ارتفاع السكر في الدم يستحث المناعة المدربة في البلاعم وسلائفها ويعزز تصلب الشرايين

خلفية:

لا تزال مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في مرض السكري مرتفعة على الرغم من العلاجات الخافضة للجلوكوز. لقد افترضنا أن ارتفاع السكر في الدم يحفز المناعة المدربة في البلاعم ، ويعزز الخصائص الطارئة المستمرة.

بالإضافة إلى ذلك ، في أنواع مختلفة من الأدبيات ، تعلمنا أيضًا أن نباتًا يسمى Cistanche له تأثير كبير في تحسين المناعة. Cistanche هو دواء صيني تقليدي له مجموعة واسعة من الوظائف التنظيمية المناعية. إطلاق العوامل ، وتحسين وظيفة أجهزة المناعة ، وطرق أخرى لتعزيز مناعة جسم الإنسان. لذلك ، في الحياة اليومية ، يمكن للناس تعزيز مناعتهم عن طريق تناول Cistanche deserticola باعتدال ، للوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها.

انقر فوق المنتج الملحق cistanche deserticola

طُرق:

نمت الضامة المشتقة من نخاع العظم من الفئران والفئران المصابة بداء السكري في جلوكوز فسيولوجي (5 مليمول / لتر) وخضعت لتسلسل الحمض النووي الريبي (n =6) ، والمقايسة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر ترانسبوزيز (n =6 ) ، وتسلسل الكروماتين المناعي (ن =6) لتحديد المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم. تم استخدام زرع نخاع العظم من الفئران المصابة بـ (n {5}}) أو بدون (n {6}}) السكري في الفئران (السكرية) Ldlr - / - لتقييم أهميتها الوظيفية في الجسم الحي. تم البحث عن دليل على المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في خلايا الدم وحيدة النواة البشرية المحيطية من مرضى السكري (ن =8) ​​مقارنة مع الأشخاص الخاضعين للمراقبة (ن =16) وفي البلاعم الضامة لتصلب الشرايين البشرية المستأصلة بالتسليخ الدقيق لالتقاط الليزر .

نتائج:

في البلاعم ، عزز الجلوكوز المرتفع خارج الخلية التعبير الجيني المسبّب للالتهاب والخصائص الوظيفية المسببة للتولد من خلال آليات تعتمد على تحلل السكر. احتفظت الخلايا الضامة المشتقة من نخاع العظام من الفئران المصابة بداء السكري بهذه الخصائص ، حتى عند تربيتها في الجلوكوز الفسيولوجي ، مما يشير إلى مناعة مدربة ناتجة عن ارتفاع السكر في الدم. أدى زرع النخاع العظمي من الفئران المصابة بداء السكري إلى (مستوى السكر في الدم) Ldlr - / - الفئران إلى زيادة تصلب الشرايين في جذر الأبهر ، مما يؤكد وجود شكل دائم ومناسب للمرض من المناعة الفطرية المدربة. كشف الفحص المتكامل للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة ال transposase ، والترسيب المناعي للكروماتين ، وتحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الضامة المشتقة من نخاع العظم ، عن وجود تأثير مبدئي للالتهاب في مرض السكري. نمط عامل النسخ المتضمن للكروماتين المفتوح عامل النسخ 1 المرتبط بـ Runt (Runx1). وبالمثل ، تم إثراء النسخ الضامة للوحة تصلب الشرايين والكريات البيض المحيطية في مرضى السكري من النوع 2 لأهداف Runx1 ، بما يتوافق مع دور محتمل في مرض الإنسان. تثبيط التثبيط الدوائي لـ Runx1 في المختبر النمط الظاهري المدرب.

الاستنتاجات:

قد تفسر المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم سبب عدم فاعلية استهداف الجلوكوز المرتفع في الحد من مخاطر الأوعية الدموية الكبيرة في مرض السكري وتقترح أهدافًا جديدة للوقاية من الأمراض وعلاجها.

الكلمات الدالة:

داء السكري ، الوراثة اللاجينية ، الجلوكوز ، الالتهاب ، الضامة

يرتبط مرض السكري بارتفاع مخاطر الإصابة بتصلب الشرايين ومضاعفاته ، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب .1 فرط سكر الدم هو سمة أساسية في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 ، وقد ركزت العلاجات بشكل كبير على خفض نسبة الجلوكوز في الدم. العلاج المكثف الخافض للجلوكوز فعال في تقليل مخاطر الأوعية الدموية لدى مرضى السكري من النوع 1 ، ولكن التأثير مؤجل لعدة سنوات 2 وفصل مؤقتًا عن السيطرة على جلوكوز الدم .3 في مرض السكري من النوع 2 ، لم يظهر خفض الجلوكوز أي تأثير أو تأثير متواضع على نتائج الأوعية الدموية المرتبطة بتصلب الشرايين مثل احتشاء عضلة القلب الحاد .4-6 يُطلق على الخطر المستمر لمضاعفات القلب والأوعية الدموية ، حتى بعد خفض الجلوكوز ، التأثير القديم أو الذاكرة الأيضية ، 4،7 لكن الآليات الكامنة تظل غامضة.

تصلب الشرايين مرض التهابي مزمن يتميز بترسب البروتينات الدهنية المعدلة والاحتفاظ بها وتراكم الخلايا المناعية في جدران الشرايين الكبيرة. تعتبر البلاعم أساسية في جميع مراحل تصلب الشرايين وتعتبر على نطاق واسع أهدافًا علاجية. تم تصنيف الضامة إلى أنماط ظاهرية متعارضة ، وهي proinflammatory (M1) ، استجابةً لعديد السكاريد الدهني ligand (LPS) و interferon- (IFN) ، أو إصلاح الأنسجة (M2) ، على سبيل المثال ، استجابة للإنترلوكين (IL). ) -4 ، على الرغم من أن نطاقها الوظيفي في الجسم الحي هو بلا شك أكثر تعقيدًا

يؤدي ارتفاع السكر في الدم إلى تفاقم تطور تصلب الشرايين ويؤخر تراجع البلاك ، 10 مع زيادة التعبير عن الجينات المسببة للالتهابات ومقاومة تحريض التعبير الجيني المرتبط بـ M 2- .10،11 في الخلايا الأحادية والبلاعم ، تحكم مسارات الطاقة الخلوية تفاعل بين الخلايا- المنبهات الجوهرية والبيئية ، والتي بدورها تؤثر بشكل ملحوظ على الوظيفة المرتبطة بالمناعة والتعبير الجيني. 12 استجابة لـ IL -4 ، تستقلب الضامة M2 الأحماض الدهنية وتعتمد على الفسفرة المؤكسدة .13 في المقابل ، الضامة M1 تتطلب الجلوكوز والتحول إلى التحلل الهوائي ، على غرار تأثير واربورغ في السرطان. ، بما في ذلك التحلل الهوائي أو تنشيط مسار الميفالونات ، 17،18 تحفز ذاكرة الخلايا المناعية الفطرية طويلة المدى (تسمى المناعة المدربة) من خلال التعديلات اللاجينية وتغييرات بنية الكروماتين. من أسلافهم من نخاع العظام (BM) 20

افترضنا أن المناعة المدربة استجابة لحسابات الجلوكوز المرتفعة لذاكرة السكري المفرطة في الدم حول تصلب الشرايين. وفقًا لذلك ، سعينا إلى تحديد ما إذا كانت التغيرات المرتبطة بالأمراض الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم في وظيفة الخلية الأحادية والبلاعم وما إذا كانت هذه التغييرات قد استمرت بعد استعادة الجلوكوز الطبيعي ، مما يعني إعادة البرمجة الأساسية. قمنا بدمج دراسات الوظيفة الخلوية ، وعلم الأيض ، وعلم النسخ ، وعلم الجينات لتحديد كيف يغير ارتفاع السكر في الدم عملية التمثيل الغذائي لتعديل التنشيط طويل الأمد من خلال التعديلات اللاجينية. اكتشفنا كيف يمكن أن تحدث هذه التغييرات على مستوى الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وفي الضامة المتباينة. يتم اختبار الأهمية الوظيفية من خلال زرع BM في نموذج الفأر لتصلب الشرايين ، ويتم التحقق من صحة النتائج عن طريق استجواب الضامة المستخرجة من الدم المحيطي البشري ولويحات تصلب الشرايين عن طريق التشريح الدقيق بالليزر (LCM). قد تفسر النتائج التي توصلنا إليها مقاومة مضاعفات الأوعية الدموية الكبيرة لمرض السكري للعلاجات التقليدية لخفض الجلوكوز.

طُرق

مصادر البيانات

تم إيداع البيانات التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية للتعبير الجيني الشامل ويمكن الوصول إليها من خلال رقم الانضمام GSE176068.

الحيوانات

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >تم التخلص من 13.9 مليمول / لتر ، وتم جمع الأنسجة.

خطوط الخلية

نمت جميع خطوط الخلايا عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. نمت خلايا L929 في وسط معهد روزويل بارك التذكاري مكملًا بنسبة 10 في المائة من مصل بقري جنيني (FBS) ، و 2 في المائة بنسلين ستربتومايسين ، و 2 مليمول / لتر جلوتامين. نمت خلايا L929 إلى التقاء كامل لمدة 7 إلى 8 أيام ، وتمت إزالة الوسائط المكيفة ، وتقسيمها إلى قسامات ، وتخزينها عند درجة -20 درجة حتى المطلوب. تمت زراعة الخلايا البطانية للفئران المشتقة من الجلد في 25 مليمول / لتر من الجلوكوز DMEM بنسبة 10 في المائة FBS ، و 2 في المائة من البنسلين - الستربتومايسين ، و 2 مليمول / لتر الجلوتامين.

الضامة المشتقة من BM

تم إنشاء الضامة المشتقة من BM (BMDMs) المستخدمة في هذه الدراسة عن طريق مسح BM من عظام الفأر والظنبوب والطلاء على أطباق بتري غير المعالجة بزراعة الأنسجة في 5 مليمول / لتر جلوكوز DMEM كامل (مكمل بـ 10 بالمائة FBS ، 2 بالمائة بنسلين - ستربتومايسين ، و 2 مليمول / لتر جلوتامين) بالإضافة إلى 20 بالمائة L929 وسط مكيف بالخلايا للتمايز. بعد التمايز لمدة 7 أيام ، تم اختيار BMDMs بشكل إيجابي ، وطليها بكثافة 2 × 10 خلية / مل ، وتحفيزها في 5 ملي مول / لتر جلوكوز DMEM كامل (ما لم يذكر خلاف ذلك) مع 10 نانوغرام / مل مورين انترفيرون- (IFN) - ؛ R&D Systems ، المملكة المتحدة) بالإضافة إلى 100 نانوغرام / مل LPS (Sigma-Aldrich ، المملكة المتحدة) ، أو 10 نانوغرام / مل من الماوس المؤتلف IL -4 (R&D Systems ، المملكة المتحدة) ، أو التحكم في الوسائط فقط لمدة 16 ساعة قبل الاستخدام . تم أيضًا استنبات BMDMs في وقت واحد في ظروف نسبة السكر في الدم المختلفة (5 مليمول / لتر جلوكوز DMEM مع إضافة الجلوكوز لعمل تركيز نهائي إما من 11 أو 20 مليمول / لتر جلوكوز) أو حالة تحكم تناضحي (مانيتول ؛ 5 مليمول / لتر جلوكوز DMEM بالإضافة إلى 15 مليمول / لتر مانيتول). أجريت الدراسات الأيضية في غياب أو وجود 10 مليمول / لتر ثنائي كلورو أسيتات (سيغما-ألدريتش ، المملكة المتحدة) أو 1 مليمول / لتر 2- ديوكسي-د-جلوكوز (سيغما-ألدريتش ، المملكة المتحدة).

عزل HSC

تم عزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام مجموعة MagniSort Mouse المكونة للدم لاستنفاد النسب (ThermoFisher Scientific ، المملكة المتحدة) عن طريق مسح BM من عظام الفأر والساق واحتضانها بعلامات لإزالة الخلايا الملتزمة بالنسب (CD3 و CD4 و B220 و Ter119 و Gr1) وإثرائها من أجل HSCs. تمت تربية HSCs في 5 مل من أنابيب الفرز الخلوية المنشطة الفلورية في 5 مليمول / لتر DMEM كامل (أو 20 مليمول / لتر جلوكوز أو مانيتول للتحفيز من النوع البري المشار إليه) مع إضافة 100 نانوغرام / مل LPS بالإضافة إلى 10 نانوغرام / مل IFN - أو 10 نانوغرام / مل من الماوس المؤتلف IL -1 (R&D Systems ، المملكة المتحدة) لمدة 16 ساعة لتحليل اللطخة الغربية أو ساعتين للمقايسة لتحليل تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase (ATAC-seq).

BMDM في نموذج الذاكرة المختبرية

تم تمييز BMDM إلى BMDMs كما هو موضح أعلاه في 5 أو 2 0 مليمول / لتر جلوكوز لمدة 1 أو 2 أو 4 أو 7 أيام. تم اختيار BMDMs بشكل إيجابي من خلال الالتصاق ، واستبدالها بـ 5 مليمول / لتر DMEM كامل ، وتركها للاحتضان لمدة 48 ساعة للسماح بفترة تطبيع الجلوكوز. تم بعد ذلك تحفيز BMDMs للاستخدام مع 1 0 نانوغرام / مل IFN- بالإضافة إلى 100 نانوغرام / مل LPS أو وسائط التحكم لمدة 16 ساعة في غياب أو وجود 0.25 أو 0.5 أو 1 أو 5 أو 10 ميكرو مول / لتر رو 5-3335 (ميرك ميليبور ، المملكة المتحدة) قبل استخدامها لتحليل التعبير الجيني.

عزل وحيدات الماوس

تم عزل وحيدات الفئران من الدم المحيطي باستخدام EasySep Mouse Monocyte Isolation Kit (Stemcell Technologies ، كندا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم استخدام الخلايا على الفور لفحص التصاق ثابت.

