال أيون B2 عند m/z 581.1828.

في HCD MS/MS، ترتبط العديد من الإشارات بإزالة التحلل الجزئي للجزيء، مثل أيونات Y4 و/أو Y3 المقابلة لتسلسل Gg4Cer المنزوع اللعاب؛ ومع ذلك، لا يمكن لهذه الأيونات أن تشير إلى مواقع مرفقات Neu5Ac في قلب Gg4 الغليكان المحايد. بالإضافة إلى ذلك، فإن الإشارة عند m/z 364.1243 المقابلة لتسلسل Gal-GalNAc المخصص لأيون الانقسام الداخلي GT1b B3 /B1 تعزى إلى أيزومر GT1c لأن هذا الجليكوفورم يحتوي على ثنائي السكاريد Gal-GalNAc غير المستبدل. وبالتالي، باستثناء Y2، المرتبط بـ GT1b، يمكن أن تنشأ جميع الأيونات من أيزومرات موضعية Neu5Ac أخرى، مثل GT1a، GT1، GT1c، أو حتى GT1d التي نادرًا ما يتم الإبلاغ عنها. من ناحية أخرى، قد يكون Y2 نفسه نتيجة لحدث منخفض الاحتمال، والذي أدى أيضًا إلى إزالة Neu5Ac من عنصر التجارب المرتبط بـ Gal الداخلي.

بالنظر إلى أنه، باستثناء الكشف عن GT1، فإن بيانات MS/MS المتعلقة بانقسامات الرابطة الجليكوسيدية لم تكن قادرة على تعيين أيزومرات GT1 أخرى بشكل لا لبس فيه في خليط A3، قمنا بتحليل أيونات انقسام الحلقة بعناية أكبر من أجل اكتشاف التجزئة الداخلية المحتملة التي تدعم GT1b. لاحظنا وجود أيون ثلاثي الشحن منخفض الكثافة عند m/z 634.6067، وهو ما يتوافق مع نوع 0,2 من الانقسام المتقاطع في إحدى بقايا حمض السياليك الطرفية، والتي، في في حالة الأنواع GT1b، يمكن أن تحدث إما من 0 أو 2X4 أو 0,2X3 أو كليهما. نظرًا لأن أيزومر GT1b أكثر شيوعًا بشكل عام من GT1، يعرض الشكلان 6 و7 تخصيص الأيونات ومخطط التجزئة الخاص بـ GT1b.

نظرًا لتناظر سلسلة Gal-GalNAc-Gal، لا توجد إمكانية لاستبعاد الأيزومرات الهيكلية الأخرى تمامًا. على الرغم من أن بيانات HCD MS/MS توضح وجود GQ1d(d18:1/18:0)، وGT1 (d18:1/18:0)، وGT1b(d18:1/18: 0) في العينة A3، لا يمكن استبعاد احتمال وجود أيزومرات GQ1 وGT1 الأخرى. ومع ذلك، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن ثلاثة أيزومرات-GQ1d(d18:1/18:0)، GT1b(d18:1/18:{{30}})، وGT1 (d18:1) /18:0) موجودة بالتأكيد في العينة A3 ويمكن دراستها بشكل أكبر كعلامات جزيئية للبيلة الألبومينية الكبيرة.

3. المواد والأساليب

3.1. معايير الالتحاق بالموضوع

من أجل تطوير الطريقة والتحقق من صحتها، تم تقييم مجموعة فحص لمرضى DM من النوع 2 والأشخاص الأصحاء في دراسة تجريبية مستعرضة. تم تقسيم ما مجموعه 30 مريضًا من مرضى السكري من النوع الثاني الذين يراجعون قسم العيادات الخارجية لأمراض الكلى وقسم العيادات الخارجية لمرض السكري والأمراض الأيضية إلى 3 مجموعات وفقًا لـزلال البول/نسبة الكرياتينين(UACR) على النحو التالي: 10 مرضى يعانون من بيلة ألبومينية طبيعية (A1، محددة بـ UACR <30 مجم / جم)، 10 مرضى يعانون من بيلة ألبومينية دقيقة (A2، UACR 30-300 مجم / جم)، و10 مرضى يعانون من بيلة ألبومينية كبيرة (A3، UACR > 300 مجم / جم) ز). تم أيضًا تسجيل عشرة من الأشخاص الأصحاء المتطابقين مع العمر والجنس (C) الذين يحضرون مكتب الممارس العام لإجراء فحوصات روتينية دون تاريخ معروف لأمراض الكلى وبدون DM (مستبعدة بقيمة HbA1c أقل من أو تساوي 5.6٪) مسجلين أيضًا في هذا يذاكر

