تحديد وتحليل وظيفي لـ Bifavone كمثبط جديد لمستقبلات عابرة محتملة من الفانيليا 4 عمليات تصلب الشرايين المعتمدة

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comلمعرفة المزيد

مازن الحربي ، بيديشا دوتا ، ريشوف جوسوامي ، شويتا شارما ، كاي. لي وشيخ رحمان

يُشكل تصلب الشرايين ، وهو مرض التهابي تدريجي يصيب الشرايين الكبيرة ، العامل الرئيسي الذي يساهم في زيادة عبء الوفيات والمراضة المرتبطة بأمراض القلب والأوعية الدموية على مستوى العالم 1. يتضمن حدث البدء المحوري الذي يؤدي إلى تصلب الشرايين الاحتفاظ بجزيئات البروتين الدهني منخفض الكثافة المعدلة (oxLDL) في الفراغات الداخلية الأبهرية تحت البطانية بشكل أساسي في نقاط التفرع الشرياني 2. أثناء تصلُّب الشرايين المبكر ، وبعد الخلل الوظيفي البطاني ، تنتقل حيدات الدم المنتشرة إلى المناطق الداخلية ، وتتمايز إلى خلايا أنسجة ضخمة 3. في الفراغات الداخلية الشريان الأبهر ، يؤدي ارتباط وامتصاص oxLDL بواسطة البلاعم بمساعدة مستقبلات الزبال مثل SRA و CD36 إلى إنشاء حلقة التهابات عصبية متغذية تؤدي إلى تطوير خلايا رغوية محملة بالدهون ، وهي عملية حاسمة في تصلب الشرايين. تؤدي سلسلة الأحداث الالتهابية التي تثيرها الخلايا الرغوية إلى تكوين خط دهني مبكر وفي النهاية ظهور آفات تصلب الشرايين المتقدمة التي تتميز بوجود غطاء ليفي ونسيج متكلس وخلايا مناعية وبروتينات مصفوفة ودهون 2-10. مستقبلات عابرة فانيلويد 4 (TRPV4) من فصيلة TRPV ، قناة كاتيون متعددة الوسائط غير انتقائية قابلة للنفاذ إلى Ca2 plus يتم التعبير عنها في كل مكان في أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الضامة 11-24. يُعرف TRPV4 سابقًا باسم مستشعر osmosensor ، وهو معروف الآن باستجابته للعديد من المحفزات الكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيوية بما في ذلك الحرارة وتصلب المصفوفة والأسمولية وعوامل النمو ودرجة الحموضة و 4 استرات phorbol11-24. تم الإبلاغ عن TRPV4 للتوسط في العديد من الوظائف الفسيولوجية مثل الإحساس بالألم في الالتهاب والاعتلال العصبي ، وتمايز الأرومة الليفية العضلية والهجرة 17 ، 25 ، 26 ، وتمايز ناقضات العظم في العظام. ارتبطت طفرات TRPV4 بالعديد من اعتلالات القناة. أوضحت الدراسات الحديثة التي أجرتها مجموعتنا وآخرون دورًا محتملاً لهذه القناة في عدد لا يحصى من الحالات المرضية مثل إصابات الرئة ، وتشكيل الخلايا الرغوية 14 ، 16 ، وتلف الأنسجة 17 ، 33 ، واستجابة الجسم الغريب 13 ، والسرطان 34 ، 35. في السابق ، تم عرض دور TRPV4 المعزز للعصب ، حيث تبين أن وظيفة TRPV4 التي يسببها ناهض كيميائي في الخلايا البطانية مرتبطة بتنشيط eNOS وتثبيط التصاق الوحيدات بالخلايا البطانية. في المقابل ، تم ربط أوجه القصور في وظائف TRPV4 بالعديد من الاستجابات الالتهابية العصيدية بما في ذلك الخلل البطاني ، وانخفاض إنتاج خلايا الرغوة الضامة ، وأمراض الأوعية الدموية. لقد حدد مختبرنا مؤخرًا دورًا طليعيًا لـ TRPV4 حيث ينظم تكوين خلايا رغوة البلاعم المستحثة بـ oxLDL. ميكانيكيًا ، أظهرنا أن TRPV4 يؤثر على امتصاص oxLDL ولكن ليس ارتباطه في الضامة في قرص مضغوط 36- بطريقة مستقلة 14. في دراسة أخرى ، أبلغنا عن تفاقم معتمد على TRPV 4- لتكوين خلايا الرغوة المستحثة بـ oxLDL في وجود عديد السكاريد الدهني وزيادة صلابة المصفوفة ، مما يوفر رابطًا بين التحسس الميكانيكي وخطر الإصابة بتصلب الشرايين. بالنظر إلى هذه النتائج مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن TRPV4 هدف جذاب في تصلب الشرايين وأمراض أخرى ، مما يحفز اكتشاف مثبطات الجزيئات الصغيرة لـ TRPV4 التي يمكن ترجمتها إلى علاجات فعالة سريريًا. اكتسبت استخدامات المركبات الطبيعية في العلاجات مكانة بارزة ، مدفوعة في المقام الأول بالحاجة إلى مركبات فعالة من حيث التكلفة ومتوافقة حيويًا مقارنة بالعقاقير الاصطناعية الموجودة حاليًا. المركبات الطبيعية مثلمركبات الفلافونويدقلويداتالبوليفينول، و curcuminoids ، تؤثر على أمراض القلب والأوعية الدموية من خلال آليات متنوعة مثل تثبيطمحفز للالتهاباتالإشارات ، وحساسية الأنسولين ، وتحسين ملامح الدهون في الدم عن طريق استهداف مسارات AMPK و COX1 / 2 و eNOS و Nrf240-45. حددت الدراسات الحديثة التي أجرتها مجموعات متعددة اثنين من مركبات الفلافونويد ، بربارين ، وأبيجينين ، كمعدلات محتملة لنشاط TRPV4. لقد طورنا واستخدمنا طريقة فحص شبه عالية الإنتاجية لتحديد الخصوم المحتملة لـ TRPV4 من مكتبة المركبات الطبيعية باستخدام قارئ لوحة التصوير الفلوريومتري (FLIPR) القائم على Ca2 بالإضافة إلى مقايسة التدفق. هنا ، نُبلغ عن تحديد وتحليل وظيفي لـ Linkedin ، وهو فلافون ، كمثبط جديد لعمليات تصلب الشرايين المعتمدة على TRPV 4- في البلاعم ، وبالتالي وضع أساس لمزيد من الدراسات لهذا المركب الطبيعي باعتباره مضادًا طبيعيًا لتصلب الشرايين. مركب جزيء. تم الإبلاغ عن لينكد إن لإظهار الحماية العصبية ،مضاد للسرطان، ومضاد التهابالأدوار 48،49. أبلغنا عن آلية عمل Linkedin ضد TRPV4 في إعداد تكوين خلايا رغوة البلاعم باستخدام العديد من المقايسات البيوكيميائية والخلوية.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

