كيف تلعب جليكوسيدات فينيليثانويد ، المكون النشط للكيستانش ، دورًا في الحماية العصبية؟

Xue Gong † a و Yan Xu † b و Kai Renc و Xiaorong Baid و Chunhong Zhanga

نبذة مختصرةفي هذه الدراسة ، عزلنا ثمانيةفينيليثانويدجليكوسيداتمن Paraboea martini لأول مرة وتقييم الآلية الكامنة وراءهماعصابتأثيراتضد الإصابات الناجمة عن H2O 2- في خلايا PC12. تم استخدام طريقة MTS لفحصفينيليثانويدجليكوسيداتلقدرة الحماية. بعد ذلك ، تم استخدام qRT-PCR وتحليل النشاف الغربي لاكتشاف مستويات النسخ لـ HO -1 و GCLC ، التي ينظمها Nrf2. تم استخدام المانع ZnPP لتحليل مشاركة Nrf2 في تعبير HO -1. أظهرت التحليلات أن caleolarioside B و paraboside B و paraboside II نظمت أيضًا تعبير HO -1 ، لكنها لم تظهر أي تأثير واضح على GCLC. خفضت المعالجة المسبقة باستخدام ZnPP بشكل ملحوظاعصابتأثيرات. وهكذا ، فإن جليكوسيدات الفينولثانويد المعزولة من خلايا P. قدمت النتائج دليلاً على أن P. مارتيني قد يكون عاملًا علاجيًا محتملاً لعلاجالتنكس العصبيالأمراض.

تاريخ المقالةتم استلامه في 8 أبريل 2019 وتم قبوله في 30 يوليو 2019

الكلمات الدالةبارابويا مارتينيجليكوسيدات فينيلثانويد؛ آثار اعصاب. بروتوبرفيرين الزنك HO -1

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

آلية التأثير الوقائي للأعصاب لـ Cistanche deserticola ، انقر هنا لمعرفة المزيد

من المعروف أن الإجهاد التأكسدي يلعب دورًا أساسيًا في التسبب في العديد من الأمراض. إنه مرتبط بمسبباتمرض الزهايمر(AD) ، ومرض باركنسون (PD) ، والصرع ، وأمراض أخرى [1-3]. في الوقت الحاضر ، تم إحراز تقدم مستمر في دراسة التسبب في مرض الزهايمر ، والسكري ، وأمراض أخرى. ومع ذلك ، وبسبب المعرفة المحدودة بالآليات الجزيئية الكامنة وراء مرض الزهايمر ، واضطراب الشخصية الرئوية ، وأمراض أخرى ، لم يتم تحقيق استراتيجيات وقائية أو علاجية فعالة لهذه الأمراض [4]. H2O2 هو عنصر مهم لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). ووفقًا لذلك ، فإن إصابة خلايا PC12 المستحثة بـ H2O 2- هي النموذج الأكثر استخدامًا للإجهاد التأكسدي وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات التجريبية للتأثيرات الوقائية العصبية [5]. يعتبر هيم أوكسجيناز 1 (HO -1) ووحدة تحفيز جلوتامات سيستين ليغاز (GCLC) من الإنزيمات الخلوية المضادة للأكسدة المهمة ، ويتم تنظيم كلا الجينين في اتجاه مجرى النهر لعامل الإريثرويد 2 (Nrf2) ، والذي يظهر كعلاج علاجي واعد هدف لحماية الأعصاب [6،7].فينيلثانويدجليكوسيدات، المشتقة من وحدة C -6- C -3 ، تحتوي على العديد من مجموعات هيدروكسيل الفينول ولها أنشطة كبيرة في مضادات الأكسدة ومضادة للشيخوخة. على مدى السنوات القليلة الماضية ، أشارت الدراسات إلى أن العديد من النباتات الطبية تحتوي على جليكوسيدات فينيل إيثانويد التي تظهر نشاطًا كبيرًا كمضاد للأكسدة. على سبيل المثال ، من المعروف أن جليكوسيدات الفينيثانويد المشتقة من Herba cistanche لها تأثيرات وقائية على العجز المعرفي في AD. حققت تلك الدراسة في آلية الحماية المرتبطة باستخدام نموذج الماوس 8 المعرضة للشيخوخة AD (SAMP8). أشارت النتائج إلى أن قدرة جليكوسيدات الفينيثانويد على تخفيف العجز المعرفي في فئران SAMP8 قد تكون مرتبطة بتعزيز اللدونة المشبكية التي تنطوي على عمليات مضادات الأكسدة [8]. في هذه الدراسة ، تم فصل اثنين من جليكوسيدات الفينيثانويد وتنقيتهما من عقدة خشب Tectona grandis (خشب الساج) ؛ أظهرت هذه المركبات تأثيرات مضادة للأكسدة ملحوظة تم تحديدها باستخدام طريقة قياس التيار [9]. علاوة على ذلك ، فإن مركبات جليكوسيد الكافويل فينيليثانويد من Lindernia ruellioides تمارس تأثيرات مضادات الأكسدة المعتمدة على الجرعة وأكسيد الأنيون الخالي من الجذور في المختبر [10]. ترتبط آليات عمل جليكوسيدات الفينيثانويد بتنظيم مسار إشارات Nrf2 / ARE ، والذي يؤثر على تخليق SOD و CAT و GSH-PX وأنزيمات أخرى مضادة للأكسدة [11]. تتوزع عائلة Gesneriaceae ، التي تحتوي على 150 جنسًا وما يقرب من 3700 نوعًا ، بشكل أساسي في المناطق الاستوائية والمعتدلة في شرق وجنوب آسيا وأوقيانوسيا وأمريكا الجنوبية وأفريقيا وجنوب أوروبا والمكسيك [12]. يوجد 54 جنسًا وما يقرب من 463 نوعًا ينتمون إلى Gesneriaceae في الصين. تم الإبلاغ عن أن ما يقرب من 100 نوع لها فعالية طبية ومعظم هذه الأنواع موزعة بشكل رئيسي في مقاطعات جوانجشي وقويتشو [13]. في السنوات الأخيرة ، ازدادت الأبحاث حول نباتات Gesneriaceae تدريجيًا في مناطق مختلفة من العالم ، وتم العثور على بعض المكونات الجديدة ذات الأنشطة الفسيولوجية [14]. ينتمي Paraboea martinii (Levl.) Burtt إلى Parabola (Gesneriaceae) وهو نبات عشبي. استنادًا إلى "سجلات موارد الطب التقليدي الصيني" ، تم تسجيل أن النبات بأكمله يستخدم كدواء. علاوة على ذلك ، يمكن أن تمارس العديد من الأنشطة الدوائية في حالات مثل القيء الدموي ، وذمة ، والدوسنتاريا ، والإصابة الرضحية ، والكسر [15]. أثبت باي ذلكفينيليثانويدجليكوسيداتهي أحد المكونات الكيميائية الرئيسية لنباتات Gesneriaceae [16]. وجد بعض الباحثين ذلك أيضًافينيليثانويدجليكوسيداتhave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 في المائة) من ثمانية جليكوسيدات فينيل بروبانويد بواسطة طريقة تطبيع منطقة ذروة HPLC. على سبيل المثال ، يتم عرض مخططات كروماتوغرافيا للبارابوسيد B و بارابوسيد II في الشكل 1 ، وتم العثور على محتواها النسبي بنسبة 98.23 في المائة و 99.20 في المائة ، على التوالي. تم شراء خط خلايا ورم القواتم الكظرية سيئة التمايز (PC12) من بنك الخلايا في أكاديمية الصين للعلوم (شنغهاي ، الصين). تم شراء وسيط النسر المعدّل (DMEM) ومصل الحصان من Dulbecco من Gibco (Gaithersburg ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) من Thermo Fisher Scientific (Hyclone ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على H2O2 من شركة Tianjin Fu Yu Reagent Co.، Ltd. (تيانجين ، الصين). تم شراء Trizol من Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على مجموعة الكاشف PrimeScript TM RT (الوقت الحقيقي المثالي) من شركة TaKaRa Biotechnology Co. (داليان ، الصين). تم تصنيع مواد أولية لـ HO -1 و GCLC و GAPDH بواسطة Sangon Biotech (شنغهاي ، الصين). تم الحصول على مجموعة فحص تكاثر خلايا CellTiter 96® Aqueous One Solution (MTS) من Promega Corp. (ماديسون ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مثبطات HO -1 zinc protoporphyrin (ZnPP) من شركة Sigma Chemical Co. (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام حاضنة Thermo311 CO2 (Thermo ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Block (Thermo) ، و Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) ، و xCELLigence RTCA DPlus Analyzer و E-Plate 16 (ACEA Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية). .

