تأثيرات نقص السكر في الدم ونقص شحميات الدم لأنثوسيانين عنبية بواسطة تنشيط AMPK: دراسات في المختبر وفي الجسم الحي الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:التوت الأزرق غني بالأنثوسيانين النشط بيولوجيًا ، مع مستوى عالٍ من المالفيدين ، والذي يرتبط بفوائد مضادات الأكسدة التي تساهم في تقليل مخاطر الإصابة بمرض السكري. كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في تأثيرات نقص السكر في الدم ونقص شحميات الدم لمستخلص أنثوسيانين العنبية (BAE) ،مالفدين(Mv) ، و malvidin -3- glucoside (Mv -3- GLC) ، و malvidin -3- galactoside (Mv -3- gal) في كل من خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2 وفي درجة عالية نظام غذائي للدهون يجمع بين الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها الستربتوزوتوسين. زاد العلاج المرتفع للجلوكوز بشكل ملحوظ من الإجهاد التأكسدي الكبدي حتى 6- ضعفًا وقلل من قابلية بقاء خلايا HepG2. خففت المعالجة المسبقة باستخدام BAE و Mv و Mv -3- glc و Mlv -3- من هذه الأضرار بشكل كبير عن طريق خفض أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بنسبة 87 و 80 و 76 و 91 في المائة ، وزيادة قابلية الخلية للحياة بنسبة 88.79.73 و 98 في المائة على التوالي. هذه المعالجات أيضًا تمنع بشكل فعال ارتفاع السكر في الدم وفرط شحميات الدم ، على التوالي عن طريق تقليل مستويات التعبير عن الإنزيمات المشاركة في استحداث السكر وتكوين الدهون وتعزيز المشاركين في تحلل الجليكوجين وتحلل الدهون ، عبر مسار إشارات بروتين كيناز أحادي الفوسفات (AMPK) في خلايا HepG2. لتحديد دور AMPK في تفاعل BAE الناجم عن استقلاب الجلوكوز والدهون في الجسم الحي ، جرعات 100 مجم / كجم (مستخلصات أنثوسيانين عنبية - تركيز منخفض ، BAE-L) و 400 مجم / كجم (مستخلصات أنثوسيانين العنبية - تركيز عالٍ ، BAE-H) يوميًا للفئران المصابة بداء السكري لمدة 5 أسابيع. كانت علاجات BAE ذات قيمة كبيرة (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">الأنثوسيانينساهم في استخراج التوتنقص سكر الدموتأثيرات نقص شحميات الدم في مرض السكري و BAE يمكن أن تكون غذاء وظيفيًا أو دواءًا واعدًا لعلاج مرض السكري.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

مرض السكري (DM) هو مرض معروف يتسم عادة بعدم القدرة على الحفاظ على مستويات السكر في الدم الطبيعية. يتسبب هذا الاضطراب الأيضي المزمن في أضرار جسيمة لصحة الإنسان ويفرض عبئًا ماليًا ثقيلًا على أنظمة الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم [1]. يصنف هذا المرض إلى نوعين رئيسيين بناءً على سبب عدم انتظام جلوكوز الدم. النوع 1 DM ناتج عن تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا مما يؤدي إلى عدم القدرة على إنتاج الأنسولين في حين أن مرض السكري من النوع 2 يتميز بمستقبلات الأنسولين المقاومة للأنسولين ، مع ضعف الوظيفة ، لا تسمح للخلايا بالاستجابة بشكل كافٍ لارتفاع نسبة الجلوكوز في الدم.