المواد والأساليب الثقافة الحيوانية والخلوية

اشترينا فئران C57BL / 6 من النوع البري (WT) من مختبرات تشارلز ريفر (ويلمنجتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اتباع إرشادات لجنة رعاية الحيوان واستخدامه بجامعة ماريلاند لجميع التجارب على الحيوانات والتزم المؤلفون بإرشادات ARRIVE. لعزل الضامة المقيمة التي يسببها الثيوجليكولات (MRM) ، تم جمع غسل البريتوني بعد 4 أيام من حقن ثيوجليكولات داخل الصفاق ، وتم الحفاظ على الخلايا في 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) الذي يحتوي على DMEM7 ، 14 ، 16. تم شراء خط خلية بلعم الفئران (RAW264.7) ، والأرومات الليفية الجلدية البشرية (HDF) من ATCC (Manassas ، VA) ، وتم تربيتها ، على التوالي ، باستخدام DMEM أو MEM (Gibco ، Waltham ، MA). تم حصاد الضامة المشتقة من نخاع عظم الفئران (BMDMs) من 6- إلى 7- أسبوعًا من الفئران القديمة ، كما هو موضح سابقًا 14،50،51. باختصار ، تم جمع عظام الفخذ من فئران WT و TRPV4 KO ، وتم طرد نخاع عظم عظام الفخذ باستخدام وسائط DMEM كاملة بنسبة 10 بالمائة FBS. تم ترشيح خلايا نخاع العظم المعلقة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر (العلوم الحيوية BD) ، وطردها ، والمحافظة عليها في وسط DMEM المضاف إليه M-CSF (25 نانوغرام / مل) لمدة 7-8 أيام عند 37 درجة للسماح بالتمايز في الضامة.

الكواشف

تم شراء Linkedin و GSK1016790A (GSK101) من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO) ، وتم الحصول على مجموعة اختبار FLIPR Calcium 6 من Molecular Device (Sunnyvale ، CA). تم شراء LDL البشري الأصلي (VLDL) من Stemcell Technologies (فانكوفر ، كندا). قمنا باحتضان LDL بـ 5 ميكرومتر من CuSO4 لمدة 12 ساعة عند 37 درجة لتحضير LDL المؤكسد بالنحاس (oxLDL) 7،14،16. تم شراء ملصق الصبغة الفلورية ، DiI-oxLDL ، من Invitrogen (Carlsbad ، CA) ، و MCSF من R&D (Minneapolis ، MN). كانت الأجسام المضادة لتحليل FACS هي: TRPV4 (ميليبور ، بيرلينجتون ، ماساتشوستس) ، CD36 (R&D ؛ مينيابوليس ، مينيسوتا) ، TLR4 ، و TLR6 (Novus Biologicals ؛ Centennial ، CO). كانت الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ PE من R & D (Minneapolis ، MN) ، وكانت عناصر التحكم في النمط المترافق مع PE من BD (Franklin Lake ، NJ). من أجل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qRT-PCR) ، استخدمنا مجموعة RNeasy من QIAGEN (Redwood City ، CA). تم شراء جميع البادئات من Bio-Rad (Hercules ، CA). تم الحصول على وسائط زراعة الخلايا والمنتجات المتعلقة بزراعة الخلايا وكواشف اللطخة الغربية من Thermo Fischer Scientific (Waltham ، MA).