زراعة الخلايا وعلاجها

نمت خلايا PC12 في DMEM تحتوي على 5 في المائة من FBS و 5 في المائة من مصل الحصان عند 37 درجة في جو مرطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم تقسيم خلايا PC12 إلى ثلاث مجموعات على النحو التالي: مجموعة التحكم ، ومجموعة النموذج ، ومجموعة العلاج. تم إذابة ثمانية جليكوسيدات فينيل بروبانويد في DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

تحديد H2O2

في النموذج ، حددنا التركيز المناسب لـ H2 O2 باستخدام التحليل الخلوي في الوقت الفعلي (RTCA). تم زرع خلايا PC12 في صفيحة ميكروية من لوحة CIM -16 بحجم 100 ميكرولتر ثم حضنت لمدة 12 ساعة عند 37 درجة في جو من 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم تقسيم خلايا PC12 إلى مجموعات تحكم ونموذج. بعد ذلك ، تمت إضافة 10 ميكرولتر H O (50 ، 100 ، 200 ، و 400 ميكرومتر) إلى مجموعات النماذج ، وعولجت مجموعات التحكم بـ 10 ميكرولتر DMEM كامل ، تم إعداده في ثلاثة آبار معقدة. تم وضع اللوحة الإلكترونية 16 في xCELLigence RTCA ، وتم مراقبتها كل 15 دقيقة ، وتم تسجيل النتائج لمدة 32 ساعة. تم تحليل تأثير H2O2 على خلايا PC12 باستخدام برنامج تحليل بيانات xCELLigence RTCA. تم استخدام قيمة مؤشر الخلية (CI) لتحديد تركيز H2O2 الأمثل ومدة العمل.