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

بالإضافة إلى ارتفاع السكر في الدم ، يميل مرضى السكر إلى الإصابة بهارتفاع شحوم الدمكلتا الحالتين يمكن أن تؤدي إلى تلف الأعضاء والأنسجة عن طريق زيادة الإجهاد التأكسدي [2]. يعد إنتاج الأنسولين وتلف مستقبلات الأنسولين من بين العوامل التي تسبب ارتفاع السكر في الدم لدى مرضى السكر. في الكبد ، يؤدي الإفراط في التعبير عن استحداث السكر وتحلل الغليكوجين إلى إعادة تأجير الجلوكوز إلى مجرى الدم [3] بينما في الأمعاء الدقيقة ، يؤدي الإفراط في التعبير عن ناقل الجلوكوز 2 (GLUT2) إلى زيادة في نقل الجلوكوز [4]. قد يتسبب فرط شحميات الدم الناجم عن الإفراط في تكوين الدهون في الأنسجة الدهنية [5] في ضعف امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين وتخليق الجليكوجين مما يؤدي إلى مقاومة الأنسولين وبالتالي المساهمة في تطور مرض السكري 6]. تؤثر المضاعفات طويلة المدى المتعلقة بمرض السكري على أعضاء مختلفة وتشمل ارتفاع ضغط الدم وتصلب الشرايين واعتلال الشبكية واعتلال الكلية وتقرحات القدم والاعتلال العصبي المحيطي [7].

لا يوجد حاليًا علاج لمرض السكري ، ومع ذلك ، يمكن التخفيف من آثاره [8]. بالنسبة للأشخاص الذين تم تشخيص إصابتهم بداء السكري من النوع 1 ، فإن العلاج الشائع هو مزيج من تنظيم النظام الغذائي والتناول المناسب من الأنسولين وفقًا للكربوهيدرات المستهلكة. تشمل التحديات الحالية لمرضى السكري من النوع 1 عدم القدرة أو الصعوبات في تقدير إجمالي الكربوهيدرات وجرعة الأنسولين المناسبة ؛ ومع ذلك ، شبه مثاليةنسبة السكر في الدممستويات ممكنة في ضوء التقدم التكنولوجي بما في ذلك مضخات الأنسولين [9]. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من مرض السكري من النوع 2 ، قد يكون العلاج أكثر تعقيدًا بما في ذلك مجموعات من تنظيم النظام الغذائي والتمارين الرياضية والأنسولين والأدوية الأخرى مع مجموعة متنوعة من آليات العمل التي تعمل على خفض نسبة الجلوكوز في الدم [10]. التوصية الغذائية الشائعة هي اتباع نظام غذائي منخفض الكربوهيدرات [11،12].

التوت الأزرق هو أحد الفواكه التي يمكن أن يستهلكها مرضى السكري ويمكن أن تقلل من خطر الإصابة بالنوع الثاني من داء السكري (T2DM) [13 ، 14]. التوت الأزرق غني بمجموعة متنوعة من المركبات المفيدة لصحة الإنسان بما في ذلك المعادن والأحماض العضوية الليفية والأحماض الفينولية والفلافونويدات بما في ذلك مركبات الفلافونول والأنثوسيانين. ومع ذلك ، تشتمل ملامح الأنثوسيانين النموذجية على الجالاكتوزيدات والجلوكوزيدات والأرابينوسايد للدلفينيدين ، والمالفيدين ، والسيانيدين ، والبيتونيدين ، والبيونيدين [17] ، وعادة ما يكون المالفيدين والدلفينيدين هو المساهم الرئيسي في إجمالي محتوى الأنثوسيانين [18 ، 19]. في دراستنا السابقة [20] ، كان مالفيدين هو أكثر أنواع الأنثوسيانيدين وفرة في مستخلص ثمار التوت الأزرق مع دلفينيدين وسيانيدين وبتونيدين وبيونيدين ، وهو ما يتفق مع مؤلفين آخرين وجدوا أيضًا أن مالفيدن مساهم مهم في إجمالي محتوى الأنثوسيانين. في أنواع مختلفة من العنب البري [17 ، 21].