Cistanche لمكافحة التعب

غربلة شبه عالية الإنتاجية

لقد أجرينا فحصًا شبه عالي الإنتاجية لمضادات Trpv4 من مكتبة تضم 2000 مركب طبيعي (MSSP -2000 ، Johns Hopkins Chemcore) باستخدام قارئ لوحة تصوير فلورومتري (FLIPR) على أساس مقايسة تدفق الكالسيوم. حددنا جينكجيتين (GGT) كمضاد جديد لـ TRPV4. تم إجراء الفحص الأولي والثانوي باستخدام RAW264.7 و HDF و BMDMs لتقييم قدرة Linkedin والمرشحين الآخرين على تثبيط TRPV 4- الذي أثار Ca2 بالإضافة إلى التدفق. كعناصر تحكم ، استخدمنا A23187 ، وهو حامض شحوم الكالسيوم ، و BMDMs فارغ ، و GSK219 ، وهو مضاد انتقائي TRPV4. بعد الفحص الثانوي ، حددنا ستة مركبات تظهر أكثر من ثلاثة أضعاف تثبيط TRPV 4- بوساطة Ca2 بالإضافة إلى التدفق مقارنة بالتحكم في السيارة. تم تحديد لينكد إن باعتباره المانع الأكثر فعالية لنشاط TRPV4. تم زرع BMDMs (5 × 104 خلية / بئر) في ألواح سوداء مطلية بالكولاجين (10 ميكروغرام / مل) 96- صافية تمامًا وحضنت عند 37 درجة ، 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة ، تم تحميل الخلايا بصبغة الكالسيوم 6 في HBSS و 20 ملي مولار HEPES و 2.5 ملي مولار من البروبينسيد وحضنت لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة. بعد الحضانة ، تمت إضافة مركبات المكتبة لكل بئر لتركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر. تم تحضين الأطباق لمدة 45 دقيقة أخرى عند 37 درجة. تم إحداث تدفق Ca2 plus عن طريق إضافة 10 نانومتر من ناهض TRPV4 GSK1016790A في الخلايا المعالجة مسبقًا للمركبة أو المركب وتم تسجيله عن طريق قياس F / F (Max-Min) ، كما هو موضح سابقًا. يتم عرض البيانات كوحدات الفلورة النسبية (RFU).

اللطخات المناعية

تم زرع الضامة البريتونية الناتجة عن الثيوجليكولات في 10 بالمائة من FBS تحتوي على DMEM وحضنت طوال الليل. تم غسل الخلايا غير المقيدة ، وتمت إضافة 1 في المائة من ألبومين مصل الأبقار (BSA) المحتوي على DMEM إلى اللوحة واحتضانها لمدة 3 ساعات قبل معالجة لينكد إن. لتحديد التعبير عن بروتينات CD36 و TRPV4 و TLR2 و TLR4 و TLR6 و GAPDH تم تحضير محللات الخلية الكاملة من الخلايا المعالجة طوال الليل بـ Linkedin (1 و 5 ميكرومتر) أو السيارة في وجود أو عدم وجود oxLDL (25 ميكروغرام / مل) ). لتحديد مستويات التعبير عن p-JNK و JNK التي تم تشغيلها بواسطة LPS ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا بـ Linkedin (5 و 10 ميكرومتر) لمدة 3 ساعات ثم تحفيزها باستخدام E. coli LPS لمدة 30 دقيقة. تم تحضير محلول الخلية الكاملة من خلايا مغسولة مرتين (PBS مثلج بارد) باستخدام محلول RIPA مع كوكتيل مثبط البروتياز المضاف (Thermo Scientific ، MA). تم فحص البقع باستخدام مضاد الأرانب TRPV4 (Alomone Lab ، القدس ، إسرائيل) ، CD36 المضاد للفأر (R&D ، Minneapolis ، MN) ، مضاد الأرانب TLR4 ، مضاد TLR6 للأرنب ، مضاد لـ JNK للأرانب ، مضاد لـ p- الأجسام المضادة الأولية لـ JNK (Cell Signaling ، Danvers ، MA) متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب والمضادة للفأر HRP (R&D ، Minneapolis ، MN). تم تجريد البقع وإعادة فحصها باستخدام مضاد GAPDH IgG (1: 2000 ؛ سانتا كروز ، دالاس ، تكساس) للتحكم في التحميل.

تكوين خلايا الرغوة.تم زرع MRM المحفز بواسطة Thioglycolate على أغطية زجاجية في صفيحة مكونة من 12 بئر مع DMEM ، و 10 بالمائة FBS وحضنت عند 37 درجة ، و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. تمت إضافة GGT (1 أو 10 ميكرومتر) إلى الخلايا ، وبعد 3 ساعات من الحضانة ، تمت إضافة oxLDL (50 ميكروغرام / مل) ، وحضنت الثقافات طوال الليل عند 37 درجة. تمت إضافة LDL الأصلي (50 ميكروغرام / مل) إلى آبار المجموعة الضابطة واحتضانها طوال الليل. تم إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة متبوعًا بتلطيخ الزيت الأحمر O لتحديد توليد خلايا الرغوة.