الاستخراج المركب والعزل

تم فصل الكسور بناءً على قطبيتها باستخدام الطرق الموصوفة مسبقًا. تم استخلاص مسحوق P. martinii (4 كجم) المجفف بالهواء على التوالي ثلاث مرات باستخدام محلول إيثانول مائي بنسبة 75 بالمائة [2 0]. تم بعد ذلك تركيز المستخلصات التي تم الحصول عليها باستخدام مبخر دوار لإزالة الإيثانول ، وتم الحصول على المستخلصات الخام. تم إذابة العينات في ماء منزوع الأيونات ثم استخلاصها على التوالي باستخدام إيثر البترول ، أسيتات الإيثيل ، n- بيوتانول ، والماء. تم تجزئة مستخلص ن-بيوتانول (4 0 0 جم) باستخدام عمود راتينج كبير مسام AB -8 ومحلول إيثانول- H2O2 (0 ، 1 {{47} } و 3 0 و 5 0 و 70 و 95 بالمائة). تم الحصول على ستة كسور (الكسور 1-6) أخيرًا. تعرض الجزآن 3 و 4 للفصل باستخدام عمود MCI مع تدرج تدريجي لـ MeOH-H O (10-100 بالمائة). بعد ذلك ، تم عزل المنتجات باستخدام Sephadex LH -20 مع نسبة 50 بالمائة من MeOH مثل eluent. تم عزل المركبات 1 (41.0 مجم) و 6 (15.6 مجم) من الكسر 3. تم الحصول على المركبات 2 (62.0 مجم) و 3 (34.7 مجم) و 7 (11.0 مجم) و 8 (26.0 مجم) من الكسر 4 باستخدام Sephadex كروماتوغرافيا LH -20 مع 50 بالمائة MeOH باعتباره eluent. تم إجراء العزلات النهائية بواسطة HPLC شبه جاهز ، وعكس الطور (Merck LiChrosorb ، RP -18 ، RP -18 ، 250 × 10 مم) مع 50 بالمائة من MeOH واكتشاف الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر لإنتاج مركبات 4 (39.0 مجم) و 5 (9.0 مجم) [20].

فحص جدوى الخلية

تم زرع خلايا PC12 في 96- ألواح بئر بكثافة 2 × 1 {{1 0} 4 خلايا / بئر بحجم نهائي يبلغ 1 0 0 ميكرولتر . تم تحضين خلايا PC12 عند 37 درجة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة. بعد ذلك ، تمت معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من المستخلصات الخام (0. 025 ، 0.05 ، 0.1 ، 0.2 ، و 0.4 مجم / مل) والمركبات 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 و 8 بتركيزات خمسة (3.125 ، 6.25 ، 12.5 ، 25 ، و 50 ميكرومتر). بعد المعالجة لمدة 24 ساعة ، تم تحديد قابلية بقاء الخلية بواسطة فحوصات MTS. تم تحضين خلايا PC12 مسبقًا مع أو بدون مثبط H O -1 بدون ZnPP (15 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة ، ثم حضنت مع أو بدون caleolarioside B و paraboside B و paraboside II (3.125 ميكرومتر) لمدة 12 ساعة ، وأخيراً حضنت مع 400 ميكرومتر H2O2 لمدة 6 ساعات أخرى. بعد العلاج ، تم تحديد عدد الخلايا الباقية بواسطة مقايسة MTS [6].

التأثيرات الوقائية للمستخلصات الخام والمركبات الأحادية على خلايا PC12 المعالجة بـ H2O {{1}

تمت زراعة الخلايا في {0} صفيحة بئر بحجم نهائي قدره 1 0 0 ميكرولتر. تمت إضافة التخفيفات التسلسلية للمستخلصات الخام (0. 0 25 ، 0.05 ، 0.1 ، 0.2 ، و 0.4 مجم / مل) إلى المجموعة المعالجة. بعد المعالجة لمدة 12 ساعة ، تمت إضافة 400 ميكرومتر من محلول H O (التركيز الأمثل) إلى المجموعة المعالجة ومجموعة H O لكل بئر لمدة 6 ساعات. ثم تمت إضافة محلول MTS إلى كل بئر ، وتم تحضين الألواح لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. تم تأرجح الألواح بسرعة منخفضة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة حتى يتم إذابة كل البلورات تمامًا. تم تحديد حماية الخلية بناءً على نتائج اختبار MTS وفقًا لـ 2204 X. GONG ET AL. تم التنزيل من https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 بواسطة ضيف في 27 أغسطس 2021 التعليمات. تم تحديد الكثافة الضوئية بطول موجة امتصاص يبلغ 490 نانومتر. قمنا أيضًا بتتبع نشاط المركبات 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 المعزولة عن الكسور 3 و 4. التخفيفات التسلسلية للمركبات 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 تمت إضافة (3.125 و 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر) إلى المجموعة المعالجة لتحديد آثارها الوقائية على خلايا PC12 المستحثة H2O 2-.

PCR في الوقت الحقيقي الكمي (qRT-PCR)

تم حصاد خلايا PC12 في 12 ساعة بعد العلاج بـ 3.125 ميكرومتر من caleolarioside B و paraboside B و paraboside II. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف TRIzol ، وتم نسخ أجزاء من إجمالي الحمض النووي الريبي بشكل عكسي باستخدام مجموعة Primescript RT Master Kit وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام البادئات التالية للتجارب وفقًا لتقرير سابق [21]. HO -1: إعادة توجيه 5 ′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG -3 ′ ، عكس 5 ′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA -3 ′ ؛ GCLC: إعادة توجيه 5 ′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC -3 ′ ، عكس 5 ′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC -3 ′ ؛ GAPDH: إعادة توجيه 5′-AAGCTGTCATCAACGGGAAAC -3 ′ ، عكس 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG -3 ′. ثم تم تضخيم قسامات من cDNAs التي تم الحصول عليها بواسطة PCR. كانت ظروف التفاعل على النحو التالي: تمسخ أولي عند 95 درجة (30 ثانية) ، تليها 40 دورة عند 95 درجة (5 ثوان) ، 60 درجة (34 ثانية) ، و 72 درجة (35 ثانية). تم اختبار جميع البادئات وتم الكشف عن إشارة الفلورسنت FL ؛ بعد ذلك ، تم حساب قيمة △ Ct وتمت مقارنة القيم النسبية مع تلك الخاصة بمجموعة التحكم باستخدام المعادلة التالية: △ Ct=Ct (عينة) - Ct (تحكم داخلي) ، △△ Ct {{36} } △ Ct (عينة) - △ Ct (غير معالج) ، وتغيير الطية=2 - △△ Ct. تم استخدام Glyceraldehyde -3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH) كعنصر تحكم داخلي.