كان لدى جميع المرضى المشمولين في الدراسة مدة لا تقل عن 5-عام من مرض السكري، ووظيفة كلوية مستقرة لمدة عامين على الأقل، وتحكم جيد في ضغط الدم (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for خزعة الكلى(نقص بيلة دموية وأسباب أخرى للبيلة البروتينية، لا يوجد انخفاض سريع في معدل الترشيح الكبيبي).

3.2. بيان الأخلاق

أجريت الدراسة وفقًا لإعلان هلسنكي، وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات البحثية بالمؤسسة (مجلس الدراسات الإنسانية - جامعة "فيكتور بابيس" للطب والصيدلة تيميسوارا، رقم 15/12.09.2016 ؛ مستشفى طوارئ المقاطعة، رقم 100/23.11.2016). وافق جميع المرضى والضوابط على المشاركة في الدراسة من خلال التوقيع على استمارة موافقة مستنيرة.

3.3. التقييمات المخبرية

تمت دراسة غانغليوزيد البول لدى 30 مريضًا من النوع 2 من مرض السكري في دراسة تجريبية مقطعية من خلال اختبار مقارن مع 10 عناصر تحكم صحية. تشير المعلمات البيوكيميائية إلى اليوريا والكرياتينين في الدم، والبيلة البروتينية على مدار 24 ساعة، وUACR، ورواسب البول، ومزرعة البول. وكانت جميع المرضى سلبية لالتهابات المسالك البولية. تم الكشف عن تركيبة مخاليط الجانجليوسيد الأصلية من عينات البول التي تم جمعها على مدار 24 ساعة. تم تخزين عينات البول للمرضى والضوابط على المدى القصير عند -20 درجة مئوية وتم إذابتها قبل الفحص.مرض الكلى المزمنتم تعريفه وفقًا لإرشادات KDIGO للتقييم وإدارة أمراض الكلى المزمنة. تم حساب eGFR باستخدامفشل كلوي مزمنصيغة معادلة التعاون في علم الأوبئة (معادلة الكرياتينين CKD-EPI 2009) [16].

3.4. استخراج وتنقية جانغليوزيد

اتبع استخراج جانغليوزيد الطريقة التي طورها سفينيرهولم وفريدمان [17] وتم تعديلها بواسطة فوكليك وآخرون. [18]. لقد سبق أن قمنا بتكييف هذا البروتوكول لاستخراج وتنقية الغانغليوزيدات من سوائل الجسم وتطبيقه على الغانغليوزيدات في السائل النخاعي (CSF). تم وصف الطريقة بالتفصيل في دراستنا السابقة المتعلقة بالتوصيف وتحليل تجزئة غانغليوزيدات CSF بواسطة قياس الطيف الكتلي [19]. باختصار، تم استخلاص الدهون مرتين باستخدام خليط الكلوروفورم (C)/الميثانول (M)/الماء (W) إلى نسبة حجم إجمالي قدرها 1:2:0.75 C/M/W، مع "W" المقابلة إلى البول. لذلك، يحتوي الخليط على 4 مل من C، و8 مل من M، و3 مل من عينة البول. تم شراء الكلوروفورم والميثانول من الدرجة التحليلية من شركة Merck (دارمشتات، ألمانيا) واستخدمت دون مزيد من التنقية. بعد الفصل الكامل بين المراحل، باتباع الإجراءات الموضحة في [19]، تم جمع المرحلة العليا التي تحتوي على الشحميات السفنغولية السكرية القطبية.

تم تحقيق تنقية الغانغليوزيدات الخام المجمعة في عدة خطوات [19]: إزالة مجمعات البروتين والملح المترسبة، يليها الطرد المركزي، وترشيح الهلام في عمود Sephadex G -25 (Sigma-Aldrich، Burlington، MA، USA ) من أجل إزالة الملوثات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وأخيرًا، غسيل الكلى طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ضد الماء. تم استخلاص الغانغليوزيدات تحت ظروف مماثلة من جميع قسامات البول، مما أدى إلى الحصول على خليط A1 (بيلة ألبومينية طبيعية)، A2 (بيلة ألبومينية دقيقة)، A3 (بيلة ألبومينية كبيرة)، وC (تحكم).