انتقال ناقلات الفيروس الغدي.قمنا بجمع تركيبات Adenovirus للتعبير عن Ad (RGD) -mouse TRPV4 (Ade-TRPV4 ؛ ~ 1010 pfu / ml) ، وناقلات Adenovirus الفارغة ، Ad (RGD) -CMV-null (Ade-Vec ؛ 1011 pfu / ml) ، من ناقلات بيولابس ، مالفيرن ، بنسلفانيا. استخدمنا 1 × 108 pfu / ml لجميع التجارب. بالنسبة لدراسات توليد خلايا الرغوة ، تم تحضين البلاعم البريتونية الفأرية باستخدام Ade-TRPV4 أو Ade-Vec في وسائط DMEM لمدة 72 ساعة قبل إضافة oxLDL لتوليد خلايا رغوة البلاعم.

ربط وامتصاص ox-LDL.لتقييم الارتباط ، عولجت الضامة البريتونية بجرعتين (1 أو 10 ميكرومتر) من لينكد إن أو مركبة لمدة 3 ساعات وحضنت بـ DiI-oxLDL عند 4 درجات لمدة ساعة واحدة. بعد المعالجة المسبقة بـ Linkedin أو السيارة ، تم تحضين الخلايا بـ DiI-oxLDL عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة لتقييم الامتصاص. تم التقاط الصور بواسطة الفحص المجهري الفلوري (63x) ، وتم استخدام الصورة J لتحديد النتائج.

تحليل التدفق الخلوي.تمت زراعة الضامة البريتونية الناتجة عن مادة Thioglycolate في DMEM ، بنسبة 10 بالمائة FBS لمدة 24 ساعة. تم غسل الخلايا غير المقيدة ، وأضيف الوسط الخالي من المصل ، وحضنت الخلايا لمدة ساعتين متبوعة بإضافة 5 ميكرومتر من GGT أو السيارة ، واستمر الحضانة لمدة 3 ساعات. تم كشط الخلايا المعالجة من اللوحة وتعليقها في برنامج تلفزيوني ، 2 في المائة من مساحة سطح الجسم. تم تحضين الخلايا بأجسام مضادة أولية لمدة 45 دقيقة متبوعة بحضانة لمدة 30 دقيقة مع جسم مضاد ثانوي مترافق مع PE. تم استخدام مقياس التدفق الخلوي FACSCantoII (BD Bioscience ، أونتاريو ، كندا) للحصول على البيانات. تمت معالجة جميع البيانات باستخدام برنامج FlowJo.

qRT ‑ PCR.تمت معالجة الضامة التي يسببها ثيوجليكولات بـ 5 ميكرومتر من لينكد إن أو بمركبة لمدة 3 ساعات ؛ تمت إضافة 25 ميكروغرام / مل من oxLDL إلى السيارة أو الخلايا المعالجة Linkedin ، واستمرت الحضانة طوال الليل. تم استخدام RNeasy Micro Kit (# 74،004) من QIAGEN لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي ، وتم استخدام Universal SYBR Green One-Step Kit من Bio-Rad لعكس نسخ الحمض النووي الريبي. تم استخدام C1000 Touch Cycler (Bio-Rad) للحصول على البيانات. تم تحديد التعبير عن الجين كمقدار مرنا خاص بالجينات بالنسبة لـ GAPDH mRNA باستخدام طريقة CT المقارنة الموضحة في نشرة مستخدم نظام Bio-Rad qRT-PCR.

تحليل احصائي.يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SEM لثلاث نسخ بيولوجية. GraphPad Prism 7. تم استخدام برنامج 0 ، وتم إجراء الحسابات باستخدام اختبار الطالب t لمجموعتين أو ANOVA أحادي الاتجاه لمجموعات متعددة.

الموافقة الأخلاقية.أجريت جميع التجارب على الفئران وفقًا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة جامعة ماريلاند كوليدج بارك.

نتائج in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>ثلاثة أضعاف. ص<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

الشكل 1. تحديد قائم على الفحص شبه عالي الإنتاجية لـ Linkedin باعتباره مثبطًا جديدًا لـ TRPV4 من مكتبة من المركبات الطبيعية. (أ) مخطط انسيابي يوضح سير العمل الذي أدى إلى تحديد جينكستين كمثبط محتمل لـ TRPV4 من مكتبة تضم 2000 مركب طبيعي. (ب) يُظهر تسجيل FlexStation 3 التمثيلي التأثير المثبط لـ 6 مركبات طبيعية على ناهض TRPV4 (GSK1016790A) الناتج عن Ca2 بالإضافة إلى التدفق في BMDMs المحملة بالكالسيوم 6 أثناء الفحص الثانوي. أظهرت المعالجة المسبقة لجميع المركبات الستة تأثيرات مثبطة على تدفق الكالسيوم المعتمد على TRPV 4- مقارنة بالخلايا المعالجة مسبقًا بالمركبة (التحكم السلبي ؛ السيارة بالإضافة إلى GSK1016790A (10 نانومتر)) أو حامض أيون الكالسيوم (A23187 ، 2 ميكرومتر). استخدمنا مضاد TRPV4 الانتقائي ، GSK2193874 (10 نانومتر) ، كعنصر تحكم سلبي. تم تكرار جميع التجارب ثلاث مرات في أربع مرات. RFU: وحدة الفلورة النسبية.

