تناول كميات كبيرة من الملح وتأثيره على ميكروبيوم الأمعاء الطبيعي في الفئران البرية

1. مقدمة

يتم استعمار أمعاء الثدييات من قبل مجتمع بكتيري معقد ومتنوع، والذي يخلق مع المضيف علاقة تكافلية دقيقة [1،2]. يمارس هذا المجتمع البكتيري العديد من الوظائف المفيدة للمضيف، بما في ذلك الوظائف الأيضية والمناعية والغذائية [3-7] ويمكن أن يتغير تكوين الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء أثناء الحياة، بما يتماشى مع الاحتياجات المحددة وعلم وظائف الأعضاء للمضيف [1،8، 9]. يتم التوسط في العديد من الوظائف المفيدة للبكتيريا المعززة لصحة الأمعاء عن طريق المستقلبات المشتقة من التخمير اللاهوائي [10-13] ويمكن أن تؤثر ظروف الخلل الحيوي بشكل كبير على صحة المضيف [2،11،14،15]. أدى الاهتمام المتزايد بتأثير نمط الحياة على الصحة إلى زيادة الاهتمام العلمي بمشاركة الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء وآثارها الانتقالية [16،17]. في الواقع، تتشكل الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء من خلال العوامل الخارجية (مثل نمط الحياة والنظام الغذائي والعلاجات الطبية) والعوامل الداخلية (مثل الوراثة المضيفة والأنظمة المناعية والتمثيل الغذائي) [8،18-20]. من المعترف به عمومًا أن العناصر الخارجية يمكن أن تؤدي إلى تأثيرات مؤثرة، مع اعتبار النظام الغذائي أحد العوامل الرئيسية المساهمة في التأثير على تكوين الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء ووظيفتها [1،2،21]. من المعروف أن المكونات الغذائية الغربية، مثل تناول كميات كبيرة من الملح، تؤذي توازن المضيف من خلال التأثير على الجهاز المناعي وتغيير الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء والمرض [18،22-37]. في الكائنات الحية الدقيقة في أمعاء الفئران، يرتبط النظام الغذائي عالي الملح (HSD) بتقليل البكتيريا المعززة للصحة المعروفة باسم منتجي الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) مثل Lactobacillus spp. وBifidobacterium وBlautia وFaecalibaculum [28، 29،38-41]، إلى جانب زيادة وفرة Akkermansia، وهو منتج انتهازي آخر لـ SCFA والذي ثبت أنه يؤثر على مناعة المضيف والمرض في أنظمة نموذجية مختلفة [42،43]. تُستخدم النماذج الحيوانية الفأرية بشكل متكرر لدراسة كيف يمكن للعوامل الغذائية أن تشكل ميكروبات الأمعاء والجهاز المناعي والمرض [29،44-46]. على الرغم من أن استخدام الفئران المختبرية التقليدية (CLM) لا يزال خيارًا صالحًا للعديد من الدراسات، إلا أنه يفشل أحيانًا في ترجمة التطبيقات التي تركز على الميكروبات المعوية بشكل صحيح [47-49]. على سبيل المثال، تبين أن الأبحاث المناعية والتمثيل الغذائي في نماذج الفئران لمرض التهاب الأمعاء (IBD) والسمنة تتنبأ بشكل سيئ بالنتائج الانتقالية لدراسات الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء [50]. قد يكون هذا بسبب العديد من الاختلافات المتأصلة في هذه الأنظمة النموذجية، مثل اختلاف تشريح الأمعاء وعلم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء [16،50]. ومع ذلك، هناك مشكلة أخرى لاستخدام CLM لدراسة التفاعلات المناعية الميكروبية وهي تدجين التركيب البكتيري للأمعاء في CLM، وهو ما ينعكس في تقليل تعقيد ومرونة الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء CLM مقارنة بالفئران البرية [51]. تواجه الحاجة إلى بيئات معقمة وخاضعة للرقابة انخفاضًا في وجود مسببات الأمراض والطفيليات المحتملة، والتي يُعتقد أنها تؤدي بالتالي إلى نظام مناعة أقل "تعليمًا" في CLM مقارنة بالفئران البرية [51-53]. ولمعالجة هذه المشكلة، تم تطوير نموذج الفئران البرية عن طريق نقل الأجنة المشتقة من الفئران C57BL/6 إلى فئران برية للحصول على ميكروبات الأمعاء المشتقة من البرية، للتغلب على المشكلة الانتقالية لدراسات الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء المناعية [54]. أظهرت الدراسات الحديثة التي شملت نموذج الفأر هذا نتائج متفوقة في التنبؤ بالقيمة الانتقالية للعلاجات المناعية التجريبية مقارنة بـ CLM [54،55]. علاوة على ذلك، كانت الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البرية أكثر مقاومة ومرونة للعلاج بالمضادات الحيوية والنظام الغذائي عالي الدهون مقارنة بـ CLM، مقارنة بالحالة الأكثر تعقيدًا عند البشر [54،55]. ومع ذلك، على الرغم من التأثيرات المثبتة لـ HSD على ميكروبات الأمعاء، والجهاز المناعي، ونماذج الأمراض المختلفة في CLM، فإن تأثيرات تناول كميات كبيرة من الملح على ميكروبات الأمعاء الطبيعية المشتقة من البرية غير معروفة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم تأثير HSD على تركيبات النظام البيئي البكتيري المعوي المختلفة والوظائف التنبؤية لـ CLM بالمقارنة مع الفئران البرية.