3.5. تحضير العينة لقياس الطيف الكتلي

تم تبخير مستخلصات الغانغليوزيد A1 وA2 وA3 وC المنقى لإكمال الجفاف في نظام SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant، Düsseldorf، ألمانيا) مقترنًا بمضخة تفريغ. بالنسبة لفحص مرض التصلب العصبي المتعدد، تم إذابة كل مستخلص جاف في ميثانول نقي لتوليد محلول المخزون وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، تم طرد محاليل المخزون في جهاز طرد مركزي طراز Sigma 2–16 (Sartorius AG، Göttingen، Germany). بالنسبة لتسريب Orbitrap MS، تم الحصول على عينات عمل بتركيز 5 بمول · ميكرولتر −1 في ميثانول نقي عن طريق تخفيف قسامات من محلول المخزون. تم حساب تركيز الجانجليوسيد في المحلول المنقوع لمتوسط ​​وزن جزيئي قدره 2000 جم مول.

3.6. Orbitrap قياس الطيف الكتلي مع nanoESI

تم إجراء تجارب MS على مطياف الكتلة LTQ Orbitrap Velos Pro ™ (Thermo Fisher Scientific، Bremen، Germany) المجهز بمصدر nanoES غير متصل بالإنترنت ES 259 ​​(Thermo Fisher، Bremen، Germany).

الأداة عبارة عن مطياف كتلة هجين يجمع بين نوعين مختلفين من أجهزة تحليل الكتلة ويوفر العديد من المزايا: حساسية ودقة عالية، ونوعية جيدة للبيانات وسرعة التحليل، وإمكانية اكتشاف المكونات الثانوية في الخلائط المعقدة، وانخفاض استهلاك العينة، وتجنب الاستجواب والانتقال من عينة إلى أخرى.

المحلل الأول عبارة عن مصيدة أيون خطية رباعية الضغط مزدوجة الضغط قادرة على عزل أيون بنسبة كتلة إلى شحنة محددة (m/z) وتنشيطه عن طريق وضع الطاقة الحركية في الأيون مع نسبة m/z المحددة بالترتيب للتسبب في التفكك الناجم عن الاصطدام. المحلل الثاني هو Orbitrap، الذي يتكون من قطب كهربائي خارجي أسطواني وقطب داخلي أسطواني، يحبس الأيونات في مدارات دائرية حول القطب الداخلي. يتمتع بقدرة تحليل ممتازة ويوفر إمكانية تسلسل الأنواع الأيونية المعقدة في تجارب MS (MSn) متعددة المراحل من خلال تقنيات التجزئة الفعالة.

تم سحب الشعيرات الدموية البورسليكات (طولها 1 0 سم) باستخدام ساحبة micropipette Sutter p -97 لإنتاج شعيرات كهربائية بالرش الكهربائي بأحجام أطراف 1 0 ميكرومتر وأطوال مستدقة تبلغ 4 مم. تم إدخال حجم 10 ميكرولتر من المحلول بتركيز 5 بمول · ميكرولتر −1 في الميثانول في الجزء الخلفي من الباعث، وتم إدخال سلك بلاتيني بقطر 0.25 مم في المحلول. تم تعديل القيم المحتملة المطبقة على سلك البلاتين والمخروط بشكل دائم لتحقيق التأين الفعال للمكونات. بدأت عملية nanoESI من خلال ضبط المعلمات الآلية على النحو التالي: جهد nanoESI، 0.80 كيلو فولت؛ الجهد المخروطي، 40-60 فولت؛ درجة حرارة الخراب، 80 درجة مئوية؛ مستوى الترددات اللاسلكية لعدسة S، 60%. عززت هذه القيم لمعلمات MS التأين والرذاذ الثابت، وفي الوقت نفسه، قللت من تجزئة المصدر لبقايا Neu5Ac القابلة للتغيير المرتبطة بنواة قليل السكاريد لجزيء الغانغليوزيد.