يؤدي تثبيط TRPV4 بواسطة GGT إلى إبطال تكوين خلايا رغوة الضامة المستحثة بـ oxLDL.أظهرت دراساتنا السابقة أن TRPV 4- الذي تسبب في حدوث Ca2 بالإضافة إلى التدفق المتضمن في تكوين خلايا الرغوة بوساطة oxLDL 14،16. لذلك ، قمنا بتقييم احتمال أن يكون تكوين خلايا الرغوة قد تم تثبيطه عن طريق استعداء نشاط TRPV4 بوساطة GGT. تم تحضين الضامة البريتونية من النوع البري باستخدام oxLDL للحث على تكوين خلايا الرغوة في وجود أو عدم وجود GGT ، وتم تحليلها بواسطة تلطيخ Oil Red O. كما هو متوقع ، وجدنا أن توليد الخلايا الرغوية زاد بمقدار خمسة أضعاف في البلاعم المعالجة بـ oxLDL مقارنةً بالـ LDL الأصلي (الشكل 2 أ ، ب). ومع ذلك ، فإن علاج الضامة باستخدام GGT (1 أو 10 ميكرومتر) قبل التحفيز باستخدام oxLDL أدى إلى انخفاض كبير في النسبة المئوية للخلايا الرغوية (الشكل 2 أ ، ب). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى وجود تأثير مثبط لـ GGT على تكوين خلايا رغوة البلاعم الذي قد يستهدف TRPV 4- مما أدى إلى حدوث Ca2 بالإضافة إلى التدفق. علاوة على ذلك ، قمنا بإفراط في التعبير عن TRPV4 في الضامة الفارغة TRPV4 باستخدام بنية الفيروس الغدي ثم تسببنا في تكوين خلايا الرغوة باستخدام oxLDL في وجود GGT. وجدنا أن الإفراط في التعبير عن TRPV4 زاد من تكوين خلية الرغوة التي تم حظرها عندما قمنا بمعالجة الخلية مسبقًا باستخدام GGT ، مما يشير إلى أن تثبيط تكوين خلية الرغوة المسببة للتولد بواسطة GGT يعتمد على TRPV4 (الشكل 2C ، D).

لا يمنع GGT المستوى الأساسي للتعبير عن TRPV4 والمستقبلات الالتهابية.يلعب مستقبلات الزبال CD36 دورًا رئيسيًا في امتصاص وربط oxLDL وتشكيل خلايا الرغوة ، وهي عمليات حرجة في تصلب الشرايين 4–7،54،55. في الآونة الأخيرة ، تشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى تورط مستقبلات شبيهة بالحصيلة في تصلب الشرايين. للتحقق مما إذا كانت GGT قد أوقفت تكوين خلايا الرغوة من خلال التأثير على تعبير CD36 و TLR4 و TLR6 و TRPV4 ، أجرينا تحليل اللطخة المناعية بتركيزين من GGT (1 أو 5 ميكرومتر). وجدنا مستويات تعبير مماثلة لـ CD36 و TRPV4 و TLR6 و TLR4 مقارنةً بالتحكم غير المعالج (الشكل 3 أ-د). كشف تحليل التدفق الخلوي أيضًا عن عدم وجود فرق كبير في تعبير سطح الخلية للبروتينات مع أو بدون معالجة GGT (الشكل 3E-H ، I-L). بالنظر إلى كل ذلك معًا ، تشير هذه النتائج إلى أن GGT يمنع تكوين خلايا رغوة البلاعم دون تثبيط المستويات القاعدية للتعبير السطحي لـ TRPV4 و CD36 و TLR4 و TLR6.

الشكل 2. تثبيط TRPV4 بواسطة Linkedin يلغي تكوين خلايا رغوة الضامة المستحثة بـ oxLDL. (أ) تم علاج الضامة البريتونية التي يسببها الثيوجليكولات طوال الليل بـ 50 ميكروغرام / مل من oxLDL ، متبوعًا بحضانة مسبقة لمدة 3 ساعات مع مركبة أو 1 أو 10 ميكرومتر لينكد إن. عولجت الخلايا بـ 50 ميكروغرام / مل من LDL الأصلي (VLDL) كعنصر تحكم. التكبير الأصلي: 40x. (ب) يظهر القياس الكمي للنتائج في (أ). عدد الخلايا / الحالة =500. اختبار الطالب *** ص<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

امتصاص oxLDL، ولكن عدم الربط بواسطة الضامة يتم منعه بواسطة GGT. نظرًا لأنه ثبت سابقًا أن TRPV4 له دور في امتصاص oxLDL وتكوين خلايا الرغوة ، قمنا بتقييم ما إذا كان العلاج باستخدام GGT قد تسبب في حدوث خلل في ارتباط oxLDL على سطح البلاعم. تمت معالجة الضامة البريتونية WT باستخدام GGT قبل الحضانة باستخدام DiI-oxLDL عند 4 درجات ، وتم تقييم الارتباط. تشير النتائج إلى أن ارتباط oxLDL على سطح البلاعم لم يتم إعاقته بشكل كبير بواسطة معالجة GGT (1 أو 10 ميكرومتر) مقارنةً بالتحكم في السيارة (الشكل 5 أ-ج). بعد أن أثبتنا أن GGT لا يثبط ارتباط oxLDL ، نهدف بعد ذلك إلى تحديد ما إذا كان امتصاص oxLDL في البلاعم قد أضعف من خلال علاج GGT. ومن المثير للاهتمام ، أشارت نتائجنا إلى وجود تثبيط كبير في امتصاص oxLDL في البلاعم في الخلايا GGT المعالجة مسبقًا مقارنة بالمجموعة المعالجة بالمركبة (الشكل 6 أ ، ب). بالنظر إلى كل ذلك معًا ، تشير هذه النتائج إلى أن GGT يمنع امتصاص oxLDL ، ولكن ليس ملزمًا ، في الضامة.