استخلاص البروتين

تم زرع خلايا PC12 على أطباق 100- مم عند 1 × 107 خلية / طبق. بعد التعلق ، عولجت الخلايا على التوالي بـ caleolarioside B و paraboside B و paraboside II (3.125 ميكرومتر) لمدة 12 ساعة. ثم تمت إزالة الجليكوسيدات ، وحضنت الخلايا مع H O لمدة 6 ساعات أخرى. بعد الحضانة ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وكشطها من الأطباق باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. تم طرد متجانسات الخلية عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. بعد العلاج ، تم استخراج البروتينات الخلوية باستخدام محلول تحلل خلايا Beyotime RIPA مع 1 ملي مولار PMSF وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بالإضافة إلى ذلك ، تم عزل البروتينات السيتوبلازمية والنووية كما هو موصوف في بروتوكول مجموعة استخراج بيوتايم النووي والهيولي. تم الكشف عن تركيزات البروتين في العينات باستخدام مجموعة فحص بروتين Beyotime BCA ، وتم تخزين جميع العينات عند -80 درجة لتحليل النشاف الغربي [6].

تحليل لطخة غربية

تم إجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE بعد الاستخراج وتمسخ البروتين الكلي من مجموعات مختلفة. بعد الرحلان الكهربائي ، تم نقل البروتين إلى أغشية PVDF ، والتي تم حظرها بعد ذلك باستخدام مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة لمدة 4 ساعات. بعد الغسل ، الجسم المضاد الأولي (الجسم المضاد متعدد الأضلاع للأرنب GAPDH (1:10 ، 000 التخفيف) ، الجسم المضاد متعدد الأضلاع للأرنب HO -1 (تخفيف 1: 1000) ، أو الجسم المضاد متعدد النسيلة الأرانب GCLC (تخفيف 1: 1000) تمت إضافته إلى الأغشية التي تم تحضينها طوال الليل عند 4 درجات.في اليوم التالي ، تم غسل أغشية PVDF ثلاث مرات في TTBS. بعد ذلك ، تم وضع الجسم المضاد الثانوي (تقارب الماعز النقي المضاد للأرنب IgG (تخفيف 1: 1000) المسمى بالفجل تمت إضافة البيروكسيداز إلى الأغشية ، والتي تم تحضينها بعد ذلك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.تم غسل أغشية PVDF وتعريضها لكاشف الكشف عن اللمعان الكيميائي ECL للإشارة إلى التعرض على فيلم الأشعة السينية ، والذي تم بعد ذلك تثبيته وفحصه [22].

تحليل احصائي

تم تحليل البيانات باستخدام SPSS 19. 0 ، وعرضت النتائج كوسيلة مع الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة. تم اعتبار قيم p <0. 05="" للإشارة="" إلى="" اختلافات="" ذات="" دلالة="">

نتائج إنشاء نموذج H2O2

كما هو مبين في الشكل 2 ، لم يتسبب H O عند 50 و 100 و 200 ميكرومتر في المستوى المناسب لموت الخلية. ومع ذلك ، فإن 400 ميكرومتر من H2O2 تعمل على خلايا PC12 في غضون 2-6 ساعات ، ويميل الضرر التأكسدي للخلايا إلى الاستقرار. لذلك ، اعتبرنا أن الحث باستخدام H O بتركيز 400 ميكرومتر لمدة 6 ساعات كان مناسبًا لمحاكاة الإصابة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي لخلايا PC12.

التأثيرات الوقائية للمستخلصات الخام على خلايا PC12 المعالجة بـ H2O2

بالمقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة نماذج H2O2 (الشكل 3) ، خلاصة n- بيوتانول بتركيزات 0. 0 5 ، 0. 1 ، {{1 0} } .2 و 0. 4 ملغ / مل تحسن بشكل ملحوظ الضرر التأكسدي لخلايا PC12 الناجم عن H2O2 (p <0. 0="" 5)="" بطريقة="" تعتمد="" على="" التركيز.="" تشير="" هذه="" البيانات="" إلى="" أن="" جزء="" n-="" بيوتانول="" يحتوي="" على="" نشاط="" وقائي="" أقوى.="" ومع="" ذلك="" ،="" أظهرت="" مستخلصات="" الأثير="" البترولي="" وخلات="" الإيثيل="" نشاطًا="" وقائيًا="" فقط="" بتركيزات="" عالية="" (الأثير="" البترولي:="" 0.="" 1="" و="" 0.="" 2="" مجم="" مل="" ،="" ف=""><0. {{31}="" }="" 5="" ؛="" أسيتات="" الإيثيل:="" 0.2="" و="" 0.4="" ملغم="" مل="" ،="" ف=""><0.05). علاوة="" على="" ذلك="" ،="" لم="" تظهر="" تراكيز="" مختلفة="" من="" مستخلصات="" الطور="" المائي="" أي="" آثار="" وقائية="" (p=""> 0.05). علاوة على ذلك ، أضفنا بيانات من دراسة تحقق باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y (SH-SY5Y) في الملف التكميلي. أدى العلاج بـ 250 ميكرومتر H O إلى انخفاض صلاحية الخلية ؛ ومع ذلك ، خففت معالجة caleolarioside B و paraboside B و paraboside II (3.125 و 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر) بشكل كبير من موت الخلايا SH-SY5Y. أثبتت نتائج التجربة أن الكاليولاريوزيد B و paraboside B و paraboside II يحمي خلايا SHSY5Y من H2O 2- يسبب إصابة الخلايا.