Seahorse XFe 96 طقم فحص معدل ATP في الوقت الحقيقي

تم إجراء تحليل التدفق خارج الخلية باستخدام مجموعة XFp RealTime ATP Rate Assay على BMDMs (8 × 1 0 4 خلايا لكل بئر ؛ 5 آبار مكررة لكل حيوان وحالة) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم أخذ ثلاثة قياسات لمعدل استهلاك الأكسجين الأساسي ومعدل التحمض خارج الخلية قبل حقن تركيزات مختلفة من الجلوكوز (5 أو 2 0 مليمول / لتر) أو وسيط اختبار (مانيتول ؛ منفذ الحقن أ). بعد 7 قياسات أخرى ، مركبات أوليغوميسين (2 ميكرو مول / لتر ؛ منفذ الحقن B) ومضاد الميسين A المركب (0.5 ميكرو مول / لتر) والروتينون (0.5 ميكرو مول / لتر ؛ منفذ الحقن C) ، من XFp Real-Time ATP Rate Assay kit ، تم حقنها بالتتابع مع 3 قياسات لاحقة. تم حساب كمية ATP الناتجة عن تحلل السكر ومؤشر معدل ATP (معدل إنتاج mitoATP / معدل إنتاج ATP الحال للجلوكوز) تلقائيًا باستخدام Wave (الإصدار 2.6 ، Agilent).

فحص التصاق ثابت

نمت الخلايا البطانية الفأرية المشتقة من الجلد لتلتقي على أغطية زجاجية في 12- ألواح جيدة ويتم تنشيطها بواسطة عامل نخر ورم الفأر المؤتلف 10 نانوغرام / مل (R&D Systems ، المملكة المتحدة) لمدة 16 ساعة. تم تصنيف وحيدات الدم المحيطية غير المحفزة أو IFN- بالإضافة إلى LPS (أو BMDMs من الفئران المصابة بداء الستربتوزوتوسين المزروعة في جلوكوز 5 مليمول / لتر) باللون الأخضر الفلوري مع مجموعة وصلات الخلايا الفلورية PKH67 (Sigma-Aldrich ، المملكة المتحدة) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تمت إضافة الخلايا المسمى إلى الخلايا البطانية بكثافة 5 × 104 خلية لكل غطاء لمدة ساعة واحدة قبل إزالة الوسائط والخلايا غير المرتبطة ، وغسلها بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) ، وتثبيتها في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة. تم الحصول على أربع صور لكل ساترة ؛ تم حساب عدد الخلايا ذات العلامات الملتصقة ؛ وتم حساب متوسط ​​الصور لكل ساترة. تم ضبط سطوع الصور المعروضة بالتساوي في ImageJ.

فحص خلية الرغوة

نمت BMDMs غير محفزة أو محفزة (LPS plus IFN-) على أغطية زجاجية في 12- أطباق جيدة واحتضانها بـ 25 ميكروغرام / مل من البروتين الدهني منخفض الكثافة ثنائي الأسيتيل (LDL ؛ Bioquote ، الولايات المتحدة) لمدة 48 ساعة. تمت إزالة الوسائط و LDL المتبقي من DiI-acetylated ، وتم غسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS وتثبيتها في 4 في المائة من بارافورمالدهيد. كان الدهن ملطخًا بالزيت الأحمر O ، وتم تركيب أغطية DAPI. تم التقاط صور تباين الطور لصور تلطيخ النفط Red O وصور الفلورسنت للنواة (4 صور لكل ساترة) واستخدمت لتحديد كمية الدهون أو عدد الخلايا ، على التوالي ، باستخدام برنامج ImageJ. تم بعد ذلك تطبيع منطقة الدهون لكل صورة مع عدد الخلايا في كل صورة ، ويتم التعبير عن النتائج كتغير أضعاف على عينات التحكم في الجلوكوز 5 مليمول / لتر (لتجارب الجلوكوز BMDM) وعينات التحكم (لتجارب BMDM السكري). تم ضبط سطوع الصور المعروضة بشكل موحد.

تجربة زرع BM لمرضى السكر

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >تم استخدام 13.9 مليمول / لتر وأقراص التحكم CD 68- الفئران GFP من نفس العمر كمانحين BM. تم جمع BM من الفئران المانحة ، وتم حقن 5 × 10 خلايا قابلة للحياة عن طريق الوريد في مشع مميت (2 × 500 راد) LdLr - / - المتلقي B6.129S 7- Ldlr-tm1Her / J الفئران (مخزون JAX رقم 002207 ). بعد التطعيم ، تم وضع جميع الحيوانات المتلقية على نظام غذائي غربي (حمية مفتوحة المصدر D12079B ؛ 1٪ دهون ، 40٪ سعرات حرارية) لمدة 12 أسبوعًا. تم جمع الدم الكامل في 4 و 8 و 12 أسبوعًا بعد التطعيم لتحليل التدفق الخلوي للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) ومراقبة مستويات التطعيم وتقييم عدد سكان الكريات البيض. تمت مراقبة Engraftment ، الذي تم تقييمه كل 4 أسابيع بعد التطعيم ، عن طريق تلطيخ الخلايا باستخدام antiCD45 وتقييم النسبة النسبية لخلايا CD45 plus GFP plus بين إجمالي CD45 plus. في 12 أسبوعًا ، تم التخلص من الفئران ، وتم جمع الدم الكامل ، ومعالجة الأمصال من أجل قياسات الدهون الثلاثية ، والأحماض الدهنية غير المستقرة ، و LDL ، وقياسات كوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة. تم ترطيب الفئران باستخدام PBS ، متبوعًا بالتروية والتثبيت بنسبة 4 في المائة لامتصاص العرق بين عشية وضحاها. تم تشريح القلب والشريان الأورطي ووضعهما في 70 بالمائة من الإيثانول حتى المعالجة.

تحليل لوحة جذر الأبهر والتألق المناعي

لتقدير عبء البلاك ، تم وضع جذور الأبهر المثبتة لامتصاص العرق في وسط قطع مثالي ومقطعة على مستوى موازٍ للأذينين. لقياس حجم اللويحة ومحتوى دهون البلاك و 21 ومحتوى الكولاجين ، 5 أقسام ، موزعة بالتساوي من خلال جذر الأبهر ، كانت ملطخة بماسون جولدنر ثلاثي الألوان (ميرك ، المملكة المتحدة). باختصار ، تم إعادة تركيب الأقسام في محلول Bouin في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، وغسلها في ماء جاري لمدة 5 دقائق ، ثم تم وضعها من خلال بروتوكول مجموعة تلطيخ Masson-Goldner من ثاني 7 0 بالمائة من حضانة الإيثانول وفقًا للشركة المصنعة توقيت البروتوكول. تم بعد ذلك تركيب الشرائح المبللة بالزيلين باستخدام Neo-Mount وختمها بغطاء زجاجي. تم قياس خصائص البلاك في الإصدار 6.0 من برنامج Image Pro Plus (Media Cybernetics ، Silverspring ، MD) ، وتم عرض البيانات كمتوسط ​​لجميع الأقسام.

ثم تم إجراء التألق المناعي على 6 أقسام متجاورة. كانت المقاطع ملطخة بمحتوى البلاعم باستخدام GFP (مضاد للأرانب GFP ، A6455 ، Invitrogen) أو علامة البلاعم galectin -3 (أنظمة الماعز المضادة لـ galectin 3 ، AF1197 ، R&D) ، لمحتوى خلايا العضلات الملساء مع -actin ( الأكتين المضاد للعضلات الملساء للأرنب ، ab32575 ، Abcam PLC) ، وللعلامات اللاجينية H3K4me3 (أرنب متعدد النسيلة إلى هيستون H3 [ثلاثي ميثيل K4] ، Ab8580 ، Abcam PLC) و H3K27ac (أرنب متعدد النسيلة إلى هيستون H3 [أسيتيل K27] ، Ab4729 ، Abcam PLC). بالنسبة لتلطيخ التألق المناعي ، تمت إعادة ترطيب الأقسام باستخدام PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتم حظرها لمدة ساعة واحدة باستخدام محلول DAKO للحظر (Agilent ، المملكة المتحدة). تم تخفيف الجسم المضاد الأولي إلى 1 ميكروغرام / مل في DAKO وإضافته إلى أقسام طوال الليل عند 4 درجات. تم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 1: 200 في DAKO وإضافتها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (مضاد للأرنب الحمير [A488] ، A21206 ، تقنيات الحياة ؛ مضاد الحمير [A594] ، A11058 ، ThermoFisher Scientific). تم تركيب المقاطع أخيرًا DAPI (وسط تركيب الجلسرين مع DAPI و DABCO ، Abcam ، المملكة المتحدة). تم تحليل الصور الفلورية باستخدام برنامج Image J.

التعبير الجيني

تم عزل Total RNA باستخدام مجموعة RNeasy Plus Mini (Qiagen ، المملكة المتحدة) وتم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية Nanodrop 2 0 00. تم إجراء تخليق (كدنا) مع 0.2 إلى 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مع مجموعة النسخ العكسي QuantiTect (Qiagen ، المملكة المتحدة) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الفعلي على 5 نانوغرام / ميكرولتر (كدنا) مع تحقيقات Taqman الخاصة بـ B2m (Mm00437762) ، Il -6 (Mm00446190) ، Il -1 (Mm 00462531_ m1) ، iNos (Mm00440502) ، Ym1 (Mm00657009) ، و Fizz1 (Mm00556208). تم إجراء PCR الكمي باستخدام المزيج الرئيسي العالمي TaqMan II مع UNG على نظام QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR (ThermoFisher). تم تطبيع جميع بيانات PCR للتعبير الجيني الداخلي لمدبرة المنزل (B2m) وتحليلها بواسطة طريقة 2 − ΔCT لحساب تعبير mRNA النسبي.

تحليل لطخة غربية

تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني بارد ومحلول في محلول تحلل مقايسة مناعية إشعاعية (15 0 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 1. 0 بالمائة IGEPAL CA -630 ، 0. 5 في المئة ديوكسيكولات الصوديوم ، 0. 1 في المئة SDS ، 50 ملي مول / لتر Tris ، pH 8.0) مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز. تم تحديد تركيز البروتين عن طريق مقايسة حمض البيسينشونينيك (Pierce BCA Protein Assay Kit ، ThermoFisher Scientific ، المملكة المتحدة) وفقًا لتعليمات الفحص. تم تحميل تركيزات متساوية من البروتين وتشغيلها على هلام SDS-PAGE (4 في المائة إلى 12 في المائة Bis-Tris Gel ، Life Technologies ، المملكة المتحدة) للفصل. تم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز (Bio-Rad ، المملكة المتحدة) وتم فحصها باستخدام أجسام مضادة محددة كما هو موضح باستخدام -actin (الفأر المضاد - - أكتين [15G5A11 / E2] ، Invitrogen) كمدبرة منزل والتحكم في التحميل. تم تطوير الأغشية (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ، Thermo Scientific ، المملكة المتحدة) وتم اكتشافها بواسطة التلألؤ الكيميائي في محطة Biorad Image.

العينات البشرية وعزل LCM للبلاك الضامة

تم إجراء جميع التحقيقات السريرية بموجب إعلان هلسنكي ، وتم تخزين العينات بموجب قانون الأنسجة البشرية في المملكة المتحدة (2004). تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات ذي الصلة ، وقدمت جميع المواد موافقة خطية مستنيرة. تم تجنيد المرضى الذين ينتظرون استئصال باطنة الشريان السباتي ، وتم جمع لويحات الشريان السباتي حديثًا في وقت الجراحة (تم تلخيص خصائص المريض في ملف Excel I في ملحق البيانات). تم غسل اللويحات السباتية المستكشفة في PBS معقمة بالثلج ، وتم تجميدها في وسط قطع مثالي ، وتخزينها عند -80 درجة حتى معالجتها.

تم إجراء LCM باستخدام نظام PALM Microbeam LCM (Carl Zeiss GmbH ، ألمانيا) باستخدام نهج "شريحة توجيه" معدلة. 22،23 تم تقسيم عينات لوحة السباتي حديثًا عند 15 ميكرومتر. تتكون شرائح الدليل من 3 أقسام متتالية: القسم الأول كان ملطخًا ببروتوكول مجموعة تلطيخ ماسون-غولدنر للمساعدة في تحديد المواقع الميكروية الدقيقة ، وكان القسمان التاليان محصنين بالمناعة لأي من الضامة (الفئران المضادة للبشر CD68 [استنساخ KP {{7}) }] ، داكو ، كامبريدج بالمملكة المتحدة) أو خلايا العضلات الملساء (الفأر المضاد للإنسان - أكتين [استنساخ 1A4] ، داكو ، كامبريدج بالمملكة المتحدة). تم قطع المقاطع اللاحقة (حتى 15) على شرائح غشاء LCM (ThermoFisher Scientific ، المملكة المتحدة) وكريزيل البنفسجي الملون جاهزًا للمعالجة الفورية. تم تحديد مجموعات خلايا البلاعم يدويًا استنادًا إلى تلطيخ شريحة الدليل باستخدام PALM RoboSoftware (الإصدار 4.5 ، Carl Zeiss GmbH ، ألمانيا). تم التقاط إجمالي مساحة الاهتمام المشتركة بين 3 و 5 × 106 ميكرومتر 2 بالليزر على Zeiss PALM AdhesiveCap (Carl Zeiss GmbH ، ألمانيا). تم فصل الخلايا على الفور ، وتجميدها المفاجئ على الجليد الجاف ، وتخزينها عند 80 درجة حتى يتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RNEasy الصغيرة (Qiagen ، المملكة المتحدة) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

لوحة البلاعم البشرية Microarray

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >تم نقل 5 إلى تضخيم الحمض النووي الريبي ، والتضخم الحيوي ، وتحليل ميكروأري للتعبير الجيني. تم تقديم هذه العينات إلى Cambridge Genomic Services (قسم علم الأمراض ، جامعة كامبريدج ، المملكة المتحدة) لمزيد من المعالجة. تم إجراء التضخيم والتضخم الحيوي باستخدام مجموعة Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc ، الولايات المتحدة) ، ثم تم تغيير التهجين بترتيب عشوائي على 2 Illumina Human HT12 v4. 0 BeadChips (Illumina ، الولايات المتحدة) لتقليل الدفعة / اختلاف الرقاقة. تمت معالجة Illumina BeadArrays باستخدام حزمة مصفوفة حبة الموصل الحيوي (الإصدار 2.24. 0) ​​24،25 باستخدام التطبيع الأسي العادي. تم انهيار مجموعات المسبار لكل جين بناءً على النطاق الربعي الأقصى لتجنب القيم القصوى ولكن التقاط التباين عبر جميع العينات. تم استبعاد مجموعات التحقيق غير الموضح والتحكم من التحليل الإضافي. تم تقييم التعبير التفاضلي (DE) للقائمة النهائية لـ 21036 جينًا باستخدام حزمة Bioconductor limma (الإصدار 3.30.13) لمقارنة مرضى السكري مع مجموعة التحكم ، وضبط حالة الأعراض / بدون أعراض. نظرًا لتوفر مجموعات البيانات المتعامدة و 8 عينات لكل مجموعة ، استخدمنا قيمة معدلة متساهلة نسبيًا لـ P<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

عزل الوحيدات البشرية

تم الحصول على الدم الوريدي المحيطي (15-20 مل) من متبرعين أصحاء في أنابيب مغلفة بـ K 2- EDTA (BD Vacutainer ، نيو جيرسي) وتمت معالجتها في غضون ساعة واحدة. تم الحصول على البلازما والجزء المخصب بالخلايا أحادية النواة عن طريق طرد الدم الكامل على أعمدة Accuspin Histopaque -1077 (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم نقل الجزء المخصب بالخلية أحادية النواة إلى الأمام لعزل الخلية الأحادية باستخدام مجموعة عزل حبة اختيار سلبي (مجموعة تخصيب أحادية الخلية البشرية EasySep بدون استنفاد CD16 ، StemCell Technologies ، كندا) ، باتباع البروتوكول الموصوف للشركة المصنعة.