يحجب GGT التعبير المستحث بـ oxLDL لـ TRPV4 في البلاعم.

نظرًا لأن دراساتنا المنشورة سابقًا أظهرت أن TRPV 4- أثار Ca2 plus يلعب دورًا في تكوين خلايا رغوة البلاعم بوساطة oxLDL ، فقد سعينا إلى تحديد ما إذا كان GGT يعيق تكوين خلايا الرغوة عن طريق قمع التعبير الناجم عن oxLDL عن CD36 ، TLR2 أو TLR4 أو TLR6 أو TRPV4. وجدنا أن التحفيز الليلي للخلايا الضامة باستخدام oxLDL أدى إلى تنظيم كبير للتعبير عن بروتينات TRPV4 مقارنة بـ LDL ، بينما ظل التعبير عن المستقبلات الأخرى (CD36 و TLR2 و TLR4 و TLR6) دون تغيير (الأشكال 4 أ-و). أدت المعالجة المسبقة للخلايا باستخدام GGT قبل التحفيز باستخدام oxLDL بشكل انتقائي إلى خفض مستوى التعبير عن بروتينات TRPV4 مقارنةً بمعالجة المركبات (الشكل 4A-F). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى وجود تأثير مثبط لـ GGT على تعبير بروتين TRPV4 ، والذي قد يكون جزءًا من تثبيط تكوين خلايا الرغوة بواسطة GGT.

الشكل 3. علاج لينكد إن لا يغير البروتين الكلي أو التعبير السطحي لـ TRPV4 و CD36 و TLRs في الضامة. (أ - د) اللطخات المناعية لبلاعم الخلايا الكاملة للخلايا بعد العلاج طوال الليل بـ 1 أو 5 ميكرومتر لينكد إن أو مركبة. تُظهر اللطخات المناعية التمثيلية تعبيرًا بروتينيًا إجماليًا لـ CD36 (A) و TRPV4 (B) و TLR6 (C) و TLR4 (D) في الخلايا المعالجة بـ Linkedin وغير المعالجة. تم إجراء ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة و 3 مكررات تجريبية لكل مجموعة من التجارب. (E-H) تحليل التدفق الخلوي للبلاعم المعالجة بين عشية وضحاها باستخدام 5 ميكرومتر ينكدين أو غير معالج يظهر التعبير السطحي لـ TRPV4 (E) و CD36 (F) و TLR4 (G) و TLR6 (G) في الخلايا غير المعالجة والمعالجة المرتبطة. تم تحليل ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة و 30 خلية 000 لكل حالة. (I-L) التحليل الكمي للنتائج من (E-H). تم التحليل بواسطة اختبار t ثنائي الذيل مع فاصل ثقة بنسبة 99 بالمائة. عدد الخلايا في التجربة ، 30 ، 000 ؛ مكررين تجريبيين.