قد يحسن أنثوسيانين العنبية من حساسية الأنسولين من خلال القدرة المضادة للأكسدة ومن خلال التفاعلات التنظيمية الأخرى حيث لا يمكن تفسير آثارها بالكامل بواسطة السابق [13 ، 22]. وقد وجدت الدراسات أيضًا فوائد أنثوسيانين عنبية في علاج مشاكل مرض السكري الأخرى. في دراسة في المختبر ، Huang et al. [23] وجد أن الأنثوسيانين عنبية التوت له تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة على خلايا الشبكية البشرية في حالات ارتفاع الجلوكوز. الخلايا المعرضة لنسبة عالية من الجلوكوز لديها قابلية للحياة بنسبة 64 في المائة ، بينما عند تعرضها لمستخلص أنثوسيانين العنبية ، أو مالفيدين ، أو مالفيدين-جلوكوزيد ، أو مالفيدين-جالاكتوزيد ، كانت قابليتها للحياة 7-9 في المائة ، أو 83 في المائة ، 91- في المائة ، أو { {11}} بالمائة على التوالي. من ناحية أخرى ، سونغ وآخرون. [24] وجد أن الأنثوسيانين عنبية يقلل من الإجهاد التأكسدي والالتهاب في شبكية عين الفئران المصابة بداء السكري. أعطيت الفئران المصابة بمرض السكر 20 و 40 و 80 ملغم / كغم من الأنثوسيانين عن طريق الفم لمدة 12 أسبوعًا. كانت الجرذان التي تحتوي على جرعات عالية من الأنثوسيانين عنبية من انخفاض نسبة الجلوكوز في الدم ، وارتفاع قدرة مضادات الأكسدة ، وانخفاض الالتهاب في شبكية العين ، وانخفاض أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنة بتلك التي لا تحتوي على الأنثوسيانين عنبية.

على الرغم من أن أنثوسيانين العنبية تقدم فوائد صحية للكبد والأعضاء الأخرى لمرضى السكر ، إلا أن تأثير نقص السكر في الدم ونقص شحميات الدم لمستخلص أنثوسيانين العنبية (BAE) في خلايا الكبد البشرية غير واضح. في الدراسة الحالية ، تم التكهن بأن BAE ، بالإضافة إلى Mv و Mv {0}} glc و Mv -3- gal ، لديهم أنشطة لخفض نسبة السكر في الدم ونقص شحميات الدم في خلايا سرطان الكبد البشري (HepG2) والفئران وأنهم يمكن أن تحافظ على توازن الجلوكوليبيد وبالتالي التخفيف من تطور مرض السكري.

