المواد والأساليب

6. فحوصات الامتصاص الخلوية

تمت مراقبة استيعاب المركبات الكهربائية في الخلايا عن طريق تلطيخ أولاً LEVs و SEVs باستخدام DiI المحب للدهون (MOP-D -3911) (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد معالجة الخلايا بمركبات كهربائية ملطخة لمدة 1 و 3 و 6 و 12 و 24 و 48 ساعة ، تمت إزالة وسط النمو وتم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد (واكو ، اليابان). تمت إضافة Hoechst 33342 (Invitrogen) وحضنت الخلايا لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة لتلطيخ النوى (باللون الأزرق). أخيرًا ، تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 في المائة من ألبومين مصل البقر ، ولوحظ تألق (أحمر وأزرق) تحت مجهر مضان (لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا). تم تحديد وتحليل ثلاثة حقول على الأقل باستخدام برنامج ImageJ.

7. قياس محتوى الميلانين

لتقييم محتوى الميلانين ، تم تلقيح خلايا سرطان الجلد B16BL6 لأول مرة في 24- أطباق جيدة (5 × 104 خلية / بئر) بحجم 500 ميكرولتر. بعد 24 ساعة من الحضانة ، الخلاياعولج بـ 100 نانومتر-مش (سيغما الدريتش ، سانت لويس ، MO) وحده أو 50 ميكرولتر من LEVs و SEVs عند 1 و 5 و 10 ميكروغرام / مل لمدة 48 ساعة. بعد العلاج ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS ثم حضنتها بنسبة 2.5 في المائة من التربسين (Gibco ، Thermo Fisher Scientific) للعزل. تم إذابة كريات الخلية المجهرية في محلول هيدروكسيد الصوديوم 1 ن (Sigma-Aldrich) يحتوي على 1 بالمائة DMSO (Sigma-Aldrich) لمدة ساعة عند 80 درجة. تم نقل محللات الخلية إلى لوحة بئر 96- وتم تحديد محتوى الميلانين عن طريق قياس الامتصاصية عند 405 نانومتر باستخدام علامة إنزيم (BioTek). تم تحديد محتوى الميلانين باستخدام منحنى الميلانين القياسي الذي تم إنشاؤه من محلول الميلانين الاصطناعي 0-100 ميكروغرام / مل (Sigma-Aldrich) (شكل الحويصلات خارج الخلية على النحو التالي). تم حساب محتوى الميلانين بالمقارنة مع الضوابط.

8. مقايسة نشاط التيروزيناز

تم قياس نشاط TYR باستخدام نشاط L-DOPA أوكسيديز. تم تلقيح خلايا B16BL6 في وسط - MEM يحتوي على 100 نانومتر Sigma-Aldrich -MSH (500 ميكرولتر) وتم تربيتها بكثافة 1 × 105 خلية / بئر في 24- ألواح استنبات جيد. بعد معالجة الخلايا التي تحتوي على 50 ميكرولتر من LEVs و SEVs بتركيزات 10 و 50 و 100 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة ، تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وفصلها بنسبة 1 بالمائة Triton X -100 (Sigma-Aldrich). تم تحضين الخلايا المتحللة عند درجة - 80 لمدة 30 دقيقة ثم تم تجميدها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم توضيح العينات الناتجة بالطرد المركزي عند 12 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة ، وبعد ذلك تمت إضافة 2 مجم / مل L-DOPA (Sigma-Aldrich) واحتضانها عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة. ثم تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام علامة إنزيم (BioTek). ثم تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام BioTek.