يمنع GGT تنشيط JNK2 المسبق المنشأ والالتهاب في البلاعم. أظهرت التقارير المنشورة من مختبرنا وغيره أن تنشيط JNK2 يلعب دورًا مهمًا في تكوين الخلايا الرغوية وتصلب الشرايين. لتحديد ما إذا كان GGT يمكن أن يمنع تنشيط JNK1 / 2 ، تم علاج الضامة باستخدام GGT متبوعًا بالتحفيز باستخدام LPS أو oxLDL. أظهرت نتائج تحليل اللطخة المناعية أن العلاج باستخدام GGT قمع بشكل كبير الفسفرة المستحثة بـ oxLDL أو LPS لـ JNK1 / 2 مقارنةً بالتحكم غير المعالج أو الأصلي المعالج بـ LDL (الشكل 7 أ-د). لقد ثبت أن تنشيط JNK في البلاعم يحفز نسخ الوسطاء الالتهابيين المرتبطين بتصلب الشرايين 58-60. لتحديد ما إذا كان بإمكان GGT منع التعبير عن هذه المنظمات المسببة للالتهاب في البلاعم ، تم تحفيز الخلايا المعالجة بـ GGT باستخدام oxLDL ومستويات تعبير mRNA لـ TNF و IL 6 و IL1 و MCP1 عن طريق تحليل qRT-PCR. اكتشفنا انخفاضًا كبيرًا في التنظيم في مستويات التعبير المستحثة بـ oxLDL لـ TNF و IL12 و IL1 و MCP1 mRNA في الخلايا المعالجة بـ GGT مقارنةً بالضوابط المعالجة بواسطة المركبات (الشكل 7E-I). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن GGT يمنع تنشيط JNK2 المسبق المنشأ والتعبير الجيني الالتهابي استجابة لتحفيز oxLDL في البلاعم. المناقشة من المعروف أن المركبات الطبيعية مثل الفلافونويد والبوليفينول تعدل استجابات القلب والأوعية الدموية عبر آليات متنوعة ، مثل تثبيط الإشارات الالتهابية ، وحساسية الأنسولين ، وحالة الأكسدة ، وتحسين ملامح الدهون في الدم. هنا ، نُبلغ عن التعريف القائم على الفحص شبه عالي الإنتاجية والتوصيف الوظيفي لـ Linkedin ، وهو فلافون ، كمثبط جديد للعمليات الوراثية / الالتهابية Prothero المعتمدة على TRPV 4- في البلاعم. أظهرنا على وجه التحديد أن i) ginkgetin يحجب TRPV 4- بوساطة Ca2 بالإضافة إلى التدفق إلى الضامة ، ii) أدى حصار ginkgetin لوظيفة TRPV4 إلى انخفاض ملحوظ في تكوين خلايا الرغوة المستحثة بـ oxLDL عن طريق قمع امتصاص oxLDL في الضامة ، و 3) كتل جينكستين الفسفرة المستحثة بـ LPS و oxLDL لـ JNK1 / 2 ، والتعبير عن بروتينات TRPV4 ، والتعبير الجيني الالتهابي. في المجمل ، أظهرت نتائج دراستنا أن الجنكيتين يثبط وظيفة البلاعم المسببة للعدوى / الالتهابية بطريقة تعتمد على TRPV 4-. يتغذى تصلب الشرايين ، وهو مرض الشريان الأورطي ، في البداية عن طريق الالتهاب واحتقان الضامة مع oxLDL ، مما يؤدي إلى تكوين الخلايا الرغوية الضامة ، والتي تتطور لاحقًا لتشكل تصلب الشرايين. نظرًا لأن تكوين خلايا الرغوة هو عملية حاسمة في تصلب الشرايين ، فإن فهم تكوين خلايا الرغوة والتلاعب بها يمكن أن يكون له إمكانات علاجية. من المعروف أن البلاعم تعبر عن مجموعة من القنوات الأيونية المخترقة للأغشية والمضخات ، بما في ذلك TRPV4 ، وهي قناة متعددة الأوضاع Ca2 بالإضافة إلى قناة أيون قابلة للنفاذ ، والتي يتم تنشيطها بواسطة كل من المحفزات الفيزيائية والكيميائية الحيوية. حددت الدراسات المنشورة من قبل مختبرنا وآخرون دور TRPV4 في التهاب البلاعم وتكوين خلايا الرغوة المستحثة بـ oxLDL. وبالتالي يمكن أن يكون TRPV4 بمثابة هدف قابل للتطبيق للتخفيف من العمليات الأولية.

الشكل 5. لا يمنع Linkedin ارتباط DiI-oxLDL بالبلاعم. تمت معالجة الضامة مسبقًا بالمركبة أو Linkedin (1 أو 10 ميكرومتر) لمدة 3 ساعات تليها الحضانة باستخدام oxLDL المسمى بـ DiI (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة ساعة عند 4 درجات. (أ) الصور المجهرية التمثيلية الفلورية (التكبير الأصلي ، 63 ×) لربط DiI-oxLDL على سطح غشاء البلاعم (عدد الخلايا / الحالة =20). (ب) تظهر نتائج التجربة A كملف تعريف مؤامرة باستخدام برنامج NIH ImageJ. (C) التحليل الكمي للنتائج من خلايا / حالة A. n =20. في تحسين تصلب الشرايين عن طريق تقليل MMP -2 و MMP -9 وزيادة مستويات NO و NOS في الشريان الأورطي الصدري للجرذ. في هذه الدراسة ، أوضحنا أن كتل جينكجين TRPV 4- تسببت في تدفق Ca2 بالإضافة إلى تدفق الضامة. من الناحية الميكانيكية ، أظهرنا أن الجينكيتين يمنع امتصاص oxLDL ، ولكن ليس ملزمًا ، في الضامة. اقترحت الدراسات التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر دورًا حاسمًا لـ CD36 كمستقبل الزبال الرئيسي في امتصاص oxLDL وتشكيل خلايا الرغوة الضامة. تبين أن الفئران الخالية من خلايا CD36 التي تفتقر إلى ApoE أو LDLR تكون أقل عرضة للإصابة بآفات تصلب الشرايين 5،6. حددت الدراسات السابقة من مجموعتنا دورًا أساسيًا لـ CD 36- سلسلة إشارات JNK في تكوين خلايا الرغوة الضامة 7. تعمل المستقبلات الشبيهة بـ TLR2 و TLR4 و TLR6 كمستقبلات من خلال التفاعل مع CD36 وقد ثبت أنها متورطة في تصلب الشرايين. لقد درسنا احتمال أن نقص تكوين الخلايا الرغوية التي شوهدت في الضامة المعالجة بـ Linkedin كان بسبب انخفاض التعبير عن بروتينات CD36 أو TRPV4 أو TLR2 أو TLR4 أو TLR6. ومن المثير للاهتمام ، أن علاج Linkedin لم يقلل بشكل كبير من التعبير عن بروتينات CD36 أو TLR2 أو TLR4 أو TLR6 عند المستويات القاعدية أو في ظل ظروف تحفيز oxLDL. ومع ذلك ، فقد منع لينكد إن على وجه التحديد تنظيم التعبير عن بروتينات TRPV4 الناجم عن oxLDL ، بينما ظل تعبيره عند المستويات القاعدية دون تغيير. بالنظر إلى كل ذلك معًا ، تشير هذه النتائج إلى أن الجينكستين يمنع تكوين خلايا الرغوة التي يسببها oxLDL عبر آلية مستقلة عن تعبير CD36 و TLR ، ولكنها تعتمد على TRPV4. أظهرت الدراسات السابقة من مجموعتنا وغيرها أن تنشيط JNK2 متورط في تكوين خلايا الرغوة وتطور آفات تصلب الشرايين. تم الإبلاغ أيضًا أن JNK متورط في تعديل MMP -9 و MMP -13 ، والتي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في آفات تصلب الشرايين. بالنظر إلى الارتباط المعترف به لـ JNK في عمليات تصلب الشرايين ، أردنا تحديد ما إذا كان ginkgetin يمكن أن يمنع تنشيط JNK. وفقًا للتقارير السابقة ، أظهرت نتائجنا أيضًا أن الجنكستين يمنع الفسفرة الناجم عن التحفيز الناتج عن التحفيز لـ JNK2 في البلاعم. تشير هذه النتيجة إلى آلية محتملة يقوم من خلالها Linkedin بحظر تكوين خلايا الرغوة. علاوة على ذلك ، وجدنا انخفاضًا كبيرًا في التنظيم في التعبير الناجم عن oxLDL لـ TNF و IL12 و IL1 و MCP1 mRNA في الخلايا المعالجة بالجينكيتين مقارنةً بالتحكم في السيارة ، مما يبرز الأدوار المحتملة المضادة للالتهابات للجنكستين استجابةً لـ oxLDL. باختصار ، أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن الجينكجين يثبط وظيفة البلاعم المسببة للولادة والالتهابية بطريقة تعتمد على TRPV 4-. وبالتالي تعزز هذه النتائج الأساس المنطقي لاستخدام المركبات الطبيعية في تطوير العلاجات المحتملة و / أو الكواشف الكيميائية الوقائية.