تراكيب المركبات المعزولة من جزء n- بيوتانول

للتأكد من أن مستخلص n- بيوتانول يحتوي على مكونات نشطة ، قمنا بتجزئة ثمانية مركبات من الاستخراج. تم تحديد هياكل المركبات 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 من خلال بيانات طيفية مختلفة (1 H-NMR و 13 C-NMR و ESI-MS) بناءً على مقارنات مع البيانات المنشورة لبارابوسيد أ و paraboside B و paraboside I و paraboside II و paraboside III و nuomioside A و caleolarioside B و isonuomioside A على التوالي [2 0]. على سبيل المثال ، كانت البيانات الخاصة ببارابوسيد ب كما يلي: صمغ بني ؛ ½ 2 0 D −55.7 (ج 0.05 ، CH3OH) [20] ؛ UVMeOH max nm (logε): 220 (3.61) ، 291 (3.54) ، 330 (3.66) [20] ؛ IRKBr أقصى سم − 1: 3392 ، 2943 ، 2885 ، 1699 ، 1683 ، 1606 ، 1521 ، 1361 ، 1282 ، 1163 ، 1114 ، 1039 ، 995 ، 817 سم − 1 [20] ؛ ل 1 H و 13 C NMR البيانات التفصيلية الطيفية الموضحة في المرجع 20 ؛ HR-ESI-MS (سلبي) m / z 741.2231 [MH] - (calcd. for C33H41O19، 741.2242) [20]. كانت البيانات الخاصة ببارابوسيد II كالتالي: مساحيق amor phous ؛ ½ 20 D −80.5 (ج 0.05 ، CH3OH) [20] ؛ UVMeOH max nm (logε): 229 (3.74) ، 322 (3.73) [20] ؛ IRKBr أقصى سم − 1: 3419 ، 1699 ، 1625 ، 1596 ، 1515 ، 1456 ، 1419 ، 1263 ، 1159 ، 1139 ، 1068 ، 1022 ، 808 سم − 1 [20] ؛ ل 1 H و 13 C NMR البيانات التفصيلية الطيفية الموضحة في المرجع 20 ؛ ESI-MS (سلبي) m / z 637

التأثيرات الوقائية للمركبات المعزولة ضد السمية المستحثة H2 O 2- في خلايا PC12

تم استخدام فحوصات MTS للتحقيق في تأثير المركبات المعزولة على صلاحية خلايا PC12 المعرضة للسمية المستحثة H2O 2-. كما هو موضح في الشكل 5 ، بالمقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة الضابطة ، تمت معالجة خلايا PC12 مسبقًا بخمسة تركيزات مختلفة من caleolarioside B ، أو بارابوسيد B ، أو بارابوسيد II ، أو بارابوسيد A (3.125 ، و 6.25 ، و 12.5 ، و 25 ، و 5 0 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في صلاحية الخلية (P> 0.05). وبالتالي ، فإن المعالجة المسبقة لخلايا PC12 باستخدام caleolarioside B و paraboside B و paraboside II لم ينتج عنها سمية خلوية. كما هو مبين في الشكل 6 ، أدى 400 ميكرومتر من H2O2 إلى انخفاض كبير في صلاحية الخلية مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة. علاوة على ذلك ، زادت صلاحية الخلية لخلايا PC12 المعالجة بـ H2O 2- بشكل ملحوظ بعد المعالجة المسبقة لخلايا PC12 بتركيزات مختلفة من caleolarioside B و paraboside B و paraboside II ؛ علاوة على ذلك ، كانت صلاحية الخلية هي أعلى علاج تالي مع 50 ميكرومتر من caleolarioside B و 50 ميكرومتر من بارابوسيد B و 12.5 ميكرومتر من بارابوسيد II. لم تظهر المركبات الخمسة الأخرى أي تأثيرات وقائية كبيرة على خلايا PC12 المعالجة بـ H2O 2-. لتوضيح هذه النتيجة ، نناقش أحدها كمثال ، بينما لم يتم وصف الآخرين في المخطوطة.

مستويات النسخ لـ HO -1 و GCLC

اختبرنا بعد ذلك مستويات النسخ لـ HO -1 و GCLC في خلايا PC12 المعالجة بـ caleolarioside B و paraboside B و paraboside II. تم جمع إجمالي الرنا المرسال من خلايا PC12 المعالجة وغير المعالجة لمدة 12 ساعة ، ثم تعرض لتحليل التعبير بواسطة qRT-PCR. كما هو موضح في الشكل 7 (أ ، ج ، هـ) ، زادت مستويات النسخ من H O -1 بشكل ملحوظ بعد

تمت معالجة خلايا PC12 بالتركيزات المحددة من caleolarioside B و paraboside B و paraboside II لمدة 12 ساعة (p <0. {{1="" 0}="" 5).="" كما="" هو="" مبين="" في="" الشكل="" 7="" (ب)="" ،="" زادت="" مستويات="" النسخ="" من="" gclc="" بشكل="" ملحوظ="" في="" خلايا="" pc12="" المعالجة="" مسبقًا="" بالتركيزات="" المشار="" إليها="" من="" caleolarioside="" b="" لمدة="" 12="" ساعة.="" ومع="" ذلك="" ،="" انخفضت="" مستويات="" gclc="" في="" خلايا="" pc12="" المعالجة="" مسبقًا="" باستخدام="" بارابوسيد="" b="" لمدة="" 12="" ساعة="" بشكل="" ملحوظ="" مقارنة="" بتلك="" الموجودة="" في="" مجموعة="" النموذج="" (p=""><0.05 ؛="" الشكل="" 7="" (د)).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" مع="" علاج="" بارابوسيد="" ii="" ،="" لم="" تكن="" مستويات="" gclc="" في="" خلايا="" pc12="" مختلفة="" بشكل="" كبير="" مقارنة="" بتلك="" الموجودة="" في="" مجموعة="" النموذج="" (p=""> 0.05 ؛ الشكل 7 (و)).