تم الحصول على جميع أطياف الكتلة (MS وMS الترادفية) في وضع HR، واكتشاف وضع الأيونات السالبة، وضمن نطاق 200–2000 m/z. تم الحصول على عمليات فحص مرض التصلب العصبي المتعدد مع ضبط الدقة على 60.000. تم تشغيل مقياس الطيف الكتلي والتحكم فيه بواسطة LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific، Bremen، Germany)، وتم الحصول على بيانات MS ومعالجتها باستخدام برنامج Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific، Bremen، ألمانيا).

تم إجراء تجارب MS/MS في LTQ بواسطة CID في خلية التصادم باستخدام نقاء الهيليوم 5.0 عند ضغط 50 رطل لكل بوصة مربعة كغاز تصادمي. تم الحصول على عمليات فحص MS/MS بدقة تم ضبطها على 20,000. تم إجراء اختيار الأيونات والتجزئة يدويًا. تم اختيار أيونات السلائف ضمن عرض عزل قدره 1 م / ض وحدة وتم تجزئتها بواسطة HCD باستخدام طاقات الاصطدام المتغيرة ضمن نطاق 30-80 فولت لتعزيز تغطية الأيونات المجزأة.

تمت معالجة TICs وأطياف الكتلة المشتقة من خلال الجمع بين عمليات المسح المتراكمة باستخدام برنامج Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific، Waltham، MA، USA)، والذي يسمح باستخراج الأطياف، بالإضافة إلى تنعيمها وطرحها.

قبل التجارب، تمت معايرة مقياس m/z خارجيًا باستخدام المرجع المخصص المعروف تجاريًا باسم Pierce® ESI Negative Ion Solution من شركة Thermo Scientific (Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). في وضع الأيونات السالبة، قدم هذا المعيار طيفًا بتغطية أيونية عادلة لنطاق m/z الممسوح ضوئيًا في كل من تجارب MS وMS جنبا إلى جنب.

لتحسين ظروف nanoESI MS وMS/MS في وضع الأيونات السالبة، والمقارنة، وتقييم البيانات، تم قياس كسور الغانغليوزيد القياسية التالية، المتوفرة تجاريًا: GM1 (الدماغ البقري)؛ GD1a، GD1b، GT1b، وGQ1b (دماغ الخنازير)؛ وGM3 وGD3 (حليب البقر) من Avanti Polar Lipids (برمنغهام، ألاباما، الولايات المتحدة الأمريكية)، بالإضافة إلى مستخلص الغانغليوزيد الكامل من دماغ الأبقار، والمعروف تجاريًا باسم خليط Cronassial، من أبانو تيرمي (بادوفا، إيطاليا).

3.7. اختصار جانجليوسيدات

بالنسبة لتخصيص الغانغليوزيد، تم تطبيق نظام الاختصار الذي قدمه سفينر هولم [20] في عام 1980، جنبًا إلى جنب مع توصيات عام 1998 الصادرة عن لجنة IUPAC-IUB المعنية بالتسميات الكيميائية الحيوية، [21] على النحو التالي:

لاسير-جال 4Glc 1Cer؛ GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer؛ جنرال موتورز2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; جي دي 2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a أو GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer؛ GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 أو 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 أو 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer؛ nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. تفسير بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد

نظرًا لعدم توفر برامج كمبيوتر مخصصة أو قواعد بيانات أو خدمات تكنولوجيا معلومات أخرى للمساعدة في تفسير فحص الغانغليوزيد وأطياف الكتلة الترادفية حتى الآن، في هذه الدراسة، تم تعيين الأيونات الجزيئية المكتشفة لأنواع الغانغليوزيد عن طريق حساب الكتلة الدقيق وعلى أساس من المعلومات التي حصلنا عليها سابقًا حول هذا النوع من الجليكوسفينجوليبيد ومسارات التخليق الحيوي المعروفة. في تفسير بيانات MS وMS/MS وحسابات الكتلة، ساعدنا المخزون الكبير من أيونات الغانغليوزيد الجزيئية والشظية التي حددناها وميزناها في مختلف الأنسجة والسوائل البشرية حتى الآن باستخدام أساليب MS المتقدمة. تمثل هذه الهياكل قواعد بياناتنا الأصلية، والتي تم تضمينها في دراساتنا المنشورة مسبقًا [12،19،22–31]. الأنواع الجديدة المذكورة في هذا العمل تكمل سجل الغانغليوزيد الموجود لدينا حاليًا.