عزل وتحفيز الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي

تم تجنيد مرضى السكري والمرضى الخاضعين للدراسات السريرية بعد الموافقة الأخلاقية المحلية والإقليمية في معهد كارولينسكا ، ستوكهولم (2011 / 1002-31 / 1 و 2009 / 1881-31 / 1). تم عزل PBMCs من عينات الدم المحيطية التي تم جمعها بعد الصيام طوال الليل باستخدام SepMate (StemCell Technologies) و Lymphoprep (StemCell Technologies) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تجميد PBMCs المعزول وتخزينه في 90 بالمائة FBS و 10 بالمائة ثنائي ميثيل سلفوكسيد.

تم إذابة تجميد PBMCs المخزنة وغسلها في PBS عن طريق الطرد المركزي (500 جم لمدة 10 دقائق) ، وتم عد الخلايا القابلة للحياة وتغليفها في آبار فردية من 12- لوحة زراعة الأنسجة بشكل جيد في DMEM الفسيولوجي (منخفض) الجلوكوز ، 10 بالمائة FBS ، 2 مليمول / لتر الجلوتامين و 1 في المائة من البنسلين والستربتومايسين. تم استراحة PBMCs طوال الليل وعولجت بمركبة PBS أو 100 نانوغرام / مل LPS و 10 نانوغرام / مل من IFN المؤتلف (أنظمة البحث والتطوير) لمدة 6 ساعات. بعد التحفيز ، تم تفكيك PBMCs في RLT (QIAGEN) ، وتم تجميدها سريعًا ، وتخزينها عند درجة 80-. تم عزل الحمض النووي الريبي وخاضع لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) كما هو موصوف.

الأيض وقياسات الأيض

تمت زراعة الخلايا الأحادية البشرية المعزولة بكثافة 3.5 × 1 0 5 خلايا لكل عينة في 5 مليمول / لتر كامل من الجلوكوز DMEM ، وهي وسائط مكملة بالجلوكوز لتكوين تركيز نهائي يبلغ 2 0 مليمول / لتر جلوكوز ، أو الوسائط التي تحتوي على 15 مليمول / لتر مانيتول في 5 مل من أنابيب فرز الخلايا المنشطة الفلورية لمدة 12 ساعة. تم تحضير محلول الخلية عن طريق الاستخلاص باستخدام الميثانول المثلج لمدة 20 دقيقة على الجليد الجاف والمجمدة المفاجئة في النيتروجين السائل. في يوم التحليل ، تم تدوير العينات ثم طردها عند 10 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. تم تحضير عينة مجمعة لمراقبة الجودة عن طريق خلط 60 ميكرولتر من كل مستخلص عينة وتحليلها بشكل دوري خلال التشغيل التحليلي الكلي لتأكيد أداء الطريقة. تم ترشيح العينات باستخدام مرشح طرد مركزي يبلغ 0. 1- ميكرومتر Ultrafree-MC (5000 جم ، 3 دقائق) ثم نقلها إلى قوارير كروماتوجرافيا سائلة - قوارير قياس الطيف الكتلي. تم إجراء تحليلات الأيض غير المستهدفة كما هو موصوف سابقًا .27 باختصار ، تم تحليل العينات على كروماتوجراف سائل فائق الأداء Thermo Ultimate 3000 مقترن بـ Q-Exactive Orbitrap باستخدام اكتساب تبديل القطبية (إيجابي-سلبي) يعمل بقوة حل جماعي تبلغ 70000 عروض كاملة بنصف الحد الأقصى. تم فصل المركبات المحبة للماء كروماتوجرافيًا على عمود Merck Sequant ZIC-HILIC (150 × 4.6 مم ، 5- ميكرون حجم الجسيمات) والمركبات الكارهة للماء باستخدام عمود Thermo Accucore aQ RP C18 (150 × 2.1 مم ، 2. {{38) }} ميكرومتر حجم الجسيمات). تم تحديد المستقلبات باستخدام قاعدة بيانات داخلية. تم إجراء 27 إثراء مجموعة الأيض وتحليل المسار الأيضي على جميع قياسات المستقلب باستخدام MetaboAnalyst (الإصدار 4.0).

بالنسبة لقياسات المستقلب BMDM و HSC ، تمت زراعة الخلايا كما هو موضح سابقًا بكثافة 5 × 105 لكل بئر ، وتم تشغيل طاف الثقافة على ABX Pentra 400 (Horiba) لقياس الجلوكوز (ABX Pentra Glucose PAP CP ، Horiba ، المملكة المتحدة) ومستويات اللاكتات (ABX Pentra Lactic Acid). تم تطبيع القياسات لتركيزات الجلوكوز واللاكتات الموجودة في وسائط زراعة الخلايا الكاملة التي تم تحضينها تحت نفس الظروف ولكن ليس في وجود الخلايا. تم استخدام محللات خلية BMDM لقياس مستويات السكسينات (Succinate Assay Kit ، Abcam ، المملكة المتحدة) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تحليل ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 نقطة أساس تم قياس تركيزات الحمض النووي باستخدام مقياس التألق Qubit (تقنيات الحياة) ، وتم تقييم توزيع حجم المكتبة باستخدام رقاقة تحليل الحمض النووي عالية الحساسية (Agilent ، المملكة المتحدة). تم إجراء تضخيم المكتبة باستخدام بادئات Nextera المخصصة ، وتم ترتيب 28 مكتبات بواسطة مرفق التسلسل الطبي الحيوي في CeMM باستخدام منصة Illumina HiSeq 3000/4000 وتكوين قراءة واحدة 50- bp.

تم التحكم في قراءات الجودة وتم قصها من أي محولات متبقية. تمت محاذاة القراءات بعد ذلك مع جينوم الماوس (Mm10) باستخدام Bowtie (الإصدار 2.2.6) في الوضع "المحلي الحساس". تمت تصفية القراءات المحاذية لإزالة التطابقات منخفضة الجودة (جودة تعيين أقل من أو تساوي 10) أو يقرأ تعيين تسلسل الميتوكوندريا. تم تغيير مواضع بدء المحاذاة بطريقة مدركة للخيوط (4 نقاط أساس ، −5 بت ، 28) قبل ذروة الاتصال باستخدام MACS2 (الإصدار 2.1.129). تم تحديد المناطق المرتبطة تفاضليًا باستخدام DiffBind (الإصدار 2.4.830) مع تمركز الذروة (القمم =100) والحافة R.31

تم إجراء تحليل المسار بعد ذلك على القمم المخصبة في عينات مرضى السكري (معدل الاكتشاف الخاطئ [FDR] أقل من أو يساوي {0}}. 1) عن طريق إدخال موقع ذروة الكروموسوم في أداة إثراء المناطق الجينومية للتعليقات التوضيحية ( الإصدار 3. 0). تم بعد ذلك تحليل 32 منطقة ذروة تفاضلية باستخدام الترسيب المناعي للكروماتين MEME (ChIP ؛ الإصدار 4.12.0) ، 33 والذي يقوم بإجراء تحليل شامل لتحديد أي أشكال ربط معروفة أو غير معروفة يتم إثرائها (مخصب) الزخارف ه<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

عامل النسخ المرتبط بالتشغيل 1 تحديد الهدف

حددت شريحة MEME-ChIP لمناطق ATAC-seq عامل النسخ 1 المرتبط بـ Runt (RUNX1) كمنظم محتمل في كل من IL -1 و HSCs غير المحفز لمرضى السكري. تم استخدام MEME GOMo (الإصدار 4.12. 0) ​​33 لفحص الفئران والمروجين البشريين (−1000 ، بالإضافة إلى 200) للحصول على نموذج RUNX1 المتفق عليه (MA002.2). بالإضافة إلى تحليل إثراء علم الجينات ، يعرض جومو قائمة بالجينات التي تم تحديدها كأهداف. اقتصرت هذه الزيارات على المروجين المحفوظين المرتبطين في كل من الفئران والبشر بقيم P التجريبية<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي

تم استخدام أدوات التحكم أو BMDM لمرضى السكري (n {0}}) ، المزروعة في 5 مليمول / لتر وتحفيزها باستخدام LPS بالإضافة إلى IFN- لمدة 6 ساعات أو خلايا التحكم غير المحفزة ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. باختصار ، تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عزل mirVana mRNA / miRNA (ThermoFisher Scientific ، المملكة المتحدة) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد كمية إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام نظام Qubit Fluorometric Quantitation System (تقنيات الحياة) ، وتم تحديد رقم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام نظام Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad). تم إعداد مكتبات RNA-seq باستخدام مجموعة إعداد عينة TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina ، المملكة المتحدة) باستخدام كل من روبوتات معالجة السائل Sciclone و Zephyr (PerkinElmer ، المملكة المتحدة). تم قياس تركيزات المكتبة باستخدام نظام Qubit Fluorometric Quantitation System (Life Technologies ، المملكة المتحدة) ، وتم تقييم توزيع الحجم باستخدام نظام Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad ، الولايات المتحدة).

بالنسبة للتسلسل ، تم تخفيف العينات وتجميعها بكميات متساوية الأقطاب وتسلسلها على أدوات Illumina HiSeq 3000/4000 في تكوين قراءة واحدة 50- bp بواسطة مرفق التسلسل الطبي الحيوي في CeMM. تم تحويل المكالمات الأساسية التي يوفرها برنامج Illumina Real-Time Analysis لاحقًا إلى تنسيق خريطة محاذاة ثنائي (Illumina2bam) قبل فك تعدد الإرسال (BamIndexDecoder) إلى ملفات خرائط محاذاة ثنائية فردية خاصة بعينة عبر أدوات Illumina2bam (1.17.3). تم إعداد المكتبات وتسلسلها بواسطة مرفق التسلسل الطبي الحيوي في CeMM.

تمت محاذاة القراءات مع جينوم الماوس (GRCm38 / mm10) باستخدام STAR (الإصدار 2.5.3a34) في وضع عد الجينات (QuantMode GeneCounts) مع تعليقات Gencode (الإصدار M16) (التي تمت إزالة النسخة الضخمة Gm20388 منها لتجنب تداخل الجينات المتداخلة). تم تحميل الأعداد في R (الإصدار 3.3.3) وتحليلها باستخدام edgeR (الإصدار 3.16.535) بعد إزالة النصوص باستخدام<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 تم اعتبارها DE. يتم تضمين جداول DE وقوائم الجينات كملف Excel II في ملحق البيانات (غير محفز) وملف Excel III في ملحق البيانات (LPS plus IFN- محفز). تم استخدام وظيفة edgeR cpm لتسجيل الأعداد العادية (ملف Excel IV في ملحق البيانات) لخرائط الحرارة والمؤامرات الأخرى. تم إنشاء الخرائط الحرارية باستخدام خريطة التمثيل اللوني لحزمة R (الإصدار 1. 0. 836). تم إجراء التمثيل الزائد لتحليل الجينات المستهدفة RUNX1 بين جينات DE في مرضى السكري مقارنةً بالتحكم LPS بالإضافة إلى عينات IFN كما هو موضح سابقًا لبيانات المصفوفة البشرية.

تسلسل رقاقة

تم إصلاح إجمالي 1 × 106 خلية / مل مع 1 في المائة من الفورمالديهايد عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتخزينها عند درجة 80-. تم قص الخلايا باستخدام Chromatin EasyShear Kit – Low SDS (Diagenode ، بلجيكا) وصوتها بجهاز صوتنة Bioruptor Pico (الكتالوج رقم B01080010 ، Diagenode ، بلجيكا) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. تم استخدام نظام الترسيب المناعي للكروماتين MAGnify (Thermo Scientific) لاختيار شظايا الكروماتين باستخدام مضاد هيستون H3 (ثلاثي ميثيل K4 ؛ ab8580) أو مضاد هيستون H3 (أسيتيل K27 ؛ ab4729). تم تحضير مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة إعداد مكتبة DNA NEBNext Ultra II وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم إصلاح نهاية الشريحة المنقى أو DNA المدخلات و A-tailed متبوعًا بربط المحول. تم اختيار حجم الحمض النووي المرتبط بالمحول باستخدام خرز SPRI Ampure XP (Agencourt) وإثرائه باستخدام بادئات تسلسلية متوافقة مع Illumina. تمت تنقية المكتبات النهائية باستخدام حبات SPRI Ampure XP لإزالة ثنائيات المحول وتسلسلها بواسطة مرفق التسلسل الطبي الحيوي في CeMM باستخدام منصة Illumina HiSeq 3000/4000 وتهيئة القراءة الواحدة 50- bp.

المعلوماتية الحيوية

لفحص العلاقة بين انفتاح الكروماتين والتعبير الجيني في BMDMs غير المحفزة ، تمت مقارنة داء السكري مقابل قمم التحكم ATAC-seq (تغييرات log2 fold) ومستوى mRNA للجينات القريبة (تغييرات log2 fold) بواسطة ارتباط Pearson الخطي.