التعبير عن HO -1 و GCLC

HO {0} و GCLC هما من الإنزيمات الخلوية الهامة المضادة للأكسدة ، وكلاهما من الجينات المصب الخاضعة للتنظيم Nrf 2-. كما لوحظ التعبير البروتيني لـ HO -1 و GCLC بعد العلاج [6]. يوضح الشكل 8 مستويات البروتين لـ H O -1 و GCLC في خلايا PC12 بعد العلاج بـ 400 ميكرومتر من H2O2 ؛ أشارت النتائج إلى أن شدة الفلورسنت FL لـ H O -1 في مجموعات caleolarioside B و paraboside B كانت أكبر من تلك الموجودة في المجموعات المعالجة H2O 2- (الشكل 8 (أ ، ج)). ومع ذلك ، لم يتم تغيير تعبير GCLC بشكل كبير بواسطة المركبات ، باستثناء caleolarioside B (الشكل 8 (ب)). بعد ذلك ، تم استخدام المثبطات الكيميائية لـ HO -1 لإجراء مزيد من التقييم لأدوار إنزيمات مضادات الأكسدة في تنظيم التأثيرات الوقائية التي يمارسها الكالولاريوزيد B أو بارابوسيد B أو بارابوسيد II ضد H2O 2- السمية الخلوية المستحثة. Caleolarioside B و paraboside B و paraboside II (3.125 ميكرومتر) منعت H2O 2- السمية الخلوية ، ولكن تم عكس هذه التأثيرات الوقائية بواسطة HO -1 مثبط ZnPP (p <0.01) عند="" 15="" ميكرومتر="" (الشكل="" 8)="">

مناقشة

شيخوخة السكان هي مشكلة عالمية خطيرة. ترتبط العديد من الأمراض بالشيخوخة ، مثل الزهايمر والشلل الرعاش ، والتي تشكل تهديدات خطيرة للصحة العامة. برز مرض الزهايمر والسكري كثالث أكثر الأمراض فتكًا على مستوى العالم ، بعد أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان. لذلك ، أصبح التنكس العصبي موضوع بحث ملح في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، فإن التسبب في الإصابة بمرض الزهايمر و PD ، والأمراض التنكسية العصبية للجهاز العصبي المركزي ، لا يزال غير واضح حتى الآن. علاوة على ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الأدوية التي يمكن أن تعالج بفعالية مرض الزهايمر أو شلل الرعاش بسبب آلياتها المسببة للأمراض المعقدة [23]. أظهرت الدراسات السابقة أن أنواع الأكسجين التفاعلية ، مثل الأنيون الفائق (O2−) و H2O2 ، هي العوامل الرئيسية التي تسهم في الإصابة بأمراض التنكس العصبي. تشمل التغيرات المرضية خلال PD تنكس الخلايا العصبية وموت المادة السوداء والدوبامين المخطط [24،25]. وفقًا لذلك ، من المهم تطوير عقاقير فعالة مضادة للأكسدة لعلاج شلل الرعاش ، وقد أصبح اكتشاف هذا الدواء اتجاهًا بحثيًا مهمًا [26]. حاليًا ، يبدو أن مسار إشارات Nrf2 / ARE هو أهم مسار إجهاد مضاد للأكسدة داخلي المنشأ [27]. تقع المناطق في المناطق المحيطة 5′ من الجينات ، مثل HO -1 و GCLC [28،29]. HO -1 و GCLC هي جينات مرتبطة بـ Nrf 2- والتي يتم تنظيمها في اتجاه مجرى هذا البروتين [6]. يمكن أن تؤثر المناطق المصابة في وقت لاحق على مستويات مضادات الأكسدة وتنشط التعبير المصب لـ HO -1 والجينات الوقائية الأخرى ، والتي يمكن أن تعزز أنشطة حماية الخلايا [30،31]. علاوة على ذلك ، أشارت النتائج إلى أن التأثيرات الوقائية للريسفيراترول ضد السمية المستحثة 1-42- في خلايا PC12 تحدث من خلال تنظيم تعبير HO -1 عبر تنشيط مسار الإشارات داخل الخلايا Nrf2 [32].