2. المواد والأساليب

2.1. الحيوانات والنظام الغذائي

تم شراء فئران C57BL / 6 من النوع البري (إناث عمرها 7-8 أسابيع، n=20) من نهر تشارلز وتم إيواؤها في منشأة الحيوانات بجامعة هاسيلت في ظل ظروف موحدة. تم إيواء الفئران البرية (C57BL/6 الخلفية الوراثية، الذكور n=12 والإناث n=11) [54] في منشأة الحيوانات في UHasselt في ظل ظروف موحدة. تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات (ECAE) في جامعة هاسيلت (ID201618A4V1، ID202235). تم إيواء الفئران (4 فئران / قفص) في غرفة يمكن التحكم في درجة حرارتها (21-23 درجة مئوية) مع دورة ضوء / ضوء داكن تبلغ 12:12 ساعة. تم شراء الأنظمة الغذائية النقية التالية من Ssniff (Soest، ألمانيا): 0.5% NaCl/نظام غذائي للتحكم (E15430-04)، و4% NaCl/HSD (E15431-34). بالنسبة لـ HSD، تم تغذية الحيوانات بنسبة 1% من كلوريد الصوديوم في مياه الشرب بالإضافة إلى E15431-34، كما هو موضح في [28]. تم توزيع الفئران CLM بالتساوي بين المجموعة الضابطة (ن=10) وHSD (ن=10). بالنسبة لفئران الهمج، تم أيضًا توزيع الأفراد من الذكور والإناث بالتساوي في المجموعات الغذائية الضابطة وHSD (6 ذكور للتحكم، 6 ذكور لـ HSD، 5 إناث للتحكم، و 6 إناث لـ HSD).

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

2.2. استخراج الحمض النووي

تم إجراء استخراج الحمض النووي الميكروبي كما هو موضح في [28]، باستخدام بروتوكول معدّل لمجموعة QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen، Hilden، ألمانيا). باختصار، تمت إضافة كريات البراز إلى 2- مل إيبندورف الذي يحتوي على 0.5 ملم من الخرز الزجاجي و1.5 مل من المخزن المؤقت للتحلل (ASL) (Qiagen، Hilden، ألمانيا). تم استخدام الضرب بالخرز لإجراء التجانس الميكانيكي للكريات. تم إجراء الاستخراج الكامل وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة (إطالة وقت حضانة بروتيناز K إلى ساعتين عند 70 درجة مئوية). تم تقييم تركيزات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND -1000 (NanoDrop Technologies، Wilmington، DE، USA) وتخزينه عند درجة حرارة −20 ◦C قبل تضخيم الجينات 16S rRNA.

2.3. 16S الرنا الريباسي تضخيم الجينات وتسلسلها

تم تضخيم تسلسل جينات الرنا الريباسي 16S باستخدام تمهيدي محدد لمنطقة V4 (F515/R806)، كما هو موضح سابقًا [56]. باختصار، تم استخدام 25 نانوغرام من الحمض النووي لكل تفاعل PCR (30 ميكرولتر) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix، Roche، Basel، CH، USA) تمسخ أولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، تليها 25 دورة (10 ثوانٍ عند 98 درجة مئوية) C، و20 ثانية عند 55 درجة مئوية، و20 ثانية عند 72 درجة مئوية). تم إجراء التفاعلات في ثلاث نسخ، وتم تجميعها في كل عينة، وتم تنقيتها بواسطة نظام تنظيف قائم على الخرز المغناطيسي (Agencourt AMPure XP، Beckman Coulter، Brea، CA، USA). تم إجراء إعداد المكتبة بواسطة PCR ذو دورة محدودة للحصول على المكتبة المفهرسة باستخدام تقنية Nextera (Nextera XT Index Kit، Illumina، San Diego، CA، USA)، تليها خطوة تنظيف الخرز المغناطيسي AMPure XP الثانية. تم بعد ذلك تطبيع العينات المفهرسة إلى نفس تركيز 4nM، وتم تجميعها وتسلسلها على منصة Illumina MiSeq PE300 مع بروتوكول نهاية مقترن 2 × 300 نقطة أساس وفقًا لبروتوكول الشركة (Illumina، Inc.، San Diego، CA، USA).