قراءات من ATAC-seq و H3K4me3 ChIP-Sequence (ChIPseq) و H3K27ac ChIP-seq تم تصورها في عينات تمثيلية باستخدام متصفح الجينوم التكاملي ، مع قياس ارتفاعات المسار لكل تجربة ونوع الخلية لمراعاة الاختلافات المنهجية في عمق القراءة.

تحليل احصائي

تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية للبيانات غير المتسلسلة في برنامج GraphPad Prism. تم تحليل البيانات للتوزيع الطبيعي عن طريق اختبار شابيرو-ويلك الطبيعي. تم حساب المقارنات بين مجموعتين من خلال 2- اختبارات t الذيل للطلاب أو اختبارات Mann-Whitney U للبيانات الموزعة بشكل طبيعي أو غير طبيعي ، على التوالي. تم حساب المقارنات بين مجموعات متعددة عن طريق تحليل الطريقة 1- أو 2- طريقة ANOVA مع Bonferroni بعد التصحيح المخصص. يتم الإبلاغ عن البيانات على أنها متوسط ​​± SD للبيانات الموزعة بشكل طبيعي أو متوسط ​​± نطاق رباعي للبيانات الموزعة بشكل غير طبيعي. يمكن العثور على العديد من التكرارات والتفاصيل الإحصائية الأخرى في وسيلة إيضاح الأشكال. لكل من التجارب في الجسم الحي وفي المختبر ، n هو عدد الحيوانات الفردية أو المتطوعين الأصحاء أو المرضى. يتم حساب تغييرات الطية على أنها متوسط ​​قيمة حالة الاختبار مقسومة على متوسط ​​قيمة التحكم.

نتائج

فرط سكر الدم السكري يغير التمثيل الغذائي الخلوي ، ويؤدي إلى وظيفة الجينات المسببة للالتهابات ووظيفتها

يزيد التحلل الهوائي للجلوكوز من التعبير الجيني المسبّب للالتهاب (M1) ، كما أن ارتفاع السكر في الدم يعزز أيضًا التعبير الجيني المرتبط بـ M 1- .10،11 لذلك ، افترضنا أن ارتفاع نسبة الجلوكوز خارج الخلية يؤدي إلى زيادة تحلل السكر ، مما يؤدي إلى استقطاب محسن للبلاعم نحو النمط الظاهري M1 .

أشار تحليل التمثيل الغذائي للخلايا الوحيدة البشرية الأولية إلى أن ارتفاع الجلوكوز خارج الخلية (2 0 مليمول / لتر) قد أدى إلى تغيير المظهر الجانبي الأيضي مقارنة بحالات الجلوكوز الفسيولوجي المتطابقة تناضحيًا (5 مليمول / لتر). كشف تحليل المسار (الشكل 1 أ) أن ارتفاع الجلوكوز أدى إلى تغييرات كبيرة في دورة حمض الكربوكسيل (FDR ، 0. 0 02) واستقلاب البيروفات (FDR ، 0.005) ، يُشار إليه بزيادة سكسينات ، مالات ( الشكل 1 ب) ، اللاكتات ، ومستويات البيروفات (الشكل 1 ج) ، على التوالي ، مع تحليل إثراء مجموعة المستقلب (الشكل 1 د) الذي يسلط الضوء على تأثير واربورغ (FDR ، 0.04).

الشكل 1. ارتفاع الجلوكوز يغير التمثيل الغذائي الخلوي. تحليل المسار الأيضي. القياسات الفردية لـ (ب) سكسينات ، مالات ، (ج) لاكتات وبيروفات و (د) تحليل إثراء مجموعة المستقلب (Metaboanalyst) لعينات استقلاب خلية أحادية الخلية البشرية (ن =5). تحليل التدفق خارج الخلية على الضامة المشتقة من نخاع عظم الفأر (محلل فرس البحر الحيوي ؛ عدد =6 حيوانات فردية) يقيس (E) معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) و (F) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) استجابةً لمختلف الجلوكوز خارج الخلية ، التحكم التناضحي (مانيتول) ، وحقن مثبطات التمثيل الغذائي. أدى ارتفاع الجلوكوز (G) إلى زيادة إنتاج ATP (glycoATP) حال للجلوكوز و (H) انخفض مؤشر معدل ATP (معدل إنتاج ATP للميتوكوندريا / معدل إنتاج glycoATP) ، مما يشير إلى تحول إلى نمط ظاهري أكثر تحلل السكر. تم تحليل البيانات عن طريق (B و C) 2- way ANOVA أو (E-H) 1- بطريقة ANOVA بالإضافة إلى Bonferroni post hoc test. جميع البيانات المعروضة تعني ± SD. AU يشير إلى وحدات تعسفية ؛ FDR ، معدل الاكتشاف الخاطئ ؛ و TCA ، حمض ثلاثي الكربوكسيل. * ص<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

تم تأكيد النمط الظاهري الأكثر تحلل السكر (وأقل أكسدة) استجابة لارتفاع الجلوكوز (20 مليمول / لتر) في BMDMs للفأر ، مما أظهر زيادة في معدل التحمض خارج الخلية ، وزيادة إنتاج ATP الحال للجليكولتيك (2- أضعاف ؛ P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

تم منع هذه الزيادة في معدل تحلل السكر بواسطة مثبط تحلل السكر ثنائي كلورو أسيتات (الشكل Ia و Ib في ملحق البيانات).

في BMDMs ، عزز كل من الغلوكوز المرتفع تعبير M 1- المرتبط بالتهاب -6 (2. 7- fold؛ P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

الشكل 2. ارتفاع نسبة الجلوكوز يغير التعبير الجيني ووظيفة الضامة. M1 (عديد السكاريد الدهني [LPS] بالإضافة إلى الإنترفيرون - [IFN-] محفز) الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDM) (A) Il -6 و (B) عبارة عن تعبير جيني في وجود أو عدم وجود ثنائي كلورو أسيتات (DCA). M2 (تحفيز إنترلوكين -4) BMDM (C) Ym1 و (D) Fizz1 التعبير الجيني. من A إلى D ، يتم تطبيع بيانات تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي لتعبير B2m ؛ ن =7 حتى 10. هـ ، القياس الكمي للصور لالتصاق خلية أحادية الفأر بالخلايا البطانية (ن =5). F ، القياس الكمي للصورة لامتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة الأسيتيل بواسطة BMDMs ، الذي تم تطبيعه بواسطة رقم الخلية لكل صورة. ممثل (G) صور التصاق ثابتة لـ PKH الفلوريسنتلي 67- وحيدات الفأر المسمى بالخلايا البطانية و (H) Oil Red O (ORO) - وصور خلية رغوة ملطخة DAPI. يتم عرض جميع البيانات (A - H) على أنها تعني ± SD ؛ (أ - د) 1- طريقة ANOVA أو (E و F) 2- طريقة ANOVA مع تحليل Bonferroni اللاحق. تمثل كل نقطة حيوانًا فرديًا (بمعدل 4 صور للالتصاق الثابت وتكوين الخلايا الرغوية). AU يشير إلى وحدات تعسفية ؛ NS غير مهم. * ص<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

نظرًا لتأثيراته في تعزيز الالتهاب ، قمنا بعد ذلك باختبار ما إذا كان ارتفاع الجلوكوز خارج الخلية يغير وظائف الخلية الأحادية والبلاعم ذات الصلة بتصلب الشرايين.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

الخلايا المستمدة من BM من الفئران المصابة بداء السكري تعرض مناعة مدربة بسبب ارتفاع السكر في الدم

استخدمنا بعد ذلك نموذجًا لمرض السكري على الفئران لاختبار ما إذا كانت التغيرات الالتهابية المستمرة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في الضامة ، حتى بعد تطبيع الجلوكوز. لقد حصلنا على BM من فئران تحكم غير مصابة بداء السكري ومتوافقة مع العمر ومن الفئران المصابة بداء السكري المصاحب التي تم فيها تحفيز ارتفاع السكر في الدم عن طريق الستربتوزوتوسين واستمر لمدة 6 أسابيع في الجسم الحي (الشكل III أ - IIId في ملحق البيانات). تم تفريق الخلايا في BMDMs تحت الجلوكوز الفسيولوجي (5 مليمول / لتر ؛ الشكل 3 أ). بعد التحفيز ، عرضت BMDMs من الفئران المصابة بداء السكري تعبيرًا جينيًا محسنًا 1- مرتبطًا -6 (4. 1- أضعاف ؛ P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

الشكل 3. الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) من الفئران المصابة بداء السكري تظهر فرط سكر الدم في التعبير الجيني. أ ، رسم تخطيطي لبروتوكول BMDM لمرضى السكري والتحكم (ن =10 - 12). تحليل التعبير الجيني M1 لـ (B) Il -6 (ص<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

علاوة على ذلك ، كان هناك زيادة في الالتصاق بالبطانة النشطة (بمقدار 6. 3- أضعاف ؛ P.<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

الشكل 4. الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) من الفئران المصابة بداء السكري تظهر وظائف متغيرة على الرغم من تطبيع الجلوكوز. تم تمييز BMDMs من الفئران المصابة بداء السكري في 5 مليمول / لتر (ن =5 - 8). أ ، صورة تقدير التصاق BMDM للخلايا البطانية (ن =8). ب ، صورة التقدير الكمي لامتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة الأسيتيل بواسطة BMDMs ، الذي تم تطبيعه بواسطة رقم الخلية لكل صورة. صور التمثيلية (C) التصاق ثابتة للفلوريسنتلي (PKH67) المسمى BMDMs للخلايا البطانية و (D) صور خلية الرغوة الملطخة بالزيت (D) O (ORO) - DAPI. يتم عرض جميع البيانات على أنها متوسط ​​± SD ، وتمثل كل نقطة حيوانًا فرديًا (متوسط ​​4 صور للالتصاق الثابت وتكوين خلية الرغوة). تم تحليل البيانات عن طريق 2- way ANOVA مع Bonferroni post hoc test. IFN- يشير إلى interferon- ؛ و LPS ، عديدات السكاريد الدهنية. * ص<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم تؤدي إلى تصلب الشرايين

لذلك ، لاختبار الأهمية الوظيفية للمناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في تصلب الشرايين ، قمنا بزرع BM من التحكم في مستوى السكر في الدم أو الفئران المتبرعة بالسكري التي يسببها الستربتوزوتوسين (جلوكوز الدم ، 33.9 ± 6.9 مليمول / لتر) في معرض تصلب الشرايين (سكر الدم الطبيعي) Ldlr− / - الفئران المتلقية (الشكل 5 أ). في كل حالة ، كانت الفئران المانحة معدلة وراثيًا لـ GFP تحت سيطرة مروج CD68 البشري. 40 تم إظهار النقش الفعال والمكافئ من خلال تحليل التدفق الخلوي لـ PBMCs ، مما يؤكد وجود خلايا CD45 plus GFP plus إيجابية إما CD11b أو Ly6C ( الشكل IVa و IVb في ملحق البيانات). بعد 12 أسبوعًا من اتباع نظام غذائي غربي ، لم تكن هناك اختلافات في قياسات الدهون في الدم (الشكل IVc و IVd في ملحق البيانات) أو مجموعات فرعية من خلايا الدم البيضاء كما تم تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي (الشكل IVe في ملحق البيانات).

أظهرت الفئران التي تلقت BM السكري زيادة ملحوظة في تصلب الشرايين ، مع وجود أكثر من عبء تصلب الشرايين الأكبر في المتلقين غير المصابين بمرض السكر (مناطق اللويحة المتوسطة ، 44461 ميكرومتر مربع [النطاق الرباعي ، 18368-59597 ميكرومتر 2] مقابل 79809 ميكرومتر مربع [44745-177740 ميكرومتر مربع] ؛ مان ويتني ، ف =0. 036). أظهرت هذه الفئران أيضًا زيادة في محتوى البلاعم في اللويحات (P =0. 052 ؛ الشكل الخامس في ملحق البيانات) ، منطقة اللب النخرية الغنية بالدهون (2. 8- أضعاف ، P {{18) }}. 0076 ؛ الشكل VI أ في ملحق البيانات) ، ونسبة النواة النخرية الغنية بالدهون (2. 4- أضعاف ، P =0. 046 ؛ الشكل السادس ب في ملحق البيانات) ، ولكن بدون الاختلافات في محتوى الكولاجين (نسبة البلاك ؛ الشكل VIc و VId في ملحق البيانات) أو خلايا العضلات الملساء (نسبة البلاك ؛ الشكل VIe و VIf في ملحق البيانات).

إن المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في الخلايا الجذعية السرطانية مدفوعة بالتغيرات في التمثيل الغذائي التي تؤدي إلى إعادة البرمجة اللاجينية

نظرًا لإثبات أن BM من الفئران المصابة بارتفاع السكر في الدم قد عززت تصلب الشرايين ، جنبًا إلى جنب مع التعبير الجيني الالتهابي المستمر والاستجابات الوظيفية الموجودة في BMDM في المختبر ، فقد استنتجنا أن هذه الذاكرة كانت مظهرًا من مظاهر المناعة المدربة في الخلايا المشتقة من BM. ارتبطت المناعة المدربة بالتغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي التي تحث على ظهور علامات لاجينية طويلة الأمد ومغيرة للكروماتين مثل H3K4me3 و H3K27ac. ، الخلايا البائية ، الخلايا القاتلة الطبيعية ، الخلايا المتغصنة ، الخلايا الوحيدة ، الخلايا الحبيبية ، خلايا الكريات الحمر: CD3− ، CD4− ، B220− ، Ter119 ، Gr1− المستزرعة في ظروف ارتفاع الجلوكوز خارج الخلية أظهرت أيضًا زيادة في امتصاص الجلوكوز وإنتاج اللاكتات ، مما يشير إلى تحلل السكر غير المنتظم (ص<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

في لويحات جذر الأبهر ، كانت نسبة النوى الملطخة الملطخة بالبلعم الموجبة لـ H3K4me3 أعلى في الفئران التي تلقت BM من متبرعين بمرض السكري (1. 8- أضعاف ، P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

الشكل 5. نخاع العظم السكري (BM) يقود تصلب الشرايين على الرغم من تطبيع الجلوكوز لفترات طويلة. أ ، تخطيطي لتجربة زرع BM. ب ، تحليل التدفق الخلوي لمجموعات الكريات البيض المحيطية في الفئران بعد 12 أسبوعًا من زرع نخاع العظم. C ، صور جذر الشريان الأورطي التمثيلية من الفئران Ldlr التي تلقت إما متبرعًا بمرض السكري أو قرصًا مضغوطًا من متبرع للتحكم 68- GFP BM. تلوين Masson Trichrome (يسار) وتلطيخ التألق المناعي للخلايا الضامة المشتقة من زرع BM (يشير اللون الأخضر إلى البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) أو جميع الضامة (يشير اللون الأحمر إلى galectin -3 [GAL3]). تقدير حجم الصورة (D) حجم البلاك (P =0. 036). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ​​± SD ، تم تحليلها بواسطة 1- طريقة ANOVA مع اختبار Bonferroni اللاحق (B) ، أو متوسط ​​± نطاق رباعي ، تم تحليله بواسطة اختبار Mann-Whitney U (D) ؛ مراقبة n =6 ، مرض السكري =9. E ، صور جذر الأبهر التمثيلية من Ldlr - / - الفئران التي تلقت إما زراعة مرض السكري أو زرع BM. F ، التقدير الكمي للنسبة المئوية للنواة الملطخة الموجبة لـ H3K4me3 أو H3K27ac داخل المنطقة الإيجابية للبلاعم GAL3. تمثل كل نقطة بيانات حيوانًا فرديًا (متوسط ​​، 6 أقسام ؛ n=7 إلى 10). تظهر على أنها تعني ± SD. تحليل ANOVA أحادي الاتجاه. يشير BMDM إلى الضامة المشتقة من BM ؛ HSC ، الخلايا الجذعية المكونة للدم ؛ IFN- ، مضاد للفيروسات- ؛ و LPS ، عديدات السكاريد الدهنية. * ص<0.05.