تعد خلايا PC12 نموذجًا مقبولًا للخلايا العصبية وتستخدم على نطاق واسع في دراسات التأثير الوقائي للأعصاب [33]. يمكن أن يمر H2O2 بسهولة عبر غشاء الخلية ويتحد مع الحديد لتكوين جذور حرة عالية النشاط ، مما يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي وإصابة الخلية [34]. يعتبر H2O2 أحد أنواع ROS المهمة ، ويتم تكوين الجذور الحرة بسهولة وثباتها نسبيًا ، وبالتالي ، يتم استخدامها عادةً لإنشاء نموذج الإجهاد التأكسدي باستخدام خلايا PC12 [5]. في هذه الدراسة ، تسببت المعالجة المسبقة لخلايا PC12 بتركيزات غير سامة للخلايا المحمية لمستخلص النبات من H2O 2- في إحداث سمية خلوية عن طريق تقليل إنتاج ROS. تحتوي جليكوسيدات الفينيثانويد على العديد من مجموعات الهيدروكسيل الفينولية التي لها أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للشيخوخة. في هذه الدراسة ، وجدنا أن استخراج n- بيوتانول أنتج حماية أفضل من كسور القطبية الأخرى (الشكل 3). وبالتالي ، قمنا بفحص الأنشطة الوقائية لثمانية مركبات معزولة عن جزء n- بيوتانول. أظهرت النتائج لأول مرة أن الشكل 8. تحليل مستويات البروتين HO -1 و GCLC على خلايا PC12. (أ) تم استخدام تحليل النشاف الغربي للتعبير عن HO -1 و GCLC و GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. (ب) تحليل البروتين GCLC لتحليل اللطخة الغربية. (ج) تحليل اللطخة الغربية HO {{2 0} تعبير البروتين. (د) يقلل HO -1 المانع ZnPP من تأثير الحماية العصبية. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SD ، n=3. *** p <0. 0="" 0="" 1="" مقابل="" مجموعة="" التحكم="" ؛="" #p=""><0. 0="" 5="" مقابل="" مجموعة="" h2o2="" (بدون="" معالجة="" znpp)="" ،="" ##="" p=""><0.01 مقابل="" مجموعة="" h2o2="" (بدون="" معالجة="" znpp)="" ،="" ###="" p=""><0.001 مقابل="" مجموعة="" h2o2="" (بدون="" znpp="" يعالج)؛="" و="" p=""><0.01 ،="" مقابل="" مجموعة="" h2o2="" (مع="" معالجة="" znpp)="" ،="" و="" &="" p=""><0.001 ،="" مقابل="" مجموعة="" h2o2="" (مع="" معالجة="" znpp).="" (المجموعة="" الضابطة="" ؛="" المجموعة="" النموذجية:="" h2o2="" ؛="" المجموعة="" السلبية="" znpp:="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2="" ،="" paraboside="" b="" plus="" h2o2="" ،="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2="" ؛="" znpp="" المجموعة="" الإيجابية:="" znpp="" plus="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2،="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2،="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2،="" znpp="" plus="" زائد="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" وآخرون.="" تم="" تنزيله="" بواسطة="" ضيف="" في="" 27="" أغسطس="" 2021="" ،="" كل="" من="" كالولاريوزيد="" b="" و="" paraboside="" b="" و="" paraboside="" ii="" لهما="" تأثيرات="" وقائية="" كبيرة="" ضد="" الضرر="" التأكسدي="" الذي="" يسببه="" h2o="" 2-="" في="" خلايا="" pc12.="" أشارت="" النتائج="" أيضًا="" إلى="" أن="" علاج="" h2o2="" تسبب="" في="" إصابة="" خلايا="" pc12="" كبيرة="" وقلل="" من="" قابلية="" الخلية="" للحياة="" ،="" في="" حين="" أن="" علاج="" caleolarioside="" b="" و="" paraboside="" b="" و="" paraboside="" ii="" خفف="" بشكل="" كبير="" من="" هذه="" التأثيرات="" (الشكل="" 6).="" أفادت="" دراسة="" سابقة="" أن="" مسار="" nrf2="" are="" هو="" أحد="" أهم="" مسارات="" مضادات="" الأكسدة="" الذاتية="" ،="" ويمكنه="" تنظيم="" التعبير="" عن="" علامات="" المصب="" ،="" مثل="" ho="" -1="" ،="" لحماية="" الخلايا="" [7].="" أظهرت="" نتائج="" qrt-pcr="" وتحليلات="" النشاف="" الغربي="" أن="" caleolarioside="" b="" و="" paraboside="" b="" و="" paraboside="" ii="" عززت="" بشكل="" كبير="" مستويات="" h="" o="" -1.="" ومع="" ذلك="" ،="" زادت="" مستويات="" النسخ="" من="" gclc="" بشكل="" ملحوظ="" في="" خلايا="" pc12="" المعالجة="" بـ="" caleolarioside="" b="" ولكنها="" انخفضت="" في="" تلك="" المعالجة="" مسبقًا="" باستخدام="" بارابوسيد="" b="" مقارنة="" بتلك="" الموجودة="" في="" المجموعة="" النموذجية.="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" لم="" يغير="" أرابينوسايد="" الثاني="" تعبير="" هذه="" العلامة="" ،="" مقارنةً="" بتلك="" الموجودة="" في="" مجموعة="" النموذج="" (الشكلان="" 7="" و="" 8="" (أ-ج)).="" بالإضافة="" إلى="" ذلك="" ،="" تم="" عكس="" التأثيرات="" الوقائية="" لـ="" caleolarioside="" b="" و="" paraboside="" b="" و="" paraboside="" ii="" ضد="" إصابة="" خلايا="" pc12="" التي="" يسببها="" h2o="" 2-="" بواسطة="" مثبط="" ho="" -1="" znpp="" (الشكل="" 8="" (د)).="" في="" الختام="" ،="" فإن="" جليكوسيدات="" الفينيثانويد="" caleo="" larioside="" b="" و="" arabinoside="" b="" و="" paraboside="" ii="" تحمي="" بشكل="" فعال="" خلايا="" pc12="" من="" h2o="" 2-="" التي="" تسبب="" الضرر="" التأكسدي.="" وفقًا="" لذلك="" ،="" قد="" تمثل="" هذه="" المركبات="" ،="" المعزولة="" من="" p.="" martini="" ،="" الأدوية="" المرشحة="" المحتملة="" لعلاج="" الأمراض="" التنكسية="">

الكاتب الاشتراكاتLM و ZC تصوروا وصمموا التجارب. أجرى GX و RK و BX التجارب. كتب GX و XY الورقة. ناقش GX و XY و RK و BX و ZC و LM النتائج وعلقوا على المخطوطة. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

بيان الإفصاح عن المعلوماتلم يتم الإبلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح من قبل المؤلفين. التمويل تم دعم هذا العمل من قبل صناديق الأبحاث التابعة لكلية الطب باوتو [رقم المنحة: BYJJ-YF 201727] ، وإعانة خدمة الصحة العامة للطب الصيني لعام 2018 "المسح الرابع حول موارد المواد الطبية الصينية" [رقم المنحة: جمعية التمويل [2018 ] 43].