مراجع
1. Barquera، S. et al. نظرة عامة عالمية على وبائيات مرض تصلب الشرايين القلبي الوعائي. قوس. ميد. الدقة. 46 ، 328-338 (2015).
2. Moore، KJ & Tabas، I.T. البيولوجيا الخلوية للبلاعم في تصلب الشرايين. الخلية 145 ، 341–355 (2011).
3. ليبي ، P. التهاب في تصلب الشرايين. طبيعة 407 ، 233 - 241 (2002).
4. ماكلارين ، جي إي ، ميشاي ، دكتور ، أشلين ، تي جي ورامجي ، دي بي سيتوكينات ، استقلاب شحوم البلاعم ، وخلايا الرغوة: الآثار المترتبة على علاج أمراض القلب والأوعية الدموية. بروغ. الدقة الدهنية. 50 ، 331–347 (2011).
5. Febbraio، M. et al. يحمي الاضطراب المستهدف لمستقبلات الزبال من الفئة ب CD36 من تطور آفة تصلب الشرايين في الفئران. J. كلين. يستثمر. 105 ، 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor، VV et al. فئة مستقبلات الزبال AI / II و CD36 هي المستقبلات الرئيسية المسؤولة عن امتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة المعدل مما يؤدي إلى تحميل الدهون في الضامة. J. بيول. تشيم. 277 ، 49982-49988 (2002).
7. رحمان ، سو وآخرون. يعد تسلسل الإشارات المعتمد على القرص المضغوط 36- ضروريًا لتكوين خلايا رغوة البلاعم. ميتاب الخلية. 4 ، 211-221 (2006).
8. روس ، R. Atherosclerosis- مرض التهابي. إن إنجل جي ميد. 340 (2) ، 115-126 (1999).
9. آليات ليبي P. تي الجزيئية للمضاعفات التخثرية لتصلب الشرايين. J. المتدرب. ميد. 517-527 ، 2008.
10. Lusis، AJ Atherosclerosis. طبيعة 407 ، 233 - 241 (2000).
11. ماثيوز ، بي دي وآخرون. التنشيط الفائق السرعة للقنوات الأيونية TRPV4 بواسطة القوى الميكانيكية المطبقة على إنتغرينات بيتا 1 على سطح الخلية. عدد صحيح. بيول. (كامب). 2 (9) ، 435-442 (2010).
12. Sharma، S.، Goswami، R. & Rahaman، SO Te TRPV 4- محور إشارات النقل الميكانيكي TAZ في صلابة المصفوفة و TGF 1- المستحث في الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة. خلية مول. بيونج 12 ، 139-152 (2019).
13. Goswami، R.، Arya، RK، Biswas، D.، Zhu، X. & Rahaman، SO مطلوب مستقبلات عابرة فانيلويد 4 لاستجابة جسم غريب وتشكيل خلية عملاقة. أكون. J. باتول. 189 (8) ، 1505-1512 (2019).
14. Goswami، R. et al. قناة TRPV4 النفاذة للكالسيوم هي عبارة عن منظم جديد لتكوين خلايا رغوة الضامة التي يسببها LDL المؤكسد. راديك مجاني. بيول. ميد. 110 ، 142-150 (2017).