يتبع تخصيص أيونات تسلسل العمود الفقري قليل السكاريد المتولدة داخل HCD MS/MS التسميات المقبولة عمومًا [24،25].

4 - نتائج

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير نهج يعتمد على HR MS وTrandem MS لتحديد الغانغليوزيد في DKD من خلال اختبار مقارن للمستخلصات البولية من مرضى البول الزلالي المعياري والجزئي والكبير، بالإضافة إلى الضوابط الصحية، التي يتم إجراؤها تحت محلول مماثل. وشروط مفيدة. كان الهدف النهائي لدراستنا هو تحديد التغيرات التي تحدث في تكوين وبنية الغانغليوزيدات الكلوية المعبر عنها في DKD مقابل الضوابط وفي مراحل مختلفة من المرض.

إن الحساسية العالية والاستنساخ والدقة والدقة الشاملة التي توفرها منصة MS المُحسّنة لهذا الغرض أتاحت لنا إثبات أن درجة الانحلال الانسيلي للأنواع المعبر عنها يبدو أنها تلعب دورًا مهمًا في تطور المرض، وهو ما يمثل علامة على DKD ، حتى في مرحلة البيلة الألبومينية الطبيعية لدى مرضى النوع الثاني من مرض السكري. بالإضافة إلى ذلك، تظهر التعديلات الملحوظة في تركيبة Cer أنه، بجانب بنية الجليكان، يمكن أيضًا اعتبار شحنة الدهون بصمة جزيئية لمراحل DKD.

في المرحلة الأكثر تقدمًا من البحث، تم استخدام MS/MS بواسطة HCD للتحليل الهيكلي للأنواع مع دور محتمل للعلامات الحيوية. في حالة العينة A3، وجد أن الأيونات الجزيئية، وفقًا لحساب الكتلة، تتوافق مع GQ1(d18:1/18:0) وGT1(d18:1/18:{{1 0}})، على التوالي، تم عزلها وعرضها للتجزئة في خلية الاصطدام بالأداة. كان الهدف من هذه التجارب هو جمع معلومات حول التكوين الهيكلي التفصيلي للجزيء. أدت ظروف التسلسل الأمثل، ولا سيما نطاق طاقة الاصطدام وضغط الغاز الاصطدامي، إلى حدوث انقسامات محددة في الروابط الجليكوسيدية، مما أدى إلى تكوين أيونات شظية تم اكتشافها كإشارات ذات صلة في أطياف الكتلة الترادفية. تم العثور على العديد من الأيونات التشخيصية لبعض الأيزومرات المتعلقة بتوطين أجزاء Neu5Ac في سلسلة الكربوهيدرات لجزيء الغانغليوزيد. بناءً على هذه الأيونات المتسلسلة ذات المعلومات الهيكلية، اكتشفنا أن GQ1d(d18:1/18:0)، GT1 (d18:1/18:0)، وGT1b(d18:1/18: 0) الأيزومرات موجودة في العينة A3 وترتبط بالبيلة الألبومينية الكبيرة.

تتطلب النتائج التي تم الحصول عليها مزيدًا من التحقق من صحة بعض الفرضيات في الدراسات الطولية التي أجريت على مجموعات أكبر من أجل إثبات وجود علاقة سببية بين تعقيد الغانغليوزيدات المكتشفة في بول المرضى.مرضى DKDوالإصابة الكلوية المبكرة جدًا أثناء مرض السكري من النوع 2، حتى في مرحلة البول الألبوميني الطبيعي. ومع ذلك، فإننا نعتبر أن النتائج الحالية تفتح اتجاهًا بحثيًا نحو دراسة الدور في تطور المرض الذي تلعبه sialylation وO-acetylation وO-fucosylation للغانغليوزيدات، بالإضافة إلى تعديلاتها بواسطة O-GalNAc وCH3COO−. الجانب المفيد الآخر لهذه النتائج هو إمكانية تطوير إجراءات تشخيص DKD المبكر استنادًا إلى تحديد ملامح الغانغليوزيد باستخدام قياس الطيف الكتلي المتقدم.