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. المعالجة والتحليل الإحصائي لبيانات تسلسل الجينات الرنا الريباسي 16S

تمت معالجة التسلسلات الأولية باستخدام خط أنابيب QIIME 2 [57]. بعد تصفية الطول والجودة (المعلمات الافتراضية)، تمت تصفية القراءات وتخصيصها لوحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) باستخدام DADA2 [58]. تم تنفيذ المهمة التصنيفية بواسطة خوارزمية VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch؛ تم الوصول إليها في 9 نوفمبر 20}22) وقاعدة بيانات Silva v128 (https://www.arb-silva.de) /; تم الوصول إليه في 9 نوفمبر 2{{40}}22). تم بعد ذلك تطبيع جدول ASV عن طريق الخلخلة عند عمق 6.147 بحيث تصل كل عينة إلى الهضبة في نهاية منحنى الخلخلة. تم تقييم تنوع ألفا باستخدام مقياسين مختلفين: ثراء OTUs (الملاحظ)، Chao1، Shannon، Simpson، Inverse Simpson (InvSimpson) الفهارس البيئية. بالنسبة للتنوع التجريبي، تم حساب اختلاف Bray-Curtis وتشابه Jaccard ومقاييس UniFrac الموزونة وغير الموزونة [59] ورسمها بواسطة تحليل الإحداثيات الأساسية (PCoA) لتصور المسافة الحقيقية بين العينات. لتطبيع جدول عدد OTU، تم إجراء الخلخلة على عمق 6305 تسلسلات لكل عينة 100 مرة. تم استخدام الإخراج الذي تم الحصول عليه من مهمة تصنيف OTU، كجدول تصنيف، لطي جدول OTU المقيس إلى جداول لمستويات التصنيف L2 (Phylum)، وL5 (Family)، وL6 (Genus). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام R (https://www.R-project.org/؛ تم الوصول إليه في 25 نوفمبر 2022؛ الإصدار 4.2.0). تم استخدام حزمة R "نباتية" (الإصدار 2.6-4) [60] لإنشاء مقاييس تنوع بيتا لمقارنة الاختلافات التركيبية للمجموعات بواسطة PCoA أو عن طريق تحليل المكون الرئيسي (PCA). تم اختبار الحزم وفصل البيانات عن طريق اختبار التقليب بنسب F الزائفة (وظيفة "أدونيس" في "نباتي"). تم اختبار الفصل من حيث تنوع بيتا بين المجموعات عن طريق التحليل التقلبي متعدد المتغيرات للتباين باستخدام مصفوفات المسافة (PERMANOVA، وظيفة "Adonis" في "نباتي")، في حين تم اختبار الاختلافات في التشتت داخل المجموعات عن طريق اختبار التجانس متعدد المتغيرات لتشتت المجموعات (PERMDISP) وظيفة "betadisper" في "نباتي"). تم استبعاد الأصناف التي لم تكن موجودة في 4 عينات على الأقل من التحليل. تم تقييم الاختلافات من حيث الوفرة النسبية للأصناف أولاً باستخدام اختبار Kruskal-Wallis الأولي بين 4 مجموعات ثم تم تقييمها أيضًا باستخدام اختبار Wilcoxon بين أزواج المقارنة التالية: التحكم في CLM مقابل CLM HSD، التحكم في Wildling مقابل Wildling HSD، التحكم في CLM مقابل التحكم في Wildling، CLM HSD مقابل Wildling HSD. لتقييم الاختلافات التصنيفية بين الهمج وCLM، تم استخدام حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/؛ تم الوصول إليه في 25 نوفمبر 2022) لتمييز السمات الرئيسية على مستوى الجنس [ 61]. تم بعد ذلك عرض نتائج LEfSe على شكل رسم بياني شريطي، مع عتبة درجة التحليل التمييزي الخطي (LDA) أعلى من 1.0. كلما كان ذلك ضروريًا، تم تعديل القيم p للمقارنات المتعددة بواسطة طريقة Benjamini-Hochberg. تم اعتبار معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) أقل من أو يساوي 0.05 ذا دلالة إحصائية: * p أقل من أو يساوي 0.05؛ ** ع أقل من أو يساوي 0.01؛ *** ع أقل من أو يساوي 0.001. تم تحليل الاختلافات الوظيفية بين الميكروبيومات ذات محتوى كلوريد الصوديوم المختلف في الطعام (0.5% و4% محتوى غذائي من كلوريد الصوديوم) بواسطة PICRUSt2، وهي حزمة برامج معلوماتية حيوية للتنبؤ بالمحتوى الوظيفي للميتاجينوم من بيانات تسلسل الجينات rDNA 16 ثانية (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/؛ تم الوصول إليه في 29 نوفمبر 2022؛ تم تطبيق خط أنابيب PICRUSt2 على التسلسلات التمثيلية وجدول الوفرة الخاص بها من DADA2 باستخدام المعلمات القياسية (https://github.com/ picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script؛ تم الوصول إليه في 29 نوفمبر 2022). من مخرجات خط الأنابيب الكامل، تم بناء التنبؤ الميتاجينومي لمسارات KEGG Orthology وMetaCyc كجداول، مع وظائف تنبؤية كصفوف وعينات كأعمدة، واستخدمت لمقارنة وظائف الكائنات الحية الدقيقة المعوية في Wildling وCLM على نظام HSD. تم اختيار الوظائف التنبؤية للمجتمع الميكروبي التي ساهمت بشكل أكبر في التباين بين Wildling و CLM بواسطة المكون الأول (PC1) والثاني (PC2) والمكون الرئيسي الثالث (PC3) لمزيد من التحليل عند استهلاك HSD في النموذجين. تم بعد ذلك تطبيع المصفوفة ذات وفرة الوظيفة التنبؤية، وتحويلها إلى قيم نسبة السجل المركزي (CLR)، وحساب نسبة log2mean (HSD/Control) لكل من Wildling وCLM. وأخيرا، تمت مقارنة نسب log2mean بين المجموعات عن طريق اختبار ويلكوكسون ورسمت كمخطط مسماري. تمت مقارنة الاختلافات بين المجموعات إحصائيًا في برنامج R باستخدام وظائف اختبار Wilcoxon وKruskal-Wallis وقيم p التي تم تعديلها بواسطة طريقة Holm أو Benjamini-Hochberg.