2. المواد والأساليب

2.1. المواد الكيميائية والكواشف

توت برايتويل رابيتي (تم حصاد Vaccinium ashei من Fujiabian Orchard Picking (نانجينغ ، الصين) ثم تم الحصول على مستخلصات الأنثوسيانين وتخزينها في الظلام بدرجة {0}}. وكيل إعادة التصنيع 3- (4،5 ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5 ثنائي فينيل -2 بروميد تيترازوليوم (MTT) ومعايير مالفيدين (Mv) ، مالفيدين -3- جلوكوز (Mv { تم شراء {11}} glc) ، و malvidin -3- galactose (Mv -3- gal) من Sigma Aldrich (شنغهاي ، الصين). مجموعة فحص البروتين HepG2 الأولية ، ومجموعة فحص بروتين حمض bicinchoninic (BCA) ، وتحسينها تم الحصول على كواشف الكشف عن اللمعان الكيميائي (ECL) من CW Biotechnology (بكين ، الصين). تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) ، وسيط Dulbecco المعدل النسر (DMEM) ، والبنسلين - الستربتومايسين من Gibco (أوكلاند ، نيوزيلندا). تم شراء الستربتوزوتوسين (STZ) من Saiguo Biotech (قوانغتشو ، الصين). تم شراء مجموعة أدوات الكشف عن ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلورسين (DCFH-DA) من معهد Beyo-time للتكنولوجيا (Shan) ghai ، الصين). تم الحصول على ألبومين مصل الأبقار (BSA) من Shyuanye (شنغهاي ، الصين). الأعلاف عالية الدهون والسكر (دهون 35.5٪ ، بروتين 20٪ ، كربوهيدرات 36.4٪ ، 0.1٪ سليلوز) والأعلاف العادية (دهون 4.5٪ ، بروتين 23٪ ، كربوهيدرات 31.9٪ ، 3.7٪ فركتوز ، 5.3٪). السليلوز) للفئران من Xietong Bioengineering Co. ، Ltd (نانجينغ ، الصين). تم شراء مجموعات فحص الأنسولين ، والدهون الثلاثية (TG) ، والكوليسترول الكلي (TCHD ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px) ، وأكسيد ديسموتاز الفائق (SOD) من معهد Jiancheng Bioengineering Research Institute (نانجينغ ، الصين). ، جلوكوز -6- فوسفاتاز (G6Pase) ، جليكوجين سينثيز-فسفرة (p-GS) ، جليكوجين سينثيز كيناز -3 فسفرة بيتا (p-GSK3) ، ناقل الجلوكوز 2 (GLUT2) ، أسيتيل أنزيم أ كربوكسيلاز (ACC) ، الليباز ثلاثي الجليسريد الحساس للهرمونات (HSL) ، 3- هيدروكسي -3- ميثيل جلوتاريل أنزيم اختزال الإنزيم (HMGCR) وفحص الأنسولين المرتبط بالإنزيم المرتبط بالإنزيم (ELISA) تم شراؤها من Bluegene Biotech (شنغهاي ، الصين) كانت المواد الكيميائية والكواشف المستخدمة في هذه الدراسة كلها من الدرجات التحليلية البحتة.

2.2. الأجسام المضادة

تم الحصول على الأجسام المضادة الأولية ضد GS ، و p-GS (Ser641) ، وبروتين ربط عنصر الستيرول التنظيمي -1 c (SREBP -1 c) ، و phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة) . الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين كيناز ألفا المنشط بأحادي الفوسفات (AMPKa) ، p-AMPK a (Thr172) ، مستقبلات تنشيط البيروكسيسوم - y-coactivator -1 (PGC -1) ، ACC ، p- تم شراء الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ACC (Ser79) ، وبيروكسيداز الفجل (HRP) من تقنية تشوير الخلايا (Beverly ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الجسم المضاد ضد الجليسيرالديهيد 3- فوسفات ديهيدروجينيز (GAPDH) من Nanjing Beidi Biomed Technology (نانجينغ ، الصين) بينما تم شراء الجسم المضاد ضد -actin من Sigma Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام الأجسام المضادة الأولية عند تخفيف 1: 1000 بينما تم استخدام 1: 4000 تخفيف للأجسام المضادة الثانوية.

2.3 تحضير مستخلص أنثوسيانين عنبية (BAE)

تم إجراء استخراج أنثوسيانين عنبية باستخدام طريقتنا السابقة في Huang et al. [25]. حُفظت حبات التوت الأزرق المجمدة في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب. بعد ذلك ، تم ضربهم بسرعة 10 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام الخالط T18 الأساسي ULTRA-TURRAX (IKA Works Guangzhou ، الصين). تم بعد ذلك نقع كمية من 250 جم من العنب البري في محلول 1000 مل من الميثانول المحتوي على 1 في المائة من حمض الهيدروكلوريك لمدة 24 ساعة. ثم تم جمع المستخلص بعد الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة. بعد تبخر المذيب عند 40 درجة في فراغ ، يتم استخلاص المادة المتبقية باستخدام 1: 1 (حجم / حجم) أسيتات إيثيل ثلاث مرات. تم جمع الطور المائي المحتوي على الأنثوسيانين وتركيزه باستخدام التبخر المفرغ للحصول على مستخلص الأنثوسيانين الخام. تمت تنقية المستخلص أيضًا باستخدام راتنج AB -8 الكبير المسام (Sigma Aldrich ، شنغهاي ، الصين). لإزالة الفركتوز والبروتين ، تعرض المستخلص لعمود كروماتوجرافي على 1000 جم من راتنج AB {16}} كبير المسام لمدة 24 ساعة من الامتصاص ثم تمت التصفية منه بماء مقطر مزدوج. تمت تصفية جزء الأنثوسيانين بنسبة 80 في المائة من الإيثانول يحتوي على 1 في المائة من محلول حمض الهيدروكلوريك ، وتركيزه في وسط مفرغ ، ثم تجفيفه باستخدام مجفف تجميد Eyela FDU -1200 (Tokyo Rikakikai ، اليابان) من أجل الحصول على مستخلص أنثوسيانين عنبية (BAE) مسحوق.