مراجع

1. غاديريان، س.ب. بلادي موسوي، س.س. دور مرض السكري وارتفاع ضغط الدم في أمراض الكلى المزمنة.جي رن. إنج. السابق.2014, 3, 109–110. [المرجع المتقاطع] [مجلات] 

2. جوهانسن، كوالالمبور؛ تشيرتو، جنرال موتورز؛ فولي، RN؛ جيلبرتسون، دي تي؛ هيرتسوغ، كاليفورنيا؛ إيشاني، أ؛ إسراني، ألاسكا؛ كو، E.؛ تامورا، عضو الكنيست؛ لي، تقرير البيانات السنوي لنظام بيانات الكلى في الولايات المتحدة لعام 2020: وبائيات أمراض الكلى في الولايات المتحدة.أكون. J. ديس الكلى.2021, 77, A7–A8. [المرجع المتقاطع] [مجلات] 

3. لين، واي سي؛ تشانغ، YH. يانغ، سي. وو، دينار كويتي؛ تشو، TS تحديث الفيزيولوجيا المرضية وإدارة مرض الكلى السكري.جيه ميد. مساعد.2018, 117, 662–675. [المرجع المتقاطع] [مجلات] 

4. فالون، ف.؛ طومسون، SC وظيفة الكلى في نماذج مرض السكري: النظام الأنبوبي في الفيزيولوجيا المرضية للكلى السكري.آنو. القس فيزيول.2012, 74, 351–375. [المرجع المتقاطع] 

5. ميلاس، أو. جاداليان، ف.؛ فلاد، أ.؛ دوميتراسكو، V.؛ فيلسيوف، س. جلوهوفشي، سي؛ بوب، ف. بوبيسكو، ر. أورسونيو، S .؛ جيانو، العاصمة؛ وآخرون. ترتبط السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بتلف الخلايا الرجلية والخلل الأنبوبي القريب في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري لدى مرضى داء السكري من النوع 2.ج. دياب. معقد.2020, 34, 107479. [المرجع المتقاطع] 

6. بيتريكا، ل.؛ أورسونيو، S .؛ جاداليان، ف.؛ فلاد، أ.؛ جلوهوفشي، ج؛ دوميتراسكو، V.؛ فلاد، د.؛ جلوهوفشي، سي؛ فيلسيوف، س. بوب، ف. وآخرون. ترتبط مستويات mRNA المرتبطة بالبودوسيت البولية مع خلل في الأنابيب القريبة في اعتلال الكلية السكري المبكر لمرض السكري من النوع 2.ديابيتول. متعب. سيندر.2017, 9, 31–43. [المرجع المتقاطع] 

7. كواك، د. رو، يي؛ كوون، التطوير التنظيمي؛ اهان، ش. سونغ، ج.ه. تشو، YK. كيم، إس جيه؛ تشوي، بك. Jung، KY انخفاضات في الغانغليوزيد GM3 في الكبيبات السكرية التي يسببها الستربتوزوسين في الفئران.علوم الحياة.2003, 72, 1997–2006. [المرجع المتقاطع] 

8. ماسون، إي. ترونسي، L.؛ روجيرو، د.؛ فيرنسبيرجر، ن.؛ لاغارد، م.؛ البواب، سلسلة S. A-Gangliosides تتوسط تأثيرات المنتجات النهائية لعملية السكر المتقدمة على تكاثر خلايا البيريسيت وخلايا مسراق الكبيبة: وسيط مشترك لاعتلال الأوعية الدقيقة في شبكية العين والكلى؟السكري2005, 54, 220–227. [المرجع المتقاطع] 

9. زادور، ز.؛ ديشموخ، جي دي؛ كونكل، ر. رادين، NS؛ Shayman، JA دور تراكم الشحميات السفنغولية السكرية في تضخم الكلى لمرض السكري الناجم عن الستربتوزوسين.جيه كلين. تحقيق.1993, 91, 797–803. [المرجع المتقاطع]

10. إيني، قرص مضغوط؛ بينيسكو، م.؛ أنجيل، أ.؛ نياجو، م. بودو، V.؛ نيكولاي، I. مراقبة اعتلال الكلية السكري عن طريق تعميم جانغليوزيدات.J. المناعي. المناعي.2016, 37, 68–79. [المرجع المتقاطع]