3. النتائج

3.1. يؤثر HSD على التنوع وتكوين CLM و Wildling Gut Microbiota

للتحقيق في تأثير HSD على النظام البيئي الميكروبي للأمعاء المشتق من البرية في الفئران، قمنا بإطعام HSD أو التحكم في الأنظمة الغذائية للفئران البرية وCLM. تم الاحتفاظ بالفئران على الأنظمة الغذائية لمدة أسبوعين وتم التحقيق لاحقًا في تكوين الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البرازية بواسطة تسلسل الجينات 16S RNA من الكريات البرازية التي تم جمعها في اليوم 14 (الشكل 1A). تمشيا مع تقرير سابق، لم يتم اكتشاف فروق قوية من حيث أوزان الجسم بين مجموعات التحكم ومجموعات HSD من CLM والفئران البرية [29]. لتقييم الكائنات الحية الدقيقة المعوية المختلفة بين نموذجي CLM والفئران البرية في الأساس، قمنا بتقدير تنوع ألفا (مؤشرات الملحوظ أو الثراء، Chao1، Shannon، Simpson، وInverse Simpson)، وتنوع بيتا (اختلاف Bray − Curtis)، والتنوع الرئيسي. الاختلافات التصنيفية. تماشيًا مع الدراسات السابقة [54]، تميزت الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البرية بثراء ميكروبي أكبر (الشكل 1ب، جميع مؤشرات تنوع ألفا)، بالإضافة إلى تركيبة ميكروبية مميزة وأكثر تجانسًا من CLM (الشكل 1C، PERMANOVA p {{9} .001 & PERMDISP p=0.0009، Wildling vs. CLM والشكل S1). من حيث التوقيعات الميكروبية ، تميزت الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء CLM والفئران البرية بأصناف بكتيرية مختلفة (الشكل S1). تمشيا مع روسهارت وآخرون. [54]، تنتمي الأصناف البكتيرية من الفئران البرية إلى Intestinomonas، وDesulfovibrio، وTuzzerella، وOscillobacter، وOrodibacter، والجنس الممرض Helicobacter، الذي ميز المظهر غير المستأنس المشتق من البرية لهذا النموذج (الشكل S1).

الشكل 1. تأثير HSD على التركيب البكتيري لـ CLM (n=10/group) وفئران الهمج (n=11 لـ Wildling Ctrl و n=12 لـ Wildling HSD). (أ) التصميم التجريبي. تم تغذية الفئران C57BL/6 CLM أو الهمج على 0.5% NaCl (تحكم، Ctrl) أو ملح عالي 4% NaCl (HSD) وأمعاء مجتمع بكتيرية معوية تتميز بتسلسل جينات الرنا الريباسي 16S. (ب) فهارس للتنوع ألفا للميكروبات المعوية البرازية لـ CLM والهمج؛ من اليسار إلى اليمين، يتم عرض الفهارس التالية: تمت ملاحظتها (ثراء الخارج)، Chao1، شانون، سيمبسون، سيمبسون (معكوس سيمبسون). يتم تقييم الاختلافات بين المجموعات إحصائيًا بواسطة اختبار ويلكوكسون. (C) مؤامرة تحليل الإحداثيات الرئيسية لتنسيق تنوع بيتا من مقياس التباين Bray−Curtis بين CLM مقابل Wildling (أعلى)، والتحكم CLM مقابل CLM HSD (أسفل اليسار)، والتحكم Wildling مقابل Wildling HSD (أسفل اليمين)؛ تم حساب الانفصال والتجانس بين المجموعات بواسطة اختبارات PERMANOVA وPERMDISP على التوالي. * ع أقل من أو يساوي 0.05; ** ع أقل من أو يساوي 0.01; **** ع أقل من أو يساوي 0.0001. الشكل 1. تأثير HSD على التركيب البكتيري لـ CLM (n=10/group) وفئران الهمج (n=11 لـ Wildling Ctrl و n=12 لـ Wildling HSD). (أ) التصميم التجريبي. تم تغذية C57BL / 6 CLM أو الفئران البرية على 0.5٪ NaCl (التحكم، Ctrl) أو الملح العالي 4٪ NaCl (HSD) وأمعاء مجتمع البكتيريا المعوية التي تتميز بتسلسل جينات الرنا الريباسي 16S. (ب) فهارس للتنوع ألفا للميكروبات المعوية البرازية لـ CLM والهمج؛ من اليسار إلى اليمين، يتم عرض الفهارس التالية: تمت ملاحظتها (ثراء الخارج)، Chao1، شانون، سيمبسون، سيمبسون (معكوس سيمبسون). يتم تقييم الاختلافات بين المجموعات إحصائيا عن طريق اختبار ويلكوكسون. (C) مؤامرة تحليل الإحداثيات الرئيسية لتنسيق تنوع بيتا من مقياس التباين Bray−Curtis بين CLM مقابل Wildling (أعلى)، والتحكم CLM مقابل CLM HSD (أسفل اليسار)، والتحكم Wildling مقابل Wildling HSD (أسفل اليمين)؛ تم حساب الانفصال والتجانس بين المجموعات بواسطة اختبارات PERMANOVA وPERMDISP على التوالي. * ع أقل من أو يساوي 0.05؛ ** ع أقل من أو يساوي 0.01؛ **** ع أقل من أو يساوي 0.0001.