انقر هنا للحصول علىفوائد Cistanche لتبييض البشرةوما هي آثار Cistanche tubulosa

9. تحليل لطخة ويسترن

تم تحديد مستويات البروتين المرتبطة بالمسار المضاد للميلانين داخل الخلايا عن طريق تحليل البقعة الغربية لمستخلصات الخلية الكاملة. تم تلقيح حجم 5 0 0 ميكرولتر من خلايا سرطان الجلد من الفئران B16BL6 في 24- لوحات جيدة (1 × 105 خلية / بئر). تم فصل الخلايا عن طريق الحضانة في المخزن المؤقت RIPA (Thermo Fisher Scientific) لمدة 20 دقيقة في وجود خليط مثبط الأنزيم البروتيني (Roche ، ألمانيا) وتم معالجتها بـ 50 ميكرولتر من 10 و 50 و 100 ميكروغرام / مل من المركبات الكهربائية لمدة 24 ساعة. تم طرد محللات الخلية عند 17 709 جم لمدة 15 دقيقة وتم تحديد تركيز البروتين في المحللات الناتجة باستخدام مجموعة اختبار BCA (Thermo Fisher Scientific). تم تحميل كميات متساوية من البروتين (10-20 ميكروغرام / عينة) في آبار بولت 4-12 في المائة من المواد الهلامية لـ Bolt (Invitrogen) ونقلها كهربائيًا إلى أغشية PVDF (فلوريد البوليفينيليدين) (GE Healthcare، Chicago، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم غسل الأغشية بمحلول ملحي Tris-buffered يحتوي على 0.2 بالمائة (حجم / حجم) عشرة -20 (TBST) ، مغلقًا باستخدام TBST الذي يحتوي على 5 بالمائة (وزن / حجم) لبن منزوع الدسم (Gibco ، Thermo Fisher Scientific) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ، ثم تحضينها عند 4 درجات في محلول جسم أولي مخفف بنسبة 1 في المائة (وزن / حجم) لبن منزوع الدسم. تم تنفيذ الحضانة بين عشية وضحاها. تشمل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة الأجسام المضادة لـ TRP -1 (1: 1000) ، والأجسام المضادة لـ TRP -2 (1: 1000) ، والأجسام المضادة لـ MITF (1: 1000) من Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة ؛ الأجسام المضادة لـ TYR (1: 500) من سانتا كروز Biotechnology (سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام الجسم المضاد للأكتين - - (1: 500 ؛ سانتا كروز) للتوحيد القياسي على مستوى البروتين. تم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام الجسم المضاد الثانوي المسمى بيروكسيداز الفجل (HRP) من Genetex (إيرفين ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم غسل الأغشية باستخدام TBST واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة مع تخفيف 1: 2000 من الجسم المضاد الثانوي في TBST. تم اكتشاف الإشارة التي تم إنشاؤها بعد غسل الغشاء باستخدام TBST والحضانة باستخدام كاشف اللمعان الكيميائي المحسن (GE Healthcare) باستخدام نظام التصوير الجلدي ImageQuant 350 (GE Healthcare).

10. الكشف بالمجهر الإلكتروني عن إنتاج الميلانين داخل الخلايا

تمت معالجة الخلايا باستخدام LEVs أو SEVs واحتضانها لمدة 48 ساعة. بعد العلاج ، تم إصلاح الخلايا عن طريق الحضانة باستخدام محلول كاكوديلات 200 ملي مولار يحتوي على 8 في المائة من الجلوتارالدهيد و 20 في المائة من بارافورمالدهيد (واكو). بمجرد التجفيف باستخدام الإيثانول ، تم تحضير المقاطع الرقيقة جدًا باستخدام مشراح Leica EM UC7 (Leica) وتم جمعها على 200- شبكة نحاسية شبكية. تم تلطيخ المقاطع بنسبة 1 في المائة من خلات اليورانيل وسيترات الرصاص وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة JEOL JEM 1010 (JEOL) عند 80 كيلو فولت.

مستخلص سيستانش

11. قياس تأثير التبييض باستخدام نموذج بشرة الإنسان

تم استخدام نموذج الجلد البشري derm-me (Tego Science ، سيول ، كوريا) لاختبار تأثير التبييض لـ LEVs. تمت معالجة أنسجة جلد الإنسان بـ 1 0 ميكروغرام / مل من ليف لمدة 7 أيام كعنصر تحكم سلبي. كان تركيز أربوتين 70 ميكروجرام / مل. تم إذابة أنسجة جلد الإنسان في 1 N هيدروكسيد الصوديوم وقياس الامتصاصية عند 405 نانومتر باستخدام علامة إنزيم (BioTek) لتحديد محتوى الميلانين. في اليوم السابع ، تمت مقارنة لون الجلد عن طريق التحليل المجهري لعينات فونتانا - ماسون المصبوغة. بالنسبة لتلطيخ Fontana-Masson ، تم إصلاح عينات الجلد طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة (واكو) ، مقطوعة ، ومدمجة في شمع البارافين. تم بعد ذلك تسخين المقاطع المضمنة بالبارافين في فرن عند 60 درجة لمدة ساعة واحدة حتى تجف. تم بعد ذلك نقع المقاطع ثلاث مرات في زيلين ، ومرتين في 95 بالمائة إيثانول ، ومرتين في إيثانول بنسبة 100 بالمائة ، ثم غسلها بالماء المقطر. تم إجراء تلطيخ Fontana-Masson باستخدام محلول الفضة النشادر عند 56 درجة وغسله بالماء المقطر. تم بعد ذلك تثبيت الشرائح في 0.2 بالمائة من محلول كلوريد الذهب وغمرها في 5 بالمائة من محلول ثيوسلفات الصوديوم عند درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تم تجفيف الشرائح في كحول طازج.

12. التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب على أنها تعني ± SEM. أجرينا تجارب بأربع مجموعات من النشاط ومحتوى الميلانين ونشاط TYR (الشكل التكميلي S3). تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار Dunnett باستخدام GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). ف <الاختلافات ؛="" 0.="" 0="" 5،="" p="" <0.="" 01،="" p="" <0.001="" اعتبرت="" ذات="" دلالة="">

مستخلص سيستانش توبولوسا

مناقشة

على عكس معظم الخلايا حقيقية النواة ، تمتلك النباتات جدارًا خلويًا معقدًا ، مما يشكل حاجزًا مهمًا أمام حركة exosomes. نتيجة لذلك ، تطلق الخلايا النباتية exosomes من خلال سلسلة من الأجسام متعددة الحواف مدمجة في غشاء البلازما. يتم ترسيب المنتجات الإفرازية الصادرة عن إفرازات النبات داخل الفجوة المحيطة بالغشاء البلازمي ؛ عندما تتراكم ، فإنها تولد ضغطًا يسمح للإفراز بعبور حاجز جدار الخلية. نتيجة لذلك ، يمكن إطلاق المواد المفرزة ، بما في ذلك exosomes ، دون الحاجة إلى الطاقة. المركبات الكهربائية المشتقة من النباتات مماثلة في الحجم أو أكبر من exosomes الخلايا الحيوانية التي تحدث بشكل طبيعي وتشبه تلك التي لوحظت في سائل عباد الشمس الخارجي (50-200 نانومتر) وأرابيدوبسيس EVs (50-300 نانومتر). تعتبر كفاءة الامتصاص الخلوي من المحددات الرئيسية للفعالية ، حيث إن أهداف العديد من العوامل العلاجية تقع داخل الخلايا. لذلك ، حددنا التوقيت الأمثل والتركيز الأمثل لامتصاص خلايا الورم الميلانيني ولاحظنا الانتقال السريع لعقاقير LEVs و SEVs إلى خلايا الورم الميلانيني في غضون 12 ساعة.

TYR هو بروتين سكري يحفز تحويل L -tyrosinase إلى L-DOPA ، وهي الخطوة المحددة للمعدل في تخليق الميلانين. يُظهر كل من المركبات الكهربائية تأثيرًا مضادًا للميلانين ، لكن التأثير المضاد للميلانين لهواء العادم المنخفض أكبر بكثير من تأثير SEV.

يتم تنظيم إنتاج الميلانين بواسطة -MSH-MC1R ، ومن المعروف أن تثبيط PKC يقلل من تصبغ الجلد والشعر. ومع ذلك ، تشير العديد من الدراسات الجينية والكيميائية الحيوية والدوائية إلى أن مسار الإشارات -MSH-MC1R هو المحرك الرئيسي لتكوين الميلانين. على الرغم من أن تجاربنا لم تظهر تفاعلًا مباشرًا بين MITF و TYR ، فقد تم إثبات أن LEVs تمنع تكون الميلانين عن طريق تقليل تعبير MITF من خلال مسار MSHMC1R المعتمد على الأشعة فوق البنفسجية ، والذي بدوره يقلل من تعبير TYR ، TRP -1 ، و TRP -2. نحن نفترض أن بروتينات عائلة TRP مرتبطة بشكل غير مباشر ببعضها البعض ، ولكن قد تكون هناك حاجة لمزيد من التجارب لإثبات وجود تفاعل مباشر بينها. علاوة على ذلك ، تُظهر نماذج الجلد البشري المعاد بناؤها أن تخليق الميلانين المستحث بالأشعة فوق البنفسجية ومحتوى الميلانين يتم تثبيتهما بشكل فعال بواسطة LEVs.