لاستكشاف الصلة البيولوجية لهذه المجموعة من المناطق الجينومية غير المشفرة (مع التركيز على الوظيفة التنظيمية المفترضة لرابطة الدول المستقلة) ، تم تخصيص مناطق الكروماتين مع إمكانية الوصول المتزايدة في الخلايا المصابة بداء السكري إلى أقرب جينين (خلال 1 0 {{ 11}} 0 كيلوبايت) وتم تحليلها باستخدام أداة إثراء المناطق الجينومية للتعليقات التوضيحية. 33 كشف تحليل المسار هذا عن زيادة العديد من المسارات المرتبطة بالالتهاب ، بما في ذلك تنشيط الكريات البيض (3. 3- أضعاف ؛ FDR ، 0.0005) ) ، والجينات المرتبطة بتسامح LPS في الضامة (2. 7- fold ؛ FDR ، 0.0009). لفهم ما إذا كان ارتفاع الجلوكوز في عزلة يمكن أن يؤدي أيضًا إلى تعديل الكروماتين ، استخدمنا ATAC-seq للنظر في HSCs من الفئران المصابة بداء السكري وفئران التحكم في حالة عدم وجود تحفيز IL -1. أظهر HSCs غير المحفز 357 قمة تفاضلية (FDR أقل من أو يساوي 0.2) ، منها 51 بالمائة زادت إمكانية الوصول إلى الخلايا من أصل مصاب بمرض السكري مقارنةً بمجموعة التحكم ، مع وجود الغالبية في مناطق intronic (48 بالمائة) أو المناطق الجينية (21 بالمائة).

بالنظر إلى هذه النتائج في HSCs ، قمنا بعد ذلك بفحص إمكانية الوصول إلى الكروماتين والتعبير الجيني في مشتقات BMDMs الخاصة بهم. أجرينا ATAC-seq و RNA-seq على BMDMs من الفئران المصابة بمرض السكري تحت ظروف غير محفزة أو مسببة للالتهابات (LPS plus IFN-). أظهرت BMDMs من الفئران المصابة بداء السكري إمكانية الوصول إلى الكروماتين التفاضلي في ظل ظروف غير محفزة ، مع 1047 منطقة تفاضلية (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). مجتمعة ، تشير بيانات ATAC-seq و RNAseq إلى أن مرض السكري هوأ الضامة للاستجابة المبالغ فيها للمحفزات الالتهابية.

الشكل 6. يغير مرض السكري مستويات H3K4me3 و H3K27ac وإمكانية الوصول إلى الكروماتين. يقرأ مؤامرة MA لجميع مقاييس تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase في (A) غير محفز أو (B) الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) ، حيث تكون القمم مع إمكانية الوصول التفاضلية (معدل الاكتشاف الخاطئ)<0.05, fold change >1.5) باللون الوردي (1047 غير محفز ، 40 محفز ، ن =6). C ، المناطق المتغيرة من H3K4me3 و H3K27ac محددة كمياً بواسطة تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و BMDMs من مجموعة التحكم مقابل الفئران المصابة بداء السكري (ن =6 لكل مجموعة). D ، رسم بياني لمتوسط ​​تغطية H3K27ac و K3K4me3 في HSCs ، و BMDMs غير محفز ، و BMDMs المحفزة للالتهابات (عديد السكاريد الدهني [LPS] بالإضافة إلى interferon- [IFN]) في مواقع بدء النسخ ± 1 كيلو بايت من جينات ترميز البروتين القريبة من مناطق زيادة إمكانية الوصول في أنظمة BMDM غير المحفزة (مقابل عناصر التحكم ؛ n=405) ومقارنتها بمستويات الخلفية في المناطق غير المحددة.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0. 5 لكل منهما) ، قارنا تغير الطية لذروة ATAC-seq التفاضلية مقابل تغير الطية لـ DE. تم فحصها كمتغيرات مستمرة ، وكان هناك ارتباط قوي بين التعديلات في الكروماتين والتعبير عن الجينات القريبة (R =0. 65 ؛ P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 كيلو بايت من مواقع بدء النسخ المشروح. ركزنا على الجينات القريبة من هذه المعززات لأن مناطق محفز الجينات (مواقع بدء النسخ ± 1 كيلو بايت) تمثل الأهداف التنظيمية الأكثر احتمالا. حدد ATAC-seq 405 منطقة من الكروماتين المفتوح تفاضليًا (P.<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

الشكل 6. يغير مرض السكري مستويات H3K4me3 و H3K27ac وإمكانية الوصول إلى الكروماتين. يقرأ مؤامرة MA لجميع مقاييس تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase في (A) غير محفز أو (B) الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) ، حيث تكون القمم مع إمكانية الوصول التفاضلية (معدل الاكتشاف الخاطئ)<0.05, fold change >1.5) باللون الوردي (1047 غير محفز ، 40 محفز ، ن =6). C ، المناطق المتغيرة من H3K4me3 و H3K27ac محددة كمياً بواسطة تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و BMDMs من مجموعة التحكم مقابل الفئران المصابة بداء السكري (ن =6 لكل مجموعة). D ، رسم بياني لمتوسط ​​تغطية H3K27ac و K3K4me3 في HSCs ، و BMDMs غير محفز ، و BMDMs المحفزة للالتهابات (عديد السكاريد الدهني [LPS] بالإضافة إلى interferon- [IFN]) في مواقع بدء النسخ ± 1 كيلو بايت من جينات ترميز البروتين القريبة من مناطق زيادة إمكانية الوصول في أنظمة BMDM غير المحفزة (مقابل عناصر التحكم ؛ n=405) ومقارنتها بمستويات الخلفية في المناطق غير المحددة.

تضاءلت هذه الاختلافات في BMDMs (الشكل 6 د) ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى زيادة H3K27ac في الخلايا الأصلية غير السكري بعد التمايز. ومع ذلك ، تمت زيادة علامة H3K4me3 عند هؤلاء المروجين في HSC ، مع استمرار وجود اختلافات محددة في الضامة المتمايزة ، بما في ذلك بعد تحفيز السيتوكين (الشكل 6 د). يتوافق هذا النمط من علامات H3K27ac العابرة وعلامات H3K4me3 الثابتة مع النتائج التي توصلنا إليها في كل من زراعة الأنسجة (الشكل الثامن في ملحق البيانات) والكيمياء المناعية في البلاعم لوحة الماوس (الشكل 5E و 5 F).

ارتبطت مناطق الكروماتين المفتوحة تفاضليًا التي تم تحديدها بواسطة ATAC-seq ارتباطًا كبيرًا بالتغيرات في نسخ الجينات القريبة. علاوة على ذلك ، فإن القياس الكمي للاختلاف في إمكانية الوصول إلى الكروماتين (السكري مقابل التحكم) والمقارنة المباشرة مع التغيير في مستويات التعبير عن الرنا المرسال للجين القريب كانا مرتبطين بشدة (R =0. 5 ؛ P =6. 2e −15 ؛ الشكل 7 أ). لفحص هذه التأثيرات في المواقع الجينومية ذات الصلة ، قمنا بدمج بيانات ATAC-seq و H3K4me3 ChIP-seq و H3K27ac ChIP-seq في مروجي جينين متورطين سابقًا في مناعة مدربة ناتجة عن تحلل السكر ومع المنتجات المشاركة في قيادة الالتهاب (Il -6) وأيض الجلوكوز (Hk1). عرضت هذه الجينات مناطق من الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه في مواقع بدء النسخ ، مع قمم H3K4me3 و H3K27ac المرتبطة في هذه المواقع الجينومية (الشكل 7 ب).

لاكتساب نظرة ثاقبة حول عوامل النسخ التي قد تكون متورطة كوسيط لهذا النمط من المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم ، تم إجراء تحليل إثراء الحافز على مناطق الكروماتين مع زيادة إمكانية الوصول في ظل ظروف مرض السكري. تضمنت أشكال عامل النسخ المخصب بشكل ملحوظ RUNX1 (FDR ، 0. 0 001) ، والتي ارتبطت سابقًا بالذاكرة المناعية ، 46 بالإضافة إلى PU.1 (FDR ، 0.04) و CCCTC-ملزمة العامل (FDR ، 1.8 × 10 ؛ الشكل 8 أ). بعد أن أشركنا عامل النسخ RUNX147 بناءً على إمكانية الوصول إلى أشكال الربط ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت الجينات المستهدفة RUNX1 ممثلة بشكل كبير بين جينات DE في LPS بالإضافة إلى BMDM المحفز IFN. حدد هذا التحليل 95 من 1348 جينة DE كأهداف RUNX1 (P.<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

لتحديد ما إذا كان المظهر الوظيفي للوحة البلاعم البشرية يطابق تلك الموجودة في البلاعم الفأرية ، قمنا بمقارنتها بمجموعة من 39 جينة M1 و M2 بتعبير تم قياسه في BMDMs المحفزة من الفئران المصابة بداء السكري مقابل الفئران الضابطة (الشكل 3G). تم تلخيصها من خلال التغير الإيجابي أو السلبي في طية السجل (السكري مقابل السيطرة) ومقارنتها بالتغيرات المكافئة في البلاعم البشرية للمرضى المصابين بداء السكري من النوع 2 (مقابل السيطرة). أظهر اختبار فيشر الدقيق وجود علاقة معنوية بين BMDM الفأر ومجموعات بيانات بلاعم اللويحات البشرية للجينات المنتظمة أو الخاضعة للتنظيم في مرضى السكري مقابل الأشخاص الضابطين (P =0. 0155 ؛ نسبة الأرجحية ، 6.83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 جين مقارنة مع الضوابط المتطابقة غير السكري. أظهر تحليل إثراء مجموعة الجينات للجينات المتغيرة إثراءًا إيجابيًا في PBMCs المحفز لمرض السكري (مقابل عناصر التحكم) لمسارات Hallmark ، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية (P =1. 70 × 10-5) وإشارة IL -6 JAK STAT3 ( P =0. 0221) ، ومسارات Reactome ، بما في ذلك أنواع الأكسجين التفاعلية وإنتاج أنواع النيتروجين التفاعلية (P {{9}. 0049) ، IL- / IL- إشارات (P =0. 0110) ، ومستقبل شبيه بالرسم 1/2 تتالي (P =0. 0033). توضح هذه المسارات أن هذه الخلايا الطرفية أظهرت أيضًا خصائص تمهيدية مماثلة لتلك التي أبلغنا عنها في BMDMs من الفئران المصابة بداء السكري (الشكل 3 جرام).

أخيرًا ، لاستكشاف دور سببي محتمل لـ RUNX1 في استجابات المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم ، تمت استعادة BMDMs التي تم تمييزها سابقًا في الفسيولوجية أو الجلوكوز المرتفع إلى 5 مليمول / لتر من الجلوكوز ثم تحفيزها في غياب أو وجود RUNX الدوائي 1- مثبط محدد Ro 5-333551 (الشكل 8 د). أظهرت الخلايا المتمايزة في الجلوكوز المرتفع تعبيرًا متزايدًا عن Il -6 (2- fold، P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

الشكل 8. دور للمناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم RUNX1. تم تحديد أعلى 3 أشكال لعوامل النسخ في اختبار لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر الترانزبوساز (ATAC-seq) القمم المخصب تفاضليًا (A) HSC السكري غير المحفز (n =3) مقارنة بالخلايا الجذعية المكونة للدم غير المحفزة (HSCs ؛ n {{6 }}). تجميع هرمي غير خاضع للإشراف للجينات المعبر عنها تفاضليًا من تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لـ (B) السكري (n =6) ​​أو التحكم (n =6) نخاع العظم (BM) - الضامة المشتقة (BMDMs) محفز بعديد السكاريد الدهني (LPS) بالإضافة إلى الإنترفيرون (IFN-). التكتل الهرمي غير الخاضع للإشراف للجينات المعبر عنها تفاضليًا من (C) السكري (n =8) أو التحكم (n =16) يلتقط الليزر عينات البلاعم المشقوقة الدقيقة من لوحة السباتي البشري. B و C ، عامل النسخ المرتبط بـ Runt 1 (Runx1) الجينات المستهدفة (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

مناقشة

تستمر المعدلات العالية لمضاعفات القلب والأوعية الدموية لدى مرضى السكري على الرغم من التحكم المكثف في الجلوكوز .52 هنا ، نقدم دليلًا على أن ارتفاع السكر في الدم يحفز المناعة المدربة في HSCs والبلاعم وأن هذا يؤدي إلى تفاقم تصلب الشرايين بشكل ملحوظ. لقد أظهرنا أن ارتفاع السكر في الدم يؤدي إلى تعديلات مستمرة في BM HSCs عن طريق تحفيز تحلل السكر الهوائي ، مما يؤدي إلى أنماط معينة من إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، مع وجود دليل على حالة تمهيدية التهابية تستمر في الضامة المتباينة. تشير نتائجنا إلى عوامل النسخ ، ولا سيما RUNX1 ، كوسيط للمناعة المدربة. أدى التثبيط الدوائي لـ RUNX1 إلى إزالة مظاهر المناعة المدربة الناتجة عن ارتفاع السكر في الدم في المختبر.