تسبب HSD في انخفاض كبير في التنوع البكتيري (الشكل 1B، جميع فهارس تنوع ألفا) بالإضافة إلى تحول ميكروبي كبير في تكوين CLM (الشكل 1C، PERMANOVA p=0.001، PERMDISP p=0 .1، CLM Ctrl مقابل CLM HSD). في المقابل، تميزت الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء لدى الفئران البرية بتنوع أعلى على HSD (الشكل 1B، الفهارس الملحوظة وChao1)، بشكل متباين عن CLM، كما تميزت أيضًا بتحول تكوين ميكروبي أقل وضوحًا على HSD مقارنةً بـ CLM (الشكل 1C، PERMANOVA p=0.001، PERMDISP p=0.5، Wildling Ctrl vs. Wildling HSD).

3.2. التركيب الميكروبي للأمعاء لدى الفئران البرية أكثر مقاومة لـ HSD من CLM

تم تمييز الاختلافات التركيبية البكتيرية بين الهمج و CLM من الناحية التصنيفية. على مستوى الشعبة، كانت الشعب الأكثر وفرة من حيث الوفرة النسبية هي: الطوائف الثابتة (CLM: 52 ± 12%، الهمج: 32 ± 34%)، العصوانيات (CLM: 24 ± 23%، الهمج: 57 ± 19%)، الأكتينوباكتريوتا (CLM: 1{{10}} ± 7%، الهمج: 0.7 ± 1.3%) وVerrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%، الهمج: 0%/لم يتم الكشف عنها) (الشكل 2). أظهر الملف الميكروبي للأمعاء وفرة مختلفة لجميع الشعب المكتشفة في عينات البراز بين الفئران البرية و CLM (الشكل 2). على وجه الخصوص، كانت الكائنات الحية الدقيقة الأساسية phyla Firmicutes، Bacteroidota، وVerrucomicrobiota مختلفة بشكل كبير بين النموذجين (الشكل 2). وبشكل أكثر تحديدًا، على مستوى الأسرة، لوحظت مساهمة مختلفة في الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البرية مقابل CLM بالنسبة لمعظم البكتيريا التي تم الإبلاغ عنها سابقًا على أنها حساسة لـ HSD [28]، بما في ذلك العصيات اللبنية، والمطثية، والبيبتوستريبتوكوكاسيا، والأكرمانسيا (الشكل 3). وتماشياً مع هذا، تم تأكيد اتجاهات مماثلة على مستوى الجنس بين عينات الحيوانات البرية وعينات CLM للأعضاء الرئيسيين في العائلات المذكورة أعلاه؛ من بين هذه، الأكثر تمثيلا كانت العصية اللبنية، روزبوريا، Tuzzerella، Faecalibaculum وAkkermansia (الشكلان S1 و 4). لتوصيف تأثير HSD بشكل أكبر على CLM وتركيبات الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء، قمنا أيضًا بتحليل تأثير النظام الغذائي على مستويات التصنيف المختلفة. على مستوى اللجوء ، تميزت ميكروبات الأمعاء CLM المعالجة بـ HSD باستنزاف كبير للـ Firmicutes وإثراء Verrucomicrobiota (الشكل 2) ، ولكن لم يتأثر أي من الشعب الرئيسية بـ HSD في عينات البراري (الشكل 2). على مستوى الأسرة، تميزت الكائنات الحية الدقيقة في القناة الهضمية CLM باستنزاف كبير للبكتيريا المنتجة لحمض اللاكتيك مثل Lactobacillaceae، وكذلك منتجي SCFA مثل Peptostreptococcaceae وClostridiaceae (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، في CLM التي تغذيها HSD، لاحظنا زيادات في Akkermansiaceae، Sutterellaceae، Defluvitalaceae، وEggerthellaceae (الشكل 3). في المقابل، أثرت HSD على عائلات بكتيرية مختلفة في الكائنات الحية الدقيقة المعوية البرية، من بينها نوعان من Muribaculaceae وPrevotellaceae الوفيرة للغاية، وكلاهما تمت زيادتهما على HSD (الشكل 3). شمل التعديل البكتيري الذي ساهم بشكل كبير في تأثير HSD في CLM زيادة الأجناس Akkermansia و Parasutterella و Enterorhabdus، بالإضافة إلى انخفاض Lactobacillus و Roseburia و Tuzzerella ومجموعة أكسدة (Eubacterium) و Muribaculum و Anaerovorax (الشكل 4). باستثناء Roseburia، لم يتأثر أي من الأجناس المذكورة أعلاه بـ HSD في الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء، في حين أظهر جنس Anaerovorax اتجاهًا معاكسًا لذلك الخاص بـ CLM (الشكل 4).