2.4 زراعة الخلايا وعلاجاتها

تحتوي خطوط خلايا HepG2 ، المشتقة من سرطان خلايا الكبد البشري المميز ، على نسبة عالية من البروتينات الخاصة بالكبد. لهذا السبب ، يتم استخدامها بشكل شائع كنماذج معملية لدراسات خلايا الكبد البشرية [26]. نمت خلايا HepG2 في DMEM التي تحتوي على D-glucose العادي (5.5 ملي مولار) مع 10 بالمائة من FBS و 1 بالمائة من البنسلين الستربتومايسين وتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية و 5 بالمائة من حاضنة الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون (Thermo Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الوصول إلى التقاء 70-80 بالمائة ، تمت زراعة خلايا HepG2 بشكل فرعي. قبل أربع ساعات من التجربة ، تم إخماد خلايا HepG2 في وسط مصل مخفض. بعد المعالجة المسبقة بـ 5 ميكروغرام / مليليتر Mv أو Mv -3- glc أو Mv -3- gal أو BAE لمدة 24 ساعة ، تم تعريض الخلايا لتركيزات جلوكوز طبيعية (5.5 ملي مولار) أو عالية (30 ملي مولار) إلى تحاكي الظروف الطبيعية ومرض السكري. تم تحضير الخلايا لتحليل Western Blot وتم جمع المواد الطافية لتحليل ELISA.

2.5 الحيوانات والتصميم التجريبي

تم الاحتفاظ بـ C57BL / 6J من ذكور الفئران السليمة (20 ± 2 جم) من GemPharmatech (نانجينغ ، جيانغسو ، الصين) في ظروف معملية قياسية ، بما في ذلك درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة و 12- ساعة بالتناوب ليلًا ونهارًا. وكانت اللجنة الفرعية لأكاديمية جيانغسو للعلوم الزراعية والمعنية ببحوث رعاية الحيوان واستخدامه قد وافقت من قبل على جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات. تم استخدام نظام غذائي عالي الدهون والستربتوزوتوسين (STZ) للحث على T2DM في النماذج الحيوانية وفقًا للطريقة التي استخدمها Islam and Loots [27]. تم تغذية جميع الفئران بنظام غذائي عالي الدهون والسكر باستثناء المجموعة الضابطة التي تناولت نظامًا غذائيًا طبيعيًا. بعد 4 أسابيع ، صُممت الفئران لمدة 12 ساعة وحقنت داخل الصفاق بـ 100 مجم / كجم من STZ مذاب في محلول منظم سترات الصوديوم (درجة الحموضة 4. 2-4. 5). بعد أسبوع واحد من تحريض STZ ، تم أخذ عينات دم من وريد ذيل الفئران التي صامت طوال الليل. تم التعرف على الفئران التي ظهرت عليها أعراض مرض السكري بما في ذلك بوال التبول ، عطاش ، ارتفاع السكر في الدم (صيام مستوى السكر في الدم> 11.1 مليمول / لتر) على أنها T2DM واستخدمت للدراسة المستقبلية. للتحقق من استقرار النموذج T2DM ، تم تغذية جميع الفئران بنظام غذائي عادي لمدة أسبوع واحد. تم استخدام الفئران العادية كمجموعة تحكم. تم بعد ذلك تقسيم الفئران المصابة بداء السكري بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: نموذج ، جرعة منخفضة من BAE (100 مجم / كجم) ، وجرعة عالية BAE (400 مجم / كجم). لمدة 6 أيام متتالية ، تم إعطاء نفس الحجم من المذيب 100 ميكرولتر أو 100 مجم / كجم أو 400 مجم / كجم من BAE إلى المجموعة الضابطة والمجموعة النموذجية والجرعة المنخفضة BAE والجرعة العالية BAE على التوالى. في اليوم السابع تم قياس وزن الجسم ونسبة الجلوكوز في الدم أثناء الصيام. استمرت نفس الإدارة داخل المعدة لمدة 5 أسابيع. تم بعد ذلك صيام الفئران طوال الليل ، وتم جمع عينات الدم لتحضير المصل من الوريد الأجوف السفلي وتخزينها في درجة -20. بعد أخذ عينات الدم ، تم تخدير جميع الفئران والتضحية بها. تمت إزالة أنسجة كبد الفئران والطحال والكلى والغدة الصعترية ووزنها وتخزينها في درجة -80 لإجراء مزيد من التجارب.