يمكن للتغييرات في التمثيل الغذائي الخلوي أن تحفز المناعة المدربة ، وهو مصطلح يشير إلى الذاكرة المناعية الفطرية التي يمكن أن تتطور بعد التحفيز القصير بالمنتجات الميكروبية أو المواد المسببة للتصلب العصيدي ، بما في ذلك LDL المؤكسد والبروتين الدهني (أ) .53 على سبيل المثال ، المناعة المدربة التي يسببها الجلوكان ، أحد مكونات جدار الخلية من المبيضات البيضاء ، يتم توسطه من خلال تنشيط مسار الدكتين -1 - Akt – mTOR – HIF -1 ، والذي يتسبب في التحول من الفسفرة المؤكسدة إلى التحلل الهوائي (تأثير واربورغ). 18 في الواقع ، تعمل العديد من المستقلبات من تحلل السكر ودورة حمض الكربوكسيل كعوامل مساعدة للإنزيمات المعدلة للهيستون ، والتي بدورها تحدد إمكانية الوصول إلى الكروماتين ؛ على سبيل المثال ، تتطلب هيستون أسيتيل ترانسفيراز و ديستيلاسز أسيتيل CoA و NAD plus ، في حين أن demethylases مثل Tet و JmjC يستخدم -ketoglutarate كعامل مساعد. أستلة مشتقة من زيادة مستويات اللاكتات

أدت الروابط المباشرة بين استقلاب الجلوكوز والتعديلات اللاجينية ، إلى جانب الملاحظات التي تشير إلى ذاكرة فرط سكر الدم لدى مرضى السكري ، إلى فرضية أن ارتفاع السكر في الدم نفسه قد يؤدي إلى تغييرات في التمثيل الغذائي الخلوي ، مما يؤدي إلى ذاكرة مناعية فطرية في مرض السكري. في حالة الجلوكان ، أدى التحلل الجلدي الهوائي المتزايد في البلاعم إلى زيادة هيستون 3 Lys4 ثلاثي الميثيل (H3K4me3) وأسيتيل هيستون 3 Lys27 (H3K27ac). تمت زيادة كل من علامات تعديل الكروماتين هذه في سياق تحلل السكر المرتفع الناتج عن الجلوكوز. كما هو موضح هنا وفي الدراسات السابقة ، كان هناك إثراء لـ H3K4me3 على محفزات الجينات المرتبطة بالالتهاب (على سبيل المثال ، Il -6) وأيض الجلوكوز (على سبيل المثال ، Hk1). تم الإبلاغ عن أن الفومارات تعمل كمضادات للهيستون و demethylases للحمض النووي ، 54 وبما يتفق مع هذا ، وجدنا أيضًا أن مستقلبات دورة حمض الكربوكسيليك السكسينات والمالات تزداد في خلايا فرط سكر الدم.

أظهر Metropolis وآخرون أنه في سياق المناعة الفطرية المستحثة بالجلوكان في أسلاف الخلايا النخاعية ، يمكن للسيتوكينات التوسط في المناعة المدربة. على وجه التحديد ، تثبيط IL -1 بمضاد مستقبلات anakinra يثبط المناعة المدربة التي يسببها الجلوكان. لقد ثبت أيضًا أن النظام الغذائي الغربي يحفز إعادة البرمجة اللاجينية في الخلايا السلفية للتضخم ، مما يؤدي إلى مناعة مدربة بوساطة التهاب الجراثيم ، مما يدل على تورط مسارات إشارات IL -1 في المناعة المدربة .56 نظرًا لأن IL -1 يتوسط عمليات مرضية متعددة في مرض السكري ، 44 قمنا بفحص ما إذا كان IL -1 سيزيد من تأثيرات الجلوكوز المرتفع في تطوير المناعة المدربة. على الرغم من أن داء السكري وحده أظهر تأثيرات على إمكانية الوصول إلى الكروماتين (مع تحليل الحافز الذي يتضمن عامل ربط PU.1 و RUNX1 و CCCTC) ، فإن تأثيرات IL -1 ، في سياق الخلايا التي تم تحضيرها بواسطة مرض السكري ، كانت أكثر وضوحًا ( و ERG و ZNF263 [بروتين إصبع الزنك 263] و RUNX1). يشير هذا إلى علاقة هرمية حيث كانت البلاعم تستعد بسبب ارتفاع السكر في الدم ولكنها تظهر المزيد من التغييرات المزهرة استجابةً لمحفز ثانٍ .43 في الواقع ، من المعروف جيدًا أن التغيرات في حالات الكروماتين عند المروجين يمكن أن تكمن وراء التفاعلات الوظيفية المعقدة بين المنبهات المختلفة المنشطة للبلاعم. على سبيل المثال ، على الرغم من أن IFN- غير قادر على تنشيط العديد من الجينات التي تحفز LPS ، إلا أنه يمكن أن يحفز أستلة هيستون وإعادة تشكيل الكروماتين في معززاتهم ، وبالتالي تهيئة الخلية للتنشيط المستقبلي استجابة لـ LPS.

كشف تحليل الحافز في مواقع الكروماتين المفتوح عن إثراء في مواقع ربط RUNX1. من منظور وظيفي ، يلزم RUNX1 لتوليد HSCs وصيانته وتمييز السلالات المتنوعة .58 في الخلايا الوحيدة والبلاعم ، يتعاون RUNX1 مع PU.1 (متضمن أيضًا هنا) لتنظيم عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (عامل تحفيز المستعمرة) -1) ، وهو أمر ضروري لبقاء الضامة وتمايزها وتوسعها. 59 وله صلة بتأثيرات الذاكرة الوظيفية التي لاحظناها في التصاق الخلية الأحادية ، يعتبر RUNX1 أيضًا عنصر تحكم مهم في تفاعلات الخلايا البطانية أحادية الخلية من خلال تنظيم المستضد المرتبط بوظيفة الخلايا الليمفاوية 1 / CD11a.31 أخيرًا ، يؤدي الالتهاب 4-بوساطة المستقبل الشبيه بـ Toll والإفراط في التعبير RUNX1 إلى زيادة إنتاج المستقبل الشبيه بـ Toll-induced 4-induced IL -6 و IL -1 من خلال ربط RUNX1 بالوحدة الفرعية للعامل النووي κB p50 ، بالتآزر كمنشط نسخي.

لذلك ، نحن ، الجينات المتصالبة تحت سيطرة مفترضة لـ RUNX1 مع ملفات تعريف النسخ للخلايا المشتقة من BMDMs للماوس وفي الضامة من بيئة بشرية في الجسم الحي ذات صلة. أظهرت البلاعم الضامة لتصلب الشرايين البشري و BMDMs ، في وجود مرض السكري ، وجود جينات منظمة DE of RUNX 1- ، بما في ذلك العديد من الجينات المرتبطة سابقًا بالالتهاب وتصلب الشرايين. أن البلاعم البشرية المشتقة من مرض السكري والتي تمت تربيتها لمدة 6 أيام في المختبر تحافظ على التهيئة المسببة للالتهابات وفرط الاستقطاب إلى النمط الظاهري للالتهاب عند تحفيزها باستخدام LPS و IFN- أو عامل نخر الورم-.

ومن المثير للاهتمام أن بعض الجينات المستهدفة RUNX1 تعرض تعبيرًا متزايدًا في البلاعم الضامة من مرضى السكري ، مثل CRNKL1 و PLA2G5 ، في حين أن البعض الآخر ، مثل ZNF32 (بروتين إصبع الزنك 32) و NUP214 (نوكليوبورين 214) ، أظهر تعبيرًا أقل في مرضى السكري مقابل غير السكري. الضامة البلاك. على الرغم من أن هذا قد يبدو غير متسق ظاهريًا ، فقد تم إثبات أن RUNX1 يعزز التعبير الجيني ويعمل كمثبط للنسخ. مع الكروماتين يمكن أن يساهم في تحديد نسل الخلية. على سبيل المثال ، يؤدي تعطيل تفاعل RUNX1 أثناء الانقسام الفتيلي إلى الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة. وقد أدى التثبيط الدوائي لـ RUNX1 مع Ro 5-3335 إلى تطبيع التعبير الجيني الالتهابي المتغير المرتبط بالمناعة المدربة الناتجة عن فرط سكر الدم في المختبر. يوفر التدخل المستهدف ضد RUNX1 دليلًا إضافيًا على تورط RUNX1 في التأثيرات النهائية للمناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في البلاعم.

يمكن أن يؤدي تحريض المناعة المدربة التي يسببها ارتفاع السكر في الدم في الضامة الطرفية وحدها إلى تطور المرض ، ولكن نظرًا للتأثيرات طويلة المدى للمناعة المدربة وقصر العمر نسبيًا للخلايا النخاعية المحيطية ، فقد استنتجنا أن المناعة المدربة من المحتمل أيضًا أن تكون قد تم تحفيزها على مستوى HSCs ، كما تم إثباته مؤخرًا للنظام الغذائي من النوع الجلوكان والغربي. يقود تطور تصلب الشرايين ، علم الأمراض المهم مع عنصر التهابي لا يتجزأ. كان لزرع BM من الفئران المصابة بداء السكري إلى الفئران المعرضة لتصلب الشرايين السكرية تأثيرات ملحوظة على تطور الآفة وارتبط بزيادة النواة النخرية الغنية بالدهون ، بما يتفق مع الشكل العدواني لتصلب الشرايين الذي شوهد في مرض السكري لدى البشر .65

بنيت هذه الدراسة حول فحص آثار ارتفاع السكر في الدم / ارتفاع السكر في الدم. للسماح لنا بتوصيف الآثار طويلة المدى لارتفاع السكر في الدم ، السمات الأساسية لمرض السكري ، استخدمنا نموذج الفئران الستربتوزوتوسين لمرض السكري بدلاً من نموذج الفئران السكري من النوع 2 ، والذي ربما يكون قد أدمج ميزات أكثر دقة لتلك المتلازمة ولكنه من شأنه أن يربك بشكل فعال دراسات حول تأثيرات الجلوكوز. هناك اختلافات جوهرية مهمة بين مرض السكري من النوع الأول والنوع الثاني. ومع ذلك ، فإن ارتفاع السكر في الدم شائع في تشخيصهم ، ويؤدي إلى مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في كل منها ، وكان الهدف الأساسي للعلاجات والمراقبة لكلا النوعين من مرض السكري لسنوات عديدة. نتوقع أن يتم تطوير المناعة المدربة التي تم تحديدها حديثًا والناجمة عن ارتفاع السكر في الدم والتي تم الإبلاغ عنها هنا في المستقبل لتأخذ في الاعتبار تعديلًا أكثر تحديدًا حول العديد من التأثيرات المحتملة الأخرى (على سبيل المثال ، السكر الغذائي ، 66 نمطًا لارتفاع الجلوكوز ، 67 فرط شحميات الدم المصاحب).

النتائج التي توصلنا إليها لها آثار مهمة على إدارة مضاعفات تصلب الشرايين لمرض السكري. الأهم من ذلك ، أن الخصائص الأولية للخلايا النخاعية وسلائف BM تستمر بعد تطبيع الجلوكوز في الدم. قد يساعد هذا في تفسير عدم فعالية العلاجات التقليدية ويتحدى بشكل أساسي نهج إدارة مخاطر الأوعية الدموية ومضاعفات مرض السكري. كما أن تحديد الدوافع الأيضية والتعديلات الوراثية اللاجينية الخاصة يوصي أيضًا بأهداف علاجية جديدة محتملة.

معلومات المقالة

تم استلامه في 27 فبراير 2020 ؛ قبلت في 23 يونيو 2021.

الانتماءات

قسم طب القلب والأوعية الدموية ، قسم الطب في رادكليف ، جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة (LE ، NA ، ATB ، JB ، JTC ، MA ، KZ ، RA ، TJC ، MJC ، KMC ، RC ، RPC). مركز أبحاث CeMM للطب الجزيئي التابع للأكاديمية النمساوية للعلوم ، فيينا ، النمسا (TK ، AFR ، CB). قسم الكيمياء الفيزيولوجية 2 ، قسم الكيمياء الحيوية الطبية والفيزياء الحيوية ، معهد كارولينسكا ، ستوكهولم ، السويد (HG-A. ، CEW). قسم طب الجهاز التنفسي والحساسية (HG-A. ، CEW) وقسم الطب (H7) (JL ، MR) ، مستشفى جامعة كارولينسكا ، ستوكهولم ، السويد. معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم ، جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة (ALC ، TEK ، IAU). معهد الذكاء الاصطناعي ودعم القرار ، مركز الإحصاء الطبي والمعلوماتية والأنظمة الذكية ، الجامعة الطبية في فيينا ، النمسا (CB). Bioinfo ، Plantagenet ، ON ، كندا (MEL). قسم الطب الباطني ، المركز الطبي بجامعة رادبود ، نيميغن ، هولندا (NPR. ، MGN). قسم علم الجينوم وتنظيم المناعة ، معهد العلوم الحياتية والطبية (LIMES) ، جامعة بون ، ألمانيا (MGN).

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون ليزا هيذر وماريا دا لوز سوزا فيالو وتوماس ميلن على مساعدتهم. صممت RPC و NA و LE الدراسة. أجرى LE جميع التجارب في المختبر ، وتحليلات التعبير الجيني ، والتخدير المناعي الموصوف. ساهم ماجستير في الدراسات في العينات البشرية. CEW و HG-A. إجراء عمليات التمثيل الغذائي القائمة على قياس الطيف الكتلي. قامت JTC بعمل عمل LCM للبلاك البشري وإعداد الصفيف. أجرى LE تجارب Seahorse Bioanalyser بتوجيه من JB وإشراف MJCALC وأجرى تحليل فرز الخلايا. أعدت LE عينات RNA-seq. أعدت LE عينات ATAC-seq تحت إشراف TEK وإشراف IAU. أجرى زمالة المدمنين المجهولين جميع الاستعدادات الخلوية لتسلسل الشريحة. تم إجراء التسلسل بواسطة TK و AFR تحت إشراف CB. قام كل من MEL و ATB بتشغيل محاذاة البيانات المتسلسلة ، والتطبيع ، ومراقبة الجودة ، مع إجراء LE لتحليل المصب. قام كل من MEL و ATB بتحليل بيانات الصفيف والتسلسل. قادت KZ و RA و RC التحقيقات التي أجريت على الحيوانات. شاركت LE و NA و TJC و NPR و MGN في التصميم التجريبي والتنفيذ. أعدت كل من RPC و LE و NA و MEL المخطوطة. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على التقديم النهائي للمخطوطة.