الشكل 2. تأثير HSD على الشعب البكتيرية من الكائنات الحية الدقيقة المعوية لـ CLM (n=10/group) وفئران الهمج (n=11 لـ Wildling Ctrl و n=12 لـ Wildling HSD). يظهر التركيب الإجمالي من حيث الوفرة النسبية للشُعب من خلال رسم شريطي لكل فرد (أعلى) وboxplot لشُعب محددة (أسفل)؛ تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات عن طريق اختبار ويلكوكسون. * ع أقل من أو يساوي 0.05; ** ع أقل من أو يساوي {{10}}.01; *** ع أقل من أو يساوي 0.001؛ **** ع أقل من أو يساوي 0.0001.

الشكل 3. تأثير استهلاك الأغذية عالية الملح على العائلات البكتيرية لـ CLM (n=10/group) وفئران الهمج (n=11 لـ Wildling Ctrl وn=12 لـ Wildling HSD). يتم تمثيل التكوين الإجمالي على مستوى الأسرة من خلال مخطط شريطي لكل فرد (في الأعلى) وboxplot لعائلات محددة (أسفل)؛ تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات عن طريق اختبار ويلكوكسون. * ع أقل من أو يساوي 0.05; ** ع أقل من أو يساوي {{10}}.01; *** ع أقل من أو يساوي 0.001؛ **** ع أقل من أو يساوي 0.0001.

الشكل 4. التغييرات في الأجناس البكتيرية في CLM (n=10/group) والفئران البرية (n=11 لـ Wildling Ctrl وn=12 لـ Wildling HSD). يتم رسم مساهمة الوفرة النسبية الإجمالية على مستوى الجنس كمؤامرة شريطية دائرية لكل فرد (في الأعلى) وboxplot لأجناس محددة (أسفل)؛ تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات عن طريق اختبار ويلكوكسون. * ع أقل من أو يساوي 0.05; ** ع أقل من أو يساوي 0.01; *** ع أقل من أو يساوي 0.001؛ **** ع أقل من أو يساوي 0.0001.

3.3. يؤثر HSD على الوظائف الميكروبية التنبؤية في CLM ولكن ليس في الفئران البرية

لم يكتشف إخراج PICRUST 2 أي فرق كبير بين وظائف المجتمع الميكروبي لـ Wildling HSD مقابل فئران Wildling غير المعالجة لكل من التعليقات التوضيحية لمسار KEGG Orthology وMetaCyc، مع الاستثناء الوحيد للوظيفة المتزايدة التي يسببها HSD على جين recG لهيليكاز يعتمد على ATP من تقويم العظام KEGG (الشكل 5A). تميز تأثير HSD على CLM بانخفاض كبير في الوظائف التنبؤية لتقويم العظام KEGG، من بينها الجين spp (السكروز -6- الفوسفاتيز) وpfkA (فسفوففركتوكيناز 1)، وكلاهما يشارك في استقلاب النشا والسكروز، والذي يتماشى مع مع النتائج السابقة [28] (الشكل 5A). بالإضافة إلى ذلك، تميزت الكائنات الحية الدقيقة المعوية لـ CLM التي تغذيها HSD بانخفاض الوظائف التنبؤية للجينات المشاركة في نقل الغشاء (feoB لنقل الحديد، بروتين النفاذ AB 2P AB 2، بروتين ربط AB 2A AB 2 ATP)، التخليق الحيوي للجلوتامين (glnA). ، منظم النسخي لعائلة LaCI (lacI، galR) وtransketolase (tktA، tktB) (الشكل 5A). بالنسبة لمسارات MetaCyc، قام HSD بإثراء الكائنات الحية الدقيقة المعوية لـ CLM بشكل كبير من الوظائف التنبؤية المرتبطة بتخفيض النترات (مسار إزالة النتروجين)، وتدهور الجالاكتوز (تدهور D-galactarate، والمسار الفائق لتدهور D-glucarate وD-galactarate)، وتدهور فينيل بروبانوات، والدهون الدهنية. إنقاذ الحمض، وتدهور السكسينات إلى حمض البيوتانويك وتدهور الأحماض الأمينية (تدهور الأمينات العطرية، وتدهور الليوسين) (الشكل 5ب). علاوة على ذلك، تماشيًا مع النتائج السابقة [28]، فقدت الكائنات الحية الدقيقة المعوية HSD في CLM الوظائف التنبؤية للتخليق الحيوي للحمض الأميني (المسار الفائق للتخليق الحيوي لـ L-alanine، والتخليق الحيوي L-lysine)، والتخمر الحمضي المختلط، مع فقدان توقيع جديد إضافي مثل N- تدهور أسيتيل الجلوكوزامين / N- أسيتيل مانوسامين / N - أسيتيل نيورامينات وتدهور ديوكسي ريبونوكليوسيدات (تدهور البيريميدين والبيورين، التخليق الحيوي إينوزين 5 فوسفات III) (الشكل 5 ب).