Cistanche dulcis

خاتمة

تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن LEVs مرشحة للأدوية الجديدة المضادة للميلانين التي تقلل من تكون الميلانين عن طريق تثبيط التعبير عن البروتينات المرتبطة بالميلانين. أكدت النتائج أن LEVs قللت من MITF وبالتالي خفضت تنظيم TRPs في خلايا سرطان الجلد B16BL6. مثبط levs و arbutin TRY بنسبة 66 في المائة و 67 في المائة على التوالي. انخفض محتوى الميلانين في الجلد المعاد بناؤه المعالج بتهوية العادم المنخفض بنسبة 43 في المائة و 28 في المائة مقارنة بالتحكم السلبي غير المعالج والأربوتين كعنصر تحكم إيجابي ، على التوالي.

بناءً على النتائج المبكرة ، نعتقد أن المركبات الكهربائية المشتقة من النباتات يمكن أن تكون مفيدة كعامل مضاد للميلانين لتطوير مستحضرات التجميل الطبيعية. هناك حاجة إلى مزيد من البحث في المستقبل لتطوير المركبات الكهربائية المشتقة من النباتات كعنصر فعال لتحسين الجلد ومن الضروري إثبات سلامة المركبات الكهربائية المشتقة من النباتات على نماذج جلد الإنسان. تشير نتائجنا إلى أنه يمكن استخدام EV لتقليل الميلانين وبالتالي تفتيح البشرة. ومع ذلك ، قد يكون للمركبة الكهربائية تأثيرات سامة على الجلد ، وينبغي إجراء تجارب أخرى مثل اختبارات الحساسية أو اختبارات أميس.

مراجع

[1] Nosanchuk JD ، Nimrichter L ، Casadevall A ، وآخرون. دور النقل الحويصلي للجزيئات الكبيرة عبر جدران الخلايا في التسبب في الفطريات. Commun Integr Biol. 2008 ؛ 1 (1): 37-39.

[2] Robinson DG، Ding Y، Jiang L. إفراز البروتين غير التقليدي في النباتات: تقييم نقدي. البروتوبلازما. 2016 ؛ 253 (1): 31–43.

[3] Paiva EA. كيف تعبر المنتجات الإفرازية جدار الخلية النباتية ليتم إطلاقها؟ فرضية جديدة تتضمن إجراءات ميكانيكية دورية للبروتوبلاست. آن بوت. 2016 ؛ 117 (4): 533-540.

[4] Hood JL، Scott MJ، Wickline SA. تعظيم الاستقرار الغرواني الخارجي بعد التثقيب الكهربائي. الشرج Biochem. 2014 ؛ 448 (1): 41-49.

[5] Rutter BD، Innes RW. تحمل الحويصلات خارج الخلية المعزولة من الأبوبلاست الورقية بروتينات الاستجابة للإجهاد. نبات فيزيول. 2017 ؛ 173 (1): 728-741.

[6] Luan X و Sansanaphongpricha K و Myers I وآخرون. exosomes الهندسية مثل المنصات النانوية البيولوجية المكررة لتوصيل الأدوية. أكتا فارماكول سين. 2017 ؛ 38 (6): 754-763.

[7] Videira IF، Moura DF، Magina S. آليات تنظم تكون الميلانين. أن براس ديرماتول. 2013 ؛ 88 (1): 76-83.

[8] بارك هاي ، لي جي ، كاباسي إس ، وآخرون. يقلل التطبيق الموضعي لمثبط بروتين كيناز سي من تصبغ الجلد والشعر. J إنفست ديرماتول. 2004 ؛ 122 (1): 159-166.

[9] Yamanishi DT، Graham M، Buckmeier JA، et al. التعبير التفاضلي لجينات بروتين كيناز سي في الخلايا الصباغية البشرية الطبيعية والورم الميلانيني النقيلي. التسرطن. 1991 ؛ 12 (1): 105-109.

[10] Borovansky J ، Riley PA. الميلانين والميلانوزومات: التخليق الحيوي ، والتكوين الحيوي ، والوظائف الفسيولوجية ، والمرضية. هوبوكين ، نيوجيرسي: وايلي بلاكويل ؛ 2011

[11] D'Mello S ، Finlay G ، Baguley B ، وآخرون. مسارات الإشارات في تكون الميلانين. علوم Int J Mol. 2016 ؛ 17 (7): 1-18.