مراجع

[1] Butterfield DA. وجهات نظر حول الإجهاد التأكسدي في مرض الزهايمر وتنبؤات البحوث المستقبلية. J الزهايمر ديس. 2018 ؛ 64: 1-11.

[2] Chignon C و Tomas M و Bonnefontrousselot D وآخرون. الإجهاد التأكسدي وببتيد أميلويد بيتا في مرض الزهايمر. الأكسدة والاختزال بيول. 2018 ؛ 14: 450-464.

[3] Guo JD و Zhao X و Li Y وآخرون. تلف الخلايا العصبية الدوبامينية بسبب الإجهاد التأكسدي في مرض باركنسون (مراجعة). إنت J مول ميد. 2018 ؛ 41: 1817-1825.

[4] باي واي ، دونغ إل إتش ، هوانغ إكس إتش ، وآخرون. رابطة تعدد الأشكال rs823128 و rs1572931 و rs823156 مع تقليل مخاطر الإصابة بمرض باركنسون. نيوروريبورت. 2017 ؛ 27: 936-941.

[5] Han XH و Zhu SL و Wang BX وآخرون. العمل المضاد للأكسدة من 7 ، 8- dihydroxyflavone يحمي خلايا PC12 من 6- السمية الخلوية التي يسببها الهيدروكسيدوبامين. نيوروتشيم إنت. 2014 ؛ 64: 18–23.

[6] Li MQ و Xu T و Zhou F وآخرون. التأثيرات الوقائية العصبية لأربعة جليكوسيدات فينيليثانويد على موت الخلايا المبرمج المستحث H2O 2- على خلايا PC12 عبر مسار Nrf2 / ARE. علوم Int J Mol. 2018 ؛ 19: 1135.

[7] Buendia I و Michalska P و Navarro E et al. Nrf 2- مسار ARE: هدف ناشئ ضد الإجهاد التأكسدي والتهاب الأعصاب في الأمراض التنكسية العصبية. فارماكول ثيرابيوت. 2016 ؛ 157: 84-104.

[8] Jia XJ و Yan XS و Cai ZP وآخرون. آثار جليكوسيدات الفينيثانويد ، المشتقة من Herba cistanche ، على العجز المعرفي والأنشطة المضادة للأكسدة في ذكور الفئران SAMP8. J توكسيكول إنف هيل أ .2017 ؛ 80: 1180-1186.

[9] Tsvetkov DE و Dmitrenok AS و Tsvetkov YE et al. جليكوسيدات فينيلثانويد من عقدة خشب الساج ونشاطها المضاد للأكسدة. J Biol Active Prod Nat. 2016 ؛ 6: 272-281.

[10] Zhang YQ و Gao EY و Liang CQ وآخرون. النشاط المضاد للأكسدة لمركبات جليكوسيد الكافويل فينيليثانويد من Lindernia ruellioides في المختبر. سنت ساوث فارم. 2017 ؛ 15: 1687 - 1690.

[11] Wu ZH، Ma YF، Zhao L، et al. دور مسار Nrf 2- في إصابة الإجهاد التأكسدي وعلاقته بمسارات الإشارات الأخرى. الرسوم المتحركة علم الأعلاف تربية. 2016 ؛ 37: 42-48.

[12] Zheng XK ، و Li J ، و Feng WS ، وآخرون. التقدم في دراسة Gesneriaceae. Chin J New Drug. 2003 ؛ 12: 261-263.

[13] Wen F، Li ZD. تقدم البحث في مصنع Gesneriaceae. الذقن البرية النباتية Resour. 2006 ؛ 25: 1-6.

[14] يان واي ، تشين إل ، وانج جي إم ، وآخرون. تقدم البحث في ترايتيربينويدات لنباتات Gesneriaceae. نات برود ريس ديف. 2012 ؛ 24: 698-701.

[15] شركة الأدوية العشبية الصينية. سجلات موارد الطب التقليدي الصيني. الصين: مطبعة العلوم ؛ 1994.

[16] باي زد إف ، وانغ إكس كيو ، شياو بي جي ، وآخرون. توزيع جليكوسيدات فينيلثانويد في النباتات الطبية من Gesneriaceae. تشين جي تشين ماتر ميد. 2013 ؛ 38: 4267-4270.

[17] He ZD، Lau KM، Xu HX، et al. النشاط المضاد للأكسدة لجليكوسيدات الفينيثانويد من Brandisia hancei. ي إثنوفارماكول. 2000 ؛ 71: 483-486.

[18] Li L و Shi DF و Gui YG وآخرون. دراسة عن الأنشطة المضادة للأكسدة لجليكوسيدات الفينيثانويد من Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009 ؛ 32: 15835-15836.

[19] Ju BW و Yang JH و Yan Y et al. التأثيرات الوقائية للجليكوزيدات من cistanche على تلف خلايا PC12 PARABOLA MARTINI حماية خلايا PC12 من H2O 2- الإصابات المستحثة 2211