2.6. كشف صلاحية الخلية

تم تحديد صلاحية الخلية بواسطة طريقة MTT. تم استخدام خمسة ميكروغرام / مل من Mv أو Mv {0} glc أو Mv -3- غال أو BAE للمعالجة المسبقة للخلايا لمدة 24 ساعة. عولجت الخلايا بعد ذلك بجلوكوز 5 ملي مولار 30 ملي مولار لمدة 24 ساعة و 10 ميكرولتر 0.5 بالمائة （5 مجم / مل） من MTT إلى الخلايا التي تمت زراعتها بعد ذلك مرة أخرى. بعد 4 ساعات ، تمت إزالة محلول MTT ، وتمت إضافة 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) قبل رج الخليط ببطء لمدة 10 دقائق لإذابة بلورة الخلية. تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر على قارئ صفيحة ميكروسكوبية StatFax -2100 (Awareness Tech-nology Inc.، Plam، FL، USA) للحصول على قيم الكثافة الضوئية (OD). تم استخدام الخلايا المزروعة بمستويات الجلوكوز الطبيعي (5.5 مليمول / لتر) كمجموعة تحكم ، بينما تم استخدام الآبار التي لا تحتوي على خلايا على أنها فارغة. تم استخدام الصيغة التالية لتحديد قابلية الخلية للتطبيق: قابلية الخلية للتطبيق (النسبة المئوية)=(قيمة OD للمجموعة الخالية من قيمة OD لمجموعة العينة) / (قيمة OD للمجموعة الفارغة لقيمة OD) × 100 بالمائة.

2.7. تصور مضان ROS

تم تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في خلايا HepG2 باستخدام مجموعة الكشف DCFH-DA. بعد المعالجة الأولية بـ 5 ميكروغرام / مل من Mv أو Mv -3- glc أو Mv -3- gal أو BAE لمدة 24 ساعة والتي أعقبتها معالجة 5 ملي مولار أو 30 ملي جلوكوز لمدة 24 ساعة ، تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم تمت إضافة 10 ميكرومتر من DCFH-DA إلى كل بئر وتم السماح لها بالتفاعل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة. تم غسل الخلايا مرة أخرى تمامًا باستخدام PBS ثم تمت ملاحظة مجموعة من هذه الخلايا على الفور تحت مجهر الفلورسنت المقلوب IX53 (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) عند انبعاث 530 نانومتر و 485 نانومتر مرشحات إثارة. يتم عرض الصور تحت تكبير 200 ×. بعد التفكك ، تم جمع مجموعة أخرى من الخلايا وتم تسجيل مضانها بواسطة قارئ لوحة ميكروسكوبية متعدد الأوضاع Synergy H4 (BioTek Instruments Inc. ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). لوحظت شدة التألق الكلية للخلايا في كل بئر ، وتم قياس توليد ROS كضعف لعنصر التحكم.