مصادر التمويل

تم دعم هذا العمل من قبل مركز التميز البحثي التابع لمؤسسة القلب البريطانية في أكسفورد (RE / 13/1/30181) ، ومنحة مشروع مؤسسة القلب البريطانية (Drs Akbar and Choudhury: PG / 18/53/33895) ، والمعهد الوطني للبحوث الصحية مركز أكسفورد للأبحاث الطبية الحيوية ، اتحاد الاستقلاب المناعي الثلاثي - مؤسسة نوفو نورديسك (منحة NNF15CC0018486 ؛ الدكتور شودري ، أودالوفا ، ريدين ، شانون ، ويلوك) ، الالتهاب المرتبط بالأيض في أمراض السكري - الطيف: مؤسسة نيو تارجتس بيوند جلوكوز (نوردوف) ، منحة 0064142 ؛ دكتور شودري ، أودالوفا ، ريدن ، وشانون) ، ودكتوراه في مؤسسة القلب البريطانية لمدة 4- عام. المنحة الدراسية ودوريس فيلد تراست (د. إدغار). تم تمويل مجموعة الجينوم عالية الإنتاجية في مركز Wellcome Trust للوراثة البشرية من خلال مرجع منحة Wellcome Trust 090532 / Z / 09 / Z ومنحة MRC Hub G 0900747 91070. مرفق التسلسل الطبي الحيوي في مركز أبحاث الطب الجزيئي التابع لأكاديمية العلوم النمساوية في فيينا ، النمسا. تلقى الدكتوران Riksen و Netea تمويلًا من برنامج Horizon 2020 للأبحاث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة 667837. وحصل الدكتور نيتيا على دعم من ERC Consolidator Grant (رقم 310372) والمنظمة الهولندية للبحث العلمي.

الإفصاحات

لا أحد.

المواد التكميلية

أرقام ملحق البيانات من الأول إلى الحادي عشر

ملفات Excel التكميلية للبيانات من الأول إلى السابع

مراجع

1. جمعية السكري الأمريكية. أمراض القلب والأوعية الدموية وإدارة المخاطر. رعاية مرضى السكري. 2015 ؛ 38: S49-S57. دوى: 10.2337 / العاصمة 15- S011

2. Nathan DM ، Cleary PA ، Backlund JY ، Genuth SM ، Lachin JM ، Orchard TJ ، Raskin P ، Zinman B ؛ مجموعة أبحاث دراسة السيطرة على مرض السكري ومضاعفاته / وبائيات التدخلات ومضاعفات مرض السكري (DCCT / EDIC). العلاج المكثف لمرض السكر وأمراض القلب والأوعية الدموية لدى مرضى السكري من النوع الأول. إن إنجل جي ميد. 2005 ؛ 353: 2643-2653. دوى: 10.1056 / NEJMoa052187

3. Nathan DM ، Genuth S ، Lachin J ، Cleary P ، Crofford O ، Davis M ، Rand L ، Siebert C ، مجموعة أبحاث التحكم في مرض السكري والمضاعفات التجريبية. تأثير العلاج المكثف لمرض السكري على تطور وتطور المضاعفات طويلة الأمد في داء السكري المعتمد على الأنسولين. إن إنجل جي ميد. 1993 ؛ 329: 977-986. دوى: 10.1056 / NEJM199309303291401

4. ACCORD ، Gerstein HC ، Miller ME ، Genuth S ، Ismail-Beigi F ، Buse JB ، Goff DC Jr ، Probstfield JL ، Cushman WC ، Ginsberg HN ، Bigger JT ، et al. الآثار طويلة المدى لخفض الجلوكوز المكثف على نتائج القلب والأوعية الدموية. إن إنجل جي ميد. 2011 ؛ 364: 818-828. دوى: 10.1056 / NEJMoa1006524

5. Zinman B و Wanner C و Lachin JM و Fitchett D و Bluhmki E و Hantel S و Mattheus M و Devins T و Johansen OE و Woerle HJ وآخرون ؛ محققو نتائج EMPA-REG. إمباغليفلوزين ، نتائج القلب والأوعية الدموية ، والوفيات في مرض السكري من النوع 2. إن إنجل جي ميد. 2015 ؛ 373: 2117-2128. دوى: 10.1056 / NEJMoa1504720

6. نيومان دينار ، فاني إيه كيه ، أليمان جو ، وينتراوب إتش إس ، بيرغر جي إس ، شوارتزبارد أريزونا. المشهد المتغير لعلاج مرض السكري للحد من مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية: مراجعة JACC الحديثة. J آم كول كارديول. 2018 ؛ 72: 1856-1869. doi: 10.1016 / j.jacc.2018.07.071

7. تشالمرز ي ، كوبر مي. UKPDS وتأثير الإرث. إن إنجل جي ميد. 2008 ؛ 359: 1618-1620. دوى: 10.1056 / NEJMe0807625

8. مور كي جيه ، شيدي إف جي ، فيشر إي إيه. البلاعم في تصلب الشرايين: توازن ديناميكي. نات ريف إمونول. 2013 ؛ 13: 709-721. دوى: 10.1038 / nri3520

9. Martinez FO ، Gordon S. نموذج M1 و M2 لتنشيط البلاعم: حان وقت إعادة التقييم. ممثل رئيس F1000 .2014 ؛ 6:13. دوى: 10.12703 / P 6-13

10. Parathath S، Grauer L، Huang LS، Sanson M، Distel E، Goldberg IJ، Fisher EA. يؤثر مرض السكري سلبًا على البلاعم أثناء تراجع اللويحات المتصلبة في الفئران. السكري. 2011 ؛ 60: 1759-1769. دوى: 10.2337 / ديسيبل 10-0778

11. Shanmugam N ، Reddy MA ، Guha M ، Natarajan R. تعبير مرتفع للجلوكوز عن جينات السيتوكين والكيماويات المنشطة للالتهابات في الخلايا الأحادية. السكري. 2003 ؛ 52: 1256-1264. دوى: 10.2337 / مرض السكري .52.5.1256

12. O'Neill LA، Pearce EJ. يتحكم التمثيل الغذائي المناعي في الخلية المتغصنة ووظيفة الضامة. J إكسب ميد. 2016 ؛ 213: 15-23. دوى: 10.1084 / jem.20151570

13. Vats D و Mukundan L و Odegaard JI و Zhang L و Smith KL و Morel CR و Wagner RA و Greaves DR و Murray PJ و Chawla A. التمثيل الغذائي المؤكسد و PGC -1 بيتا يخفف الالتهاب الناتج عن البلاعم. ميتاب الخلية. 2006 ؛ 4: 13-24. دوى: 10.1016 / j.cmet.2006.05.011

14. Tannahill GM ، Curtis AM ، Adamik J ، Palsson-McDermott EM ، McGettrick AF ، Goel G ، Frezza C ، Bernard NJ ، Kelly B ، Foley NH ، et al. السكسينات هو إشارة التهابية تحفز IL -1 من خلال HIF -1. طبيعة. 2013 ؛ 496: 238-242. دوى: 10.1038 / nature11986

15. رينر ك ، سنجر ك ، كوهل جنرال إلكتريك ، جيسلر إيك ، بيتر ك ، سيسكا بي جيه ، كروتز إم. السمات المميزة الأيضية للورم والخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم. الجبهة المناعية. 2017 ؛ 8: 248. دوى: 10.3389 / fimmu.2017.00248

16. Stienstra R، Netea-Maier RT، Riksen NP، Joosten LAB، Netea MG. إعادة برمجة محددة ومعقدة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا النخاعية أثناء الاستجابات المناعية الفطرية. ميتاب الخلية. 2017 ؛ 26: 142-156. دوى: 10.1016 / j.cmet.2017.06.001

17. Bekkering S، Arts RJW، Novakovic B، Kourtzelis I، van der Heijden CDCC، Li Y، Popa CD، Ter Horst R، van Tuijl J، Netea-Maier RT، et al. الحث الأيضي للمناعة المدربة من خلال مسار الميفالونات. خلية. 2018 ؛ 172: 135–146.e9. دوى: 10.1016 / j.cell.2017.11.025

18. Cheng SC ، Quintin J ، Cramer RA ، Shepardson KM ، Saeed S ، Kumar V ، Giamarellos-Bourboulis EJ ، Martens JH ، Rao NA ، Aghajanirefah A ، et al. mTOR- و HIF -1 - تحلل السكر الهوائي كوسيط كأساس استقلابي للمناعة المدربة. علوم. 2014 ؛ 345: 1250684. دوى: 10.1126 / العلوم .1250684

19. Donohoe DR، Bultman SJ. علم الوراثة الاستقلابية: العلاقات المتبادلة بين استقلاب الطاقة والتحكم اللاجيني للتعبير الجيني. J خلية فيزيول. 2012 ؛ 227: 3169-3177. دوى: 10.1002 / jcp.24054

20. Mitroulis I ، Ruppova K ، Wang B ، Chen LS ، Grzybek M ، Grinenko T ، Eugster A ، Troullinaki M ، Palladini A ، Kourtzelis I ، et al. يعد تعديل أسلاف تكوين النخاع جزءًا لا يتجزأ من المناعة المدربة. خلية. 2018 ؛ 172: 147–161.e12. دوى: 10.1016 / j.cell.2017.11.03421. Choudhury RP، Rong JX، Trogan E، Elmalem VI، Dansky HM، Breslow JL، Witztum JL، Fallon JT، Fisher EA. البروتينات الدهنية عالية الكثافة تؤخر تطور تصلب الشرايين وتعيد تشكيل الآفات بشكل إيجابي دون قمع مؤشرات الالتهاب أو الأكسدة. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 ؛ 24: 1904-1909. دوى: 10.1161 / 01.ATV.0000142808.34602.25

22. Feig JE، Vengrenyuk Y، Reiser V، Wu C، Statnikov A، Aliferis CF، Garabedian MJ، Fisher EA، Puig O. يتسم انحدار تصلب الشرايين بتغيرات واسعة في ترنسكريبتوم اللويحة الضامة. بلوس واحد. 2012 ؛ 7: e39790. دوى: 10.1371 / journal.pone.0039790

23. Trogan E، Choudhury RP، Dansky HM، Rong JX، Breslow JL، Fisher EA. تحليل تشريح دقيق لالتقاط الليزر للتعبير الجيني في البلاعم من آفات تصلب الشرايين للفئران التي تعاني من نقص البروتين الشحمي. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ؛ 99: 2234-2239. دوى: 10.1073 / pnas.042683999

24. Huber W ، Carey VJ ، Gentleman R ، Anders S ، Carlson M ، Carvalho BS ، Bravo HC ، Davis S ، Gatto L ، Girke T ، وآخرون. تنظيم التحليل الجيني عالي الإنتاجية باستخدام الموصل الحيوي. طرق نات. 2015 ؛ 12: 115 - 121. دوى: 10.1038 / نميث .3252

25. Dunning MJ ، Smith ML ، Ritchie ME ، Tavaré S. Beadarray: فئات R وطرق البيانات المستندة إلى حبة Illumina. المعلوماتية الحيوية. 2007 ؛ 23: 2183-2184. دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btm311

26. ريتشي إم إي ، بيبسون بي ، وو دي ، هو واي ، لو سي دبليو ، شي دبليو ، سميث جي كي. قوة Limma تحليلات التعبير التفاضلي لدراسات تسلسل الحمض النووي الريبي ودراسات ميكروأري. الدقة الأحماض النووية. 2015 ؛ 43: e47. دوى: 10.1093 / nar / gkv007

27. Kamleh MA، Snowden SG، Grapov D، Blackburn GJ، Watson DG، Xu N، Ståhle M، Wheelock CE. يكشف استقلاب LC-MS لمرضى الصدفية عن زيادات تعتمد على شدة المرض في الأحماض الأمينية المنتشرة والتي يتم تحسينها عن طريق العلاج المضاد لعامل عامل نخر الورم. J بروتيوم ريس. 2015 ؛ 14: 557-566. دوى: 10.1021 / pr500782g

28. Buenrostro JD، Wu B، Chang HY، Greenleaf WJ. تسلسل ATAC: طريقة لفحص جينوم إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. بيول بروتوكولي بالعملة. 2015 ؛ 109: 21.29.1–21.29.9. دوى: 10.1002 / 0471142727.mb2129s109

29. Zhang Y ، Liu T ، Meyer CA ، Eeckhoute J ، Johnson DS ، Bernstein BE ، Nusbaum C ، Myers RM ، Brown M ، Li W ، et al. التحليل القائم على نموذج لـ ChIPSeq (MACS). جينوم بيول. 2008 ؛ 9: R137. دوى: 10.1186 / جيجابايت -2008-9-9- r137

30. Ross-Innes CS ، Stark R ، Teschendorff AE ، Holmes KA ، Ali HR ، Dunning MJ ، Brown GD ، Gojis O ، Ellis IO ، Green AR ، وآخرون. يرتبط ارتباط مستقبلات هرمون الاستروجين التفاضلي بالنتائج السريرية لسرطان الثدي. طبيعة. 2012 ؛ 481: 389-393. دوى: 10.1038 / nature10730

31. Puig-Kröger A و Sanchez-Elsner T و Ruiz N و Andreu EJ و Prosper F و Jensen UB و Gil J و Erickson P و Drabkin H و Groner Y وآخرون. تعمل عوامل RUNX / AML و C / EBP على تنظيم تعبير CD11a الخاص بإنتجرين في الخلايا النخاعية من خلال العناصر التنظيمية المتداخلة. دم. 2003 ؛ 102: 3252–3261. دوى: 10.1182 / دم -2003-02-0618

32. McLean CY، Bristor D، Hiller M، Clarke SL، Schaar BT، Lowe CB، Wenger AM، Bejerano G. GREAT يحسن التفسير الوظيفي لمناطق رابطة الدول المستقلة. Nat Biotechnol. 2010 ؛ 28: 495-501. دوى: 10.1038 / لا .1630