الشكل 5. تابع.

الشكل 5. تأثير HSD على وظائف الميتاجينوم التنبؤية للأمعاء في CLM (n=10/group) والهمج (n=11 لـ Wildling Ctrl وn=12 لـ Wildling HSD) ميكروبات الأمعاء. تم رسم إخراج PICRUSt2 كمؤامرة مسمارية لتعليق KEGG Orthology (A) ومسارات MetaCyc (B) معبرًا عنها كنسبة log2 المتوسطة لعدد الوظائف التنبؤية بين عينات HSD مقابل Ctrl. تم إجراء جميع المقارنات الإحصائية بين مجموعات Ctrl و HSD بواسطة اختبار ويلكوكسون.

4. المناقشة

من المعروف أن الكائنات الحية الدقيقة المعقدة والمتنوعة في الأمعاء البرية أكثر مرونة في مواجهة بعض نماذج الأمراض [51] والأنظمة الغذائية، مثل تناول كميات كبيرة من الدهون [54،55]. ومع ذلك، لم تقم أي دراسة سابقة بتقييم آثار تناول كميات كبيرة من الصوديوم على ميكروبات الأمعاء المشتقة من البرية. هنا، قمنا بالتحقق لأول مرة من كيفية تأثير HSD على ميكروبات الأمعاء البرية مقارنةً بـ CLM. ومن المثير للاهتمام أن نتائجنا أظهرت أنه بالمقارنة مع CLM، فإن الميكروبيوم البري أكثر مقاومة لاضطرابات HSD على المستويين الوظيفي التركيبي والتنبؤي. من الثابت أن تناول كميات كبيرة من الملح يمكن أن يؤدي إلى تفاقم خطر الإصابة بأمراض مختلفة، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية أو أمراض المناعة الذاتية، عن طريق تغيير تكوين ميكروبيوم الأمعاء والتوازن المناعي [25،29،31،34،63-65]. تمشيا مع التقارير السابقة، تميزت التحولات التي يسببها HSD في الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء في CLM بتغييرات كبيرة في التنوع الميكروبي، والتكوين، والوظائف التنبؤية [28]. انخفضت البكتيريا المعززة للصحة مثل عائلة Peptostreptococcaceae والأجناس Lactobacillus و Roseburia و Tuzzerella من حيث الوفرة النسبية في CLM، في حين زادت Akkermansia بشكل ملحوظ في مجموعات HSDfed. اكتشفنا أيضًا وفرة نسبية أعلى من HSD في Defluvitalaceae وEnterorhabdus وParasutterella. ومن المثير للاهتمام أن جنس Parasutterella هو مكون أساسي في الكائنات الحية الدقيقة المعوية لكل من CLM والبشر، حيث يتصرف كمحلل للسكريات ومنتج للسكسينات [66]. من المعروف أن كلا من Enterorhabdus من عائلة Eggerthellaceae وParasutterella من عائلة Sutterellaceae يتم إثراءهما في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (IBD) [67،68]، مما يشير أيضًا إلى كيفية تأثير HSD على تطور المرض. ومع ذلك، فمن المثير للاهتمام أن الفئران البرية لم تظهر كيانًا مشابهًا للتحولات الميكروبية الناجمة عن HSD، مثل CLM. على الرغم من ذلك، زاد تنوع الهمج بشكل ملحوظ على HSD لمقاييس OTUs وChao1 المرصودة، ولم يشارك سوى عدد قليل من الأصناف في اضطراب HSD في ميكروبات الأمعاء الهمجية، من بينها زيادة في Anaerovorax، إلى جانب انخفاض في Erysipelatoclostridium وRosebria وLachnospiraceae. UCG-004 جنس. كان Roseburia هو التوقيع البكتيري الوحيد المشترك بشكل شائع بين مجموعات HSD مقارنة مع عناصر التحكم المقابلة، على الرغم من أن CLM التي تغذيها HSD لا تزال تتميز بوفرة أعلى من هذه البكتيريا مقارنة بفئران البراري التي تغذيها HSD. تجدر الإشارة إلى أن البكتيريا المنتجة للزبدات مثل روزبوريا أظهرت وفرة نسبية أقل في المرضى الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي [69] ولوحظ أيضًا أن هذا الانخفاض مرتبط بالمخاطر الجينية لمرض التهاب الأمعاء لدى البشر [70]. وهذا يتماشى مع النتائج السابقة، حيث وجد أن التحولات في الأجناس البكتيرية مثل Roseburia أو Lactobacillus مرتبطة بخطر ارتفاع ضغط الدم، وربما يتم تعزيزها عن طريق النظام الغذائي الغربي [71]. ويرتبط التركيب البكتيري للأمعاء أيضًا بحركة الأمعاء وعلم وظائف الأعضاء [72].