2.8. إليسا

تم استخدام مجموعات ELISA لتحديد كمية البروتينات المشاركة في تكوين السكر (FOXO1 ، G6Pase ، p-GS) ، تحلل الجليكوجين (p-GSK3) ، ناقل الجلوكوز (GLUT2) ، تكوين الدهون (ACC و HMGCR) ، وتحلل الدهون (HSL) في المواد الطافية لـ HepG2 الخلايا. كما تم تحديد كمية GLUT2 في كبد الفئران. تم استخدام مجموعة فحص بروتين BCA لتحديد كمية بروتين الخلية الكلي للمادة الطافية. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر عند 37 درجة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية StatFax -2100 (Awareness Technology Inc.، Plam، FL، USA) لتحديد مستويات البروتين.

2.9 تحليل النشاف الغربي

تم إجراء النشاف الغربي على محللات HepG2 من أجل قياس مستوى البروتين في AMPK ، و p-AMPK ، وتكوين السكر (PGCl ، و PEPCK ، وتحلل الجليكوجين (GS ، p-GS) ، وتحلل الدهون (ACC ، p-ACC ، SREBP {{4} } ج) في الخلايا. تم إجراء النشاف الغربي أيضًا لتحديد كميات AMPK و p-AMPK على كبد الفئران التي يسببها مرض السكري. تم استخدام إما GAPDH أو -Actin كعنصر تحكم في التحميل. تصوير LAS -3000 تم استخدام نظام (فوجي ، طوكيو ، اليابان) لمراقبة نطاقات البروتين ، وتم قياس كثافتها باستخدام برنامج Bio Profile 1D plus (Vilbert Lour-mat ، Marne La Vallee ، فرنسا). تم التعبير عن جميع البيانات كتغيير أضعاف إلى السيطرة.

2.10. فحص سكر الدم الصائم وتحمل الجلوكوز

تم قياس نسبة الجلوكوز في الدم أثناء الصيام مرة واحدة في الأسبوع لمدة 5 أسابيع بعد فترة الصيام 12-. بالنسبة لمقايسة تحمل الجلوكوز ، تم صيام الفئران لمدة 16 ساعة وتغذيتها بـ 2 جم / كجم من 2 0 بالمائة من الجلوكوز （2 0 0 ميكرولتر） داخل المعدة (ig) لتحديد مستوى الجلوكوز في الدم عند 0 و 0.5 و 1 و 1.5 و 2 ساعة. تم جمع الدم من وريد الذيل وقياس مستويات الجلوكوز باستخدام مقياس السكر (Sinocare ، Changsha ، الصين). تم قياس مستوى الجلوكوز في بول الفئران التي تلقت ig أيضًا لمدة خمسة أسابيع.

2.11- تقدير الفهارس البيوكيميائية في مصل الدم ونشاط الإنزيم في كبد الفئران

تم قياس كمية الأنسولين والدهون الثلاثية والكوليسترول الكلي في مصل الدم ، بينما تم تقدير نشاط إنزيم SOD و GSH-PX باستخدام العدة التجارية وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم قياس الامتصاص عند 500 نانومتر للدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول الكلي (TCH) ، و 450 نانومتر للآخرين (الأنسولين ، SOD ، و GSH-PX) عند 37 درجة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية StatFax -2100 (Awareness Technology InC. ، بلام ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.12. تحليل احصائي

يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​القيمة ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تم الحصول على الأرقام باستخدام GraphPad Prism الإصدار 8 (GraphPad Software، Inc.، CA، USA). تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) أو اختبارات t أو اختبار المقارنات المتعددة Sidak لتحديد الفروق الإحصائية بين المجموعات المختلفة. اعتبرت الاختلافات كبيرة في P.<>

تم اقتباس هذه المقالة من https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 تم استلامه في 21 يوليو 2021 ؛ وردت بصيغة منقحة 9 أغسطس 2021 ؛ تم القبول في 11 أغسطس 2021