33. ماتشانيك ف ، بيلي تل. MEME-ChIP: تحليل عزر لمجموعات بيانات DNA كبيرة. المعلوماتية الحيوية. 2011 ؛ 27: 1696–1697. دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btr189

34. Dobin A، Davis CA، Schlesinger F، Drenkow J، Zaleski C، Jha S، Batut P، Chaisson M، Gingeras TR. STAR: تقويم RNA-seq الشامل فائق السرعة. المعلوماتية الحيوية. 2013 ؛ 29: 15-21. دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / bts635

35. مكارثي دي جي ، تشين واي ، سميث جي كي. تحليل التعبير التفاضلي لتجارب RNA-Seq متعددة العوامل المتعلقة بالاختلاف البيولوجي. الدقة الأحماض النووية. 2012 ؛ 40: 4288-4297. دوى: 10.1093 / nar / gks042

36. Kolde R. Pretty Heatmap. 2015. تم الوصول إليه في 24 يونيو 2021. https://rdrr.io/ can / heatmap /

37. Freemerman AJ، Johnson AR، Sacks GN، Milner JJ، Kirk EL، Troester MA، Macintyre AN، Goraksha-Hicks P، Rathmell JC، Makowski L. النمط الظاهري المسببة للالتهابات. J بيول كيم. 2014 ؛ 289: 7884-7896. دوى: 10.1074 / jbc.M113.522037

38. Herbin O ، Regelmann AG ، Ramkhelawon B ، Weinstein EG ، Moore KJ ، Alexandropoulos K. يتم تنظيم التصاق Monocyte وتجنيد اللويحات أثناء تطور تصلب الشرايين بواسطة بروتين المهايئ ChatH / SHEP1. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016 ؛ 36: 1791-1801. دوى: 10.1161 / ATVBAHA.116.308014

39. Luo Y، Duan H، Qian Y، Feng L، Wu Z، Wang F، Feng J، Yang D، Qin Z، Yan X. Macrophagic CD146 يعزز تكوين خلايا الرغوة والاحتفاظ بها أثناء تصلب الشرايين. دقة الخلية. 2017 ؛ 27: 352–372. دوى: 10.1038 / كر.2017.8

40. Iqbal AJ ، McNeill E ، Kapellos TS ، Regan-Komito D ، Norman S ، Burd S ، Smart N ، Machemer DE ، Stylianou E ، McShane H ، et al. تسمح الفئران المعدلة وراثيًا GFP بمروج CD68 البشري بتحليل التمايز بين الخلية الواحدة إلى الضامة في الجسم الحي. دم. 2014 ؛ 124: e33-e44. دوى: 10.1182 / دم -2014-04-568691

41. Arts RJW و Carvalho A و La Rocca C و Palma C و Rodrigues F و Silvestre R و Kleinnijenhuis J و Lachmandas E و Gonçalves LG و Belinha A et al. مسارات التمثيل الغذائي المناعي في المناعة المدربة التي يسببها BCG. مندوب الخلية .2016 ؛ 17: 2562-2571. دوى: 10.1016 / j.celrep.2016.11.011

42. Moorlag SJCFM، Röring RJ، Joosten LAB، Netea MG. دور عائلة إنترلوكين -1 في المناعة المدربة. إمونول القس .2018 ؛ 281: 28-39. دوى: 10.1111 / أو .12617

43. Herder C، Dalmas E، Böni-Schnetzler M، Donath MY. مسار IL -1 في مرض السكري من النوع 2 ومضاعفات القلب والأوعية الدموية. اتجاهات Endocrinol Metab. 2015 ؛ 26: 551-563. دوى: 10.1016 / j.tem.2015.08.001

44. Engelbertsen D و Rattik S و Wigren M و Vallejo J و Marinkovic G و Schiopu A و Björkbacka H و Nilsson J و Bengtsson E. IL -1 R و MyD88 في خلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية تعزز مناعة Th17 وتصلب الشرايين . Cardiovasc Res. 2018 ؛ 114: 180-187. دوى: 10.1093 / cvr / cvx196

45. Nagareddy PR ، Kraakman M ، Masters SL ، Stirzaker RA ، Gorman DJ ، Grant RW ، Dragoljevic D ، Hong ES ، Abdel-Latif A ، Smyth SS ، et al. تعمل الخلايا الضامة للأنسجة الدهنية على تعزيز تكون النخاع و كثرة الوحيدات في السمنة. ميتاب الخلية. 2014 ؛ 19: 821-835. دوى: 10.1016 / j.cmet.2014.03.029

46. ​​Bevington SL، Cauchy P، Piper J، Bertrand E، Lalli N، Jarvis RC، Gilding LN، Ott S، Bonifer C، Cockerill PN. يرتبط تحضير الكروماتين المحرض بإنشاء ذاكرة مناعية في الخلايا التائية. EMBO J. 2016 ؛ 35: 515-535. دوى: 10.15252 / bj.201592534

47. Buske FA، Bodén M، Bauer DC، Bailey TL. تعيين أدوار لأشكال تنظيم الحمض النووي باستخدام علم الجينوم المقارن. المعلوماتية الحيوية. 2010 ؛ 26: 860 - 866. دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btq049

48. بويغ أو ، يوان ج ، ستيبانيانتس إس ، زيبا آر ، زي باند إي ، موريس إم ، كولتر إس ، يو إكس ، مينكي جي ، وودز جي ، وآخرون. توقيع التعبير الجيني الذي يصنف البلاك المتصلب العصيدي البشري من خلال حالة الالتهاب النسبية. سير كارديوفاسك جينيت. 2011 ؛ 4: 595-604. دوى: 10.1161 / CIRCGENETICS.111.960773

49. Turner RJ، Bushnell CD، Register TC، Sharp FR. الارتباطات المعتمدة على الجنس لسمك الطبقة الداخلية للشريان السباتي مع التعبير الجيني في الدم. ترجمة السكتة الدماغية الدقة. 2011 ؛ 2: 171-178. دوى: 10.1007 / ثانية 12975-011-0066-4

50. Webb NR ، Bostrom MA ، Szilvassy SJ ، van der Westhuyzen DR ، Daugherty A ، de Beer FC. يزيد إفراز إنزيم فسفوليباز A2 من مجموعة IIA المعبر عنها بالبلعم من تكوين آفة تصلب الشرايين في الفئران التي تعاني من نقص مستقبلات LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 ؛ 23: 263-268. دوى: 10.1161 / 01.atv.0000051701.90972.e5

51. Cunningham L ، Finckbeiner S ، Hyde RK ، Southall N ، Marugan J ، Yedavalli VR ، Dehdashti SJ ، Reinhold WC ، Alemu L ، Zhao L ، et al. تحديد benzodiazepine Ro 5-3335 كمثبط لسرطان الدم CBF من خلال شاشة كمية عالية الإنتاجية ضد تفاعل RUNX 1- CBF. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 ؛ 109: 14592–14597. دوى: 10.1073 / pnas.1200037109

52. Reaven PD، Emanuele NV، Wiitala WL، Bahn GD، Reda DJ، McCarren M، Duckworth WC، Hayward RA؛ محققو VADT. التحكم المكثف في الجلوكوز لدى مرضى السكري من النوع 2: متابعة لمدة 15- سنة. إن إنجل جي ميد. 2019 ؛ 380: 2215 - 2224. دوى: 10.1056 / NEJMoa1806802

53. Arts RJ، Joosten LA، Netea MG. دوائر الاستقلاب المناعي في المناعة المدربة. سيمين إمونول. 2016 ؛ 28: 425-430. دوى: 10.1016 / j.smim.2016.09.00254. Quintin J و Saeed S و Martens JHA و Giamarellos-Bourboulis EJ و Ifrim DC و Logie C و Jacobs L و Jansen T و Kullberg BJ و Wijmenga C et al. توفر عدوى المبيضات البيضاء الحماية من الإصابة مرة أخرى عن طريق إعادة البرمجة الوظيفية للخلايا الوحيدة. ميكروب مضيف الخلية. 2012 ؛ 12: 223-232. دوى: 10.1016 / ي. كوم.2012.06.006

55. Zhang D و Tang Z و Huang H و Zhou G و Cui C و Weng Y و Liu W و Kim S و Lee S و Perez-Neut M وآخرون. التنظيم الأيضي للتعبير الجيني عن طريق أستيل هيستون. طبيعة. 2019 ؛ 574: 575-580. دوى: 10.1038 / ثانية 41586-019-1678-1

56. Christ A، Günther P، Lauterbach MAR، Duewell P، Biswas D، Pelka K، Scholz CJ، Oosting M، Haendler K، Baßler K، et al. يتسبب النظام الغذائي الغربي في إعادة برمجة المناعة الفطرية المعتمدة على NLRP 3-. خلية. 2018 ؛ 172: 162–175 هـ 14. دوى: 10.1016 / j.cell.2017.12.013

57. Glass CK ، Natoli G. التحكم الجزيئي في التنشيط والتهيئة في الضامة. نات إمونول. 2016 ؛ 17: 26-33. دوى: 10.1038 / ني .3306

58. Voon DC ، Hor YT ، Ito Y. مجمع RUNX: الوصول إلى ما بعد تكون الدم في المناعة. علم المناعة. 2015 ؛ 146: 523-536. دوى: 10.1111 / إم 12535

59. Himes SR، Cronau S، Mulford C، Hume DA. يتحكم عامل النسخ Runx1 في النمو المعتمد والمستقل للـ CSF -1- وبقاء الضامة. الأورام. 2005 ؛ 24: 5278-5286. دوى: 10.1038 / SJ.200. يوم 1208657

60. Zhang S و Yu M و Guo Q و Li R و Li G و Tan S و Li X و Wei Y و Wu M. يرتبط Annexin A2 بالجسيمات الداخلية وينظم سلبًا TLR 4- الذي أثار الاستجابات الالتهابية عبر TRAM- مسار TRIF. مندوب علوم .2015؛ 5: 15859. دوى: 10.1038 / srep15859

61. الرضاي س ، السعدون إتش ، توربيكا تي ، ماكنزي إي إيه ، بولينج إف إل ، بولتون إيه جي إم ، ميس كا. يمكن إنقاذ خلل في تطور البلاعم والنمط الظاهري في الضامة البشرية المصابة بداء السكري عن طريق نقل البروتين Hoxa3. بلوس واحد. 2019 ؛ 14: e0223980. دوى: 10.1371 / journal.pone.0223980

62. Durst KL، Hiebert SW. دور أفراد عائلة RUNX في قمع النسخ وإسكات الجينات. الأورام. 2004 ؛ 23: 4220-4224. دوى: 10.1038 / sj.onc.1207122

63. Amann JM، Nip J، Strom DK، Lutterbach B، Harada H، Lenny N، Downing JR، Meyers S، Hiebert SW. ETO ، وهو هدف t (8 ؛ 21) في ابيضاض الدم الحاد ، يقوم باتصالات مميزة مع عدة ديسيتيلز هيستون ويربط mSin3A من خلال مجال قليل القلة. مول الخلية بيول. 2001 ؛ 21: 6470-6483. دوى: 10.1128 / MCB.21.19. 6470-6483. 2001

64. Rose JT ، Moskovitz E ، Boyd JR ، Gordon JA ، Bouffard NA ، Fritz AJ ، Illendula A ، Bushweller JH ، Lian JB ، Stein JL ، et al. يؤدي تثبيط RUNX 1- مركب عامل نسخ CBF إلى اختراق هوية الخلية الظهارية للثدي: نمط ظاهري يحتمل أن يستقر عن طريق وضع إشارة مرجعية للجين الانقسامي. Oncotarget. 2020 ؛ 11: 2512-2530. دوى: 10.18632 / oncotarget.27637

65. Moreno PR، Murcia AM، Palacios IF، Leon MN، Bernardi VH، Fuster V، Fallon JT. تكوين الشريان التاجي وتسلل البلاعم في عينات استئصال الشرايين من مرضى السكري. الدوران. 2000 ؛ 102: 2180-2184. دوى: 10.1161 / 01.cir.102.18.2180

66. Perazza LR، Mitchell PL، Jensen BAH، Daniel N، Boyer M، Varin TV، Bouchareb R، Nachbar RT، Bouchard M، Blais M، et al. يحفز السكروز الغذائي الالتهاب الأيضي وأمراض القلب والأوعية الدموية لتصلب الشرايين أكثر من الدهون الغذائية في الفئران LDLr - / - ApoB100 / 100. تصلب الشرايين. 2020 ؛ 304: 9-21. دوى: 10.1016 / j.atherosclerosis.2020.05.002

67. Flynn MC ، Kraakman MJ ، Tikellis C ، Lee MKS ، Hanssen NMJ ، Kammoun HL ، Pickering RJ ، Dragoljevic D ، Al-Sharea A ، Barrett TJ ، et al. فرط سكر الدم المتقطع العابر يسرع من تصلب الشرايين عن طريق تعزيز تكوين النخاع. سيرك الدقة. 2020 ؛ 127: 877-892. دوى: 10.1161 / CIRCRESAHA.120.005. 316653

لورنس إدغار ، دفيل * ؛ نافيد أكبر ، دكتوراه * ؛ آدم ت. برايثويت ، دكتوراه ؛ توماس كراوسجروبر ، دكتوراه ؛ هيكتور جالارت أيالا ، دكتوراه ؛ جايد بيلي ، دفيل ؛ أليستر ل. كوربين ، ديفيل ؛ طارق خويراتي ، دفيل ؛ جوشوا ت. تشاي ، دفيل ؛ محمد الخليل د. أندريه ف. رينديرو ، دكتوراه ؛ كليمين زيبرنا ، دفيل ؛ ريتو آريا ، السيدة ؛ توماس جيه كاهيل ، د. كريستوف بوك ، دكتوراه ؛ Jurga Laurencikiene ، دكتوراه ؛ مارك جيه كرابتري ، دكتوراه ؛ مادلين إي ليميو ، دكتوراه ؛ نيلز ب. ريكسن ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ؛ ميهاي جي نيتيا ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ؛ كريج إي ويلوك ، دكتوراه ؛ كيث إم شانون ، دكتوراه في الطب ؛ Mikael Rydén ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ؛ إيرينا أ. أودالوفا ، دكتوراه ؛ ريكاردو كارنيسر ، دكتوراه ؛ روبن ب. تشودري ، مارك ألماني.

For more information:1950477648nn@gmail.com