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

تمت ملاحظة جنس Anaerovorax سابقًا في الفئران التي تعاني من فسيولوجيا الأمعاء غير الطبيعية وانخفاض الحركة [73]؛ ومع ذلك، فإن إثراء Anaerovorax في HSD للفئران البرية قد يؤدي إلى دور مختلف لهذه الأصناف في سياق توازن الأمعاء والوظيفة المناسبة. تمشيا مع النتائج السابقة، لاحظنا زيادة في جنس Akkermansia في مجموعة HSD من CLM [28]، في حين تم استنفاد الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء لدى الفئران البرية من هذا الجنس، وهو ما يتوافق أيضًا مع الدراسات السابقة حول هذا النموذج [51، 53-55]. على الرغم من أن جنس أكرمانسيا هو بروبيوتيك محتمل بسبب تأثيره الإيجابي على تحسين الملامح المناعية والتمثيل الغذائي للمضيف (على سبيل المثال، في السمنة ومرض السكري من النوع 2) [42،74-77]، إلا أن دور هذا الجنس لا يزال غير واضح بسبب سلبياته. الارتباط مع النتائج السريرية في سرطان القولون والمستقيم [78]، ومرض باركنسون [79،80] ومرضى التصلب المتعدد [81]. تمشيا مع نتائجنا السابقة التي تم الحصول عليها باستخدام مسارات MetaCyc [28]، أظهرت CLM على HSD انخفاض الوظائف الميكروبية التنبؤية المرتبطة باستقلاب النشا والسكروز لتقويم العظام KEGG. ومع ذلك، فإن التحولات الطفيفة في التركيب البكتيري للأمعاء لدى الفئران البرية التي تتغذى على HSD فشلت في إحداث أي اختلافات كبيرة في الوظائف البكتيرية التنبؤية، مما يشير إلى أن الكائنات الحية الدقيقة المعوية المشتقة من الحيوانات البرية والشبكات الأيضية/البيئية أكثر استقرارًا وقد تتكيف بسهولة أكبر مع الكائنات البرية. الاختلافات الغذائية الناجمة عن HSD مقارنة بالنظم الإيكولوجية للأمعاء CLM، الأمر الذي يستدعي المزيد من التحقيق. ومن الجدير بالذكر أيضًا التأثير المحتمل لمجتمع فطريات الأمعاء على شبكة بكتيريا الأمعاء عند الأنظمة الغذائية التفاضلية. وقد اقترحت دراسات سابقة بالفعل كيف أن التفاعلات المحتملة بين البكتيريا والفطريات متورطة في توازن الجهاز المناعي المضيف وتطور المرض [82-85]. في هذا السياق، يكون CLM محدودًا أيضًا بسبب انخفاض تعقيده البكتيري مقارنةً بالفئران البرية، مما قد يعيق إنشاء فطريات أمعاء متنوعة [54]. ستكون الدراسات المستقبلية قادرة على تحديد مساهمة المجتمعات الفطرية المعوية في إعدادات الكائنات الحية الدقيقة المعوية ومناعة المضيف باستخدام نموذج البرية. باختصار، توفر دراستنا بيانات حول كيفية تأثير تناول كميات كبيرة من الصوديوم على النظام البيئي الميكروبي الطبيعي المشتق من البرية مقارنةً بمجتمع بكتيريا الأمعاء المستأنسة من CLM. أظهرت دراستنا أن HSD لا يؤثر على الأصناف البكتيرية والميكروبات المعوية في الفئران البرية بنفس الطريقة التي يؤثر بها على الكائنات الحية الدقيقة المعوية المستأنسة من CLM. يشير هذا الاختلاف، كما ذكر سابقًا بالنسبة للأنظمة الغذائية أو الحالات الأخرى مثل الأنظمة الغذائية عالية الدهون [54،55]، إلى أن هناك حاجة إلى بحث مستقبلي في أنظمة نماذج الفئران الطبيعية لتلخيص وتقدير تأثير التدخلات الغذائية على النظم البيئية المعوية الأكثر تعقيدًا، كما هو الحال في البشر.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي