التعرف على جينات الساعة المرتبطة بارتفاع ضغط الدم في الكلى من الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا
Feb 20, 2022
معرفتيهناك تباين نهاري في تقلب ضغط الدم الناتج عن ارتفاع ضغط الدم ، ويعتبر شذوذ تقلب ضغط الدم عامل خطر مستقل لتلف الأعضاء بما في ذلك مضاعفات القلب والأوعية الدموية. في الدراسة الحالية ، حاولنا تحديد الجزيئات المسؤولة عن تكوين الإيقاع اليومي لضغط الدم تحت سيطرةالكلىالساعة البيولوجية في ارتفاع ضغط الدم.
طُرق تم إجراء تحليل ميكروأري DNA فيالكلىمن 5- فئران تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا (SHRs) / Izm ، جرذان SHR المعرضة للسكتة الدماغية (SHRSP) / إزم ، وفئران Wistar Kyoto (WKY) / Izm. لاكتشاف الاختلاف ، تم تحفيز الخلايا الظهارية الأنبوبية بالماوس (TCMK -1) باستخدام dexa- ميثازون. أجرينا تحليل التلوين المناعي واللطخة الغربية فيكلوينخاعالكلىمن 5- أسبوع WKY جرذان و SHRs.
النتائجاستخرجنا 1032 جينًا باستخدام E-box ، وهو تسلسل ربط لـ BMAL1 و CLOCK باستخدام تحليل إثراء مجموعة الجينات. في تحليل ميكروأري ، حددنا 12 جينًا زادت بأكثر من 2- ضعف فيالكلىمن SHRs و SHRSP مقارنة بالفئران WKY. في تحليل الانحدار الدوري ، أظهر فسفوريبوزيل بيروفوسفات وسط الناقل (Ppat) والتخلف العقلي الهش X ، أظهر متماثل جسمي 1 (Fxr1) إيقاعًا يوميًا. كشفت الكيمياء الخلوية المناعية عن إيجابية PPAT في النوى والسيتوبلازم في الأنابيب ، وإيجابية FXR 1- في سيتوبلازم TCMK -1. في WKY rat و SHR البالغان من العمر 5- أسبوعًاالكلى، تم ترجمة PPAT في النواة والسيتوبلازم للأنابيب القريبة والبعيدة ، وتم ترجمة FXR1 إلى سيتوبلازم الأنابيب القريبة والبعيدة.
الاستنتاجاتPPAT و FXR1 جزيئات محورية في التحكم في ضغط الدم إيقاع الساعة البيولوجية بواسطةالكلىفي ارتفاع ضغط الدم.
الكلمات الدالة:ضغط الدم؛؛ ارتفاع ضغط الدم. الكلى؛ حويصلة الكلية. الفئران ارتفاع ضغط الدم تلقائيا
الظواهر البيولوجية المختلفة ، بما في ذلك دورة النوم ومعدل ضربات القلب وضغط الدم ، لها إيقاع يومي. بالنسبة للإيقاع اليومي ، تم اكتشاف وجود الساعة البيولوجية ، ثم ثبت أن الإيقاع اليومي موجود في جميع الكائنات الحية من البكتيريا القديمة إلى البشر. 1
تعتبر النواة فوق التصالبية (SCN) ، التي تعمل كساعة مركزية ، مركزًا يمارس تذبذبًا ذاتيًا لإيقاع الساعة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحكم في الساعات الداخلية الموجودة في الأعضاء المحيطية بواسطة الساعات المركزية ، وتحديد الإيقاع المناسب لكل عضو. 2 تتحكم الساعة المركزية في الساعات الطرفية عبر عوامل عصبية وخلطية. يتكون SCN من عدد كبير من الخلايا العصبية التي تتذبذب بشكل مستقل ، عندما تم عزل هذه الخلايا وتشتت في الفئران والفئران ، أظهروا إيقاعات الساعة البيولوجية مع اختلافات طفيفة في وتيرة إطلاقها والتعبير الجيني. وبالتالي ، فإن الخلايا العصبية الفردية في SCN هي خلايا على مدار الساعة لها مذبذبات الساعة البيولوجية الخاصة بها. 3
في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إيقاع الساعات البيولوجية. تتكون الساعة البيولوجية من حلقة رئيسية يعمل فيها الدماغ والعضلات الشبيهة 1 (BMAL1) ، ودورات الإخراج الحركي اليومي kaput (CLOCK) ، و Period (PER) ، و Cryptochrome (CRY) كبروتينات أساسية. تشكل كل من CLOCK و BMAL1 ثنائيات تعمل كعامل نسخ وترتبط بتسلسل E-box (CACGTG). 4 تشمل الجينات المستهدفة جينات الساعة الأخرى ، مثل Per and Cry. تنتقل بروتينات PER و CRY المتولدة إلى النواة وتثبط جينات BMAL1 و CLOCK. بعد ذلك ، يتم حل PER و CRY بمرور الوقت من خلال الفسفرة متعددة الخطوات بواسطة الكازين كيناز (CKIε) ، سينثاز الجليكوجين (GSK -3) ، وبروتين كيناز AMP المنشط (AMPK). وهكذا ، تم إلغاء قمع BMAL1 و CLOCK بواسطة PER و CRY ، ويبدأ الترويج للتعبير الجيني بواسطة CLOCK و BMAL1 مرة أخرى ، والساعة تدور. بالإضافة إلى هذه الحلقة الرئيسية ، هناك أيضًا حلقة فرعية تشتمل على مجموعة فرعية من المستقبلات النووية 1 مجموعة D عضو 1 (NR1D1) ، مستقبلات اليتيم المرتبطة بمستقبلات حمض الريتينويك (ROR) ، موقع D لبروتين ربط محفز الألبومين (DBP) ، و E4 بروتين رابط المحفز 4 (E4BP4). يرتبط NR1D1 بتسلسل RRE (AGGTCA) ويمنع الحلقة الرئيسية عبر ردود الفعل السلبية ، بينما يعزز DBP الحلقة الرئيسية عبر ردود الفعل الإيجابية عن طريق الارتباط بتسلسل D-box (TTATGTAA). 5 ويشار أيضًا إلى أن البروتينات التي تدق الإيقاع اليومي تحت سيطرة الساعة البيولوجية تصل إلى ما يقرب من 15 في المائة في كل نسيج. 6 تشارك الساعة البيولوجية في تكوين إيقاعات الساعة البيولوجية لمختلف الظواهر الفسيولوجية.
من المعروف أن هناك تباينًا نهاريًا في تذبذب ضغط الدم الناتج عن ارتفاع ضغط الدم ، ويعتبر اضطراب تقلب ضغط الدم عامل خطر مستقل لتلف الأعضاء بما في ذلك مضاعفات القلب والأوعية الدموية. 7 يؤدي اضطراب النظم اليومي في ضغط الدم إلى تلف الأعضاء. هناك العديد من التقارير حول العلاقة بين ضغط الدم والساعات البيولوجية ، مثل Per و Cry و Bmal1 و Clock. تم الإبلاغ عن انخفاض ضغط الدم ، وفقدان التقلبات اليومية لضغط الدم ، وإصابة الخلايا البطانية الوعائية في الفئران Bmal1 بالضربة القاضية. أفادت الفئران التي خرجت على مدار الساعة أنها أظهرت زيادة في إفراز الصوديوم في البول ، وانخفاض ضغط الدم ، وحتى انخفاض معدل ضربات القلب وانخفاض معدل نبضات القلب على مدار الساعة البيولوجية. 9 دشتي وآخرون ذكرت أن جينات الساعة تحفز نسبة كبيرة من التباين المظهري في ضغط الدم الانقباضي. 10
فيما يتعلق بمساهمةالكلىلإيقاعات الساعة البيولوجية العاديةالكلىلديهم إفراز أكبر للإلكتروليت وإنتاج البول أثناء النهار أكثر من الليل ، وهناك إيقاع يومي في إفراز الصوديوم والبوتاسيوم والكلور. 11 في ارتفاع ضغط الدم ، تم الإبلاغ عن أن فشل الإيقاع اليومي لهذه الوظائف يرتبط بمضاعفات القلب والأوعية الدموية. 12 الفئران بالضربة القاضية Per1 تظهر زيادة في إفراز الصوديوم وانخفاض ضغط الدم فيما يتعلق بالوحدة الفرعية منكلويقناة الصوديوم الظهارية (ENaC) في مجرى التجميع منالكلى، مما يدل على وجود ساعة بيولوجية فيالكلى.13 بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تباين نهاري في ضغط الدم (حالة عدم القدرة على تحمل الوزن) في المرضى الذين يعانون من أمراض مزمنةمرض كلوي. 14 وهكذا ، فإن الساعة المركزية الموجودة في SCN تنظمكلويالساعة الطرفية ، بمناسبة التوقيت الأمثل لـالكلى.
تم الإبلاغ عن الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم تلقائيًا (SHR) ، وهي نموذج وراثي لارتفاع ضغط الدم الأساسي ، تظهر انحرافًا في معدل ضربات القلب والتقلبات اليومية لضغط الدم ، والتي تتعزز بالشيخوخة. 15 سابقًا ، قمنا بفحص الساعة البيولوجية للغدة الكظرية في فئران SHR و Wistar Kyoto (WKY) التي تم الحفاظ عليها تحت 12- ساعة من الضوء والظلام ووجدنا أن SHR تمتلك ساعة كظرية غير طبيعية
وإظهار الإيقاع اليومي المتغير للأنزيم الذي يحد من معدل الترميز الجيني الذي يتم التحكم فيه على مدار الساعة في نشأة الستيرويد وكذلك مستوى الجلوكوكورتيكويد في المصل. 16 بالإضافة إلى الإشارة الصادرة عن ساعة SCN المركزية ، يُعرف الجلوكوكورتيكويد المنطلق من الغدة الكظرية بمزامنة الساعة البيولوجية المحيطية في عضو آخر. 17 يمكن أن يؤدي تحفيز الديكساميثازون إلى إعادة إنتاج التقلبات اليومية لجين الساعة ويمكن أن يكون قابلاً للتطبيق للدراسة في المختبر. 18 في هذا الظرف ، من الممكن أن يكون لدى SHR أيضًا ساعات يومية محيطية غير طبيعية في أعضاء مختلفة بما في ذلكالكلىالذي يلعب دورًا محوريًا في تنظيم ضغط الدم. ومع ذلك ، فإن الساعة اليومية فيالكلىمن SHR لم يتم فهمه بشكل كامل.
في الدراسة الحالية ، حاولنا تحديد جينات الساعة المسؤولة لـالكلىفي ارتفاع ضغط الدم باستخدام SHR والفئران المعرضة للسكتة الدماغية SHR (SHRSP) ، وتقييم أدوار جينات الساعة المشاركة في تنظيم ضغط الدم غير الطبيعي إيقاع الساعة البيولوجية.
طُرق
الأخلاق والحيواناتيتوافق التحقيق الذي أجريناه مع دليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH Publication No. 85-23 ، 1996). تم تقييم بروتوكولات البحث التي تنطوي على استخدام الحيوانات الحية من قبل لجنة الأخلاقيات بكلية الطب بجامعة نيهون (رقم 11–034). تم شراء فئران WKY / Izm و SHR / Izm التي يتم الاحتفاظ بها في جمعية الأبحاث التعاونية النموذجية للأمراض من Japan SLC (Hamamatsu ، Shizuoka ، اليابان). تم قياس ضغط الدم الانقباضي بطريقة الكفة الذيلية. في هذه الدراسة ، من أجل تجنب التغيرات الثانوية في التعبير الجيني عن طريق ارتفاع ضغط الدم وللتعرف على الجينات المسؤولة التي تؤثر على إيقاعات الساعة البيولوجية وتربط في النهاية ارتفاع ضغط الدم ، اخترنا فئرانًا قبل ارتفاع ضغط الدم 5- عمرها أسبوع.
ابحث عن الجينات باستخدام E-box في الجينوم الكامل
استخدمنا قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية في تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA ؛ معهد برود ، بوسطن ، ماساتشوستس) للبحث في مجموعة الجينات عن أهداف عامل النسخ البشري واستخدمنا قاعدة البيانات التي تحتوي على أكبر عدد من الجينات المنبع من نقطة بداية النسخ A الجين ، الذي كان E-box (CACGTG) موجودًا عند 2 ، 000 bp upstream.
تحليل ميكروأري الحمض النووي
الكلىتمت إزالته من جرذان SHR / Izm و SHRSP / Izm و WKY / Izm البالغ عمرها أسبوعًا في الساعة 12: 00. المستأصلالكلىتم تجانسه مع معيار TaKaRa BioMasher (Takara ، Otsu ، Shiga ، اليابان) ، وتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. بعد التهجين والمسح الضوئي ، تم إجراء القياس الكمي باستخدام Agilent Feature Extraction 1 0. 7.3.1 (Agilent Technologies). تمت مقارنة وفحص التعبير الجيني. تم استخراج الجينات التي يتقلب تعبيرها بين السلالات بحد يزيد عن 2- ضعف أو أقل من 0. 5- أضعاف.
الكشف عن تباين الجينات المرشحة في خلايا TCMK -1
تم تحفيز الخلايا الظهارية الأنبوبية للفأر (TCMK {0}) من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA) باستخدام 0.5 ميكرو مول / لتر ديكساميثازون كما هو موصوف
سابقًا. 18 تم تغيير الوسيط إلى Dulbecco's Modified Eagle Medium الخالي من المصل. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي كل 4 ساعات بعد تحفيز الديكساميثازون ، وتم تحديد كمية وفرة Npm1 و Nptx1 و Trim46 و Plbd1 و Plagl1 و Bcl6 و Fxr1 و Tbl1 و Hnrnpa3 و Ppat و Tef mRNAs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. في نفس الخطوة ، تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الفعلي على الحمض النووي الريبي المنزوع هيدروجين الفوسفات 3- واستخدم كمعيار داخلي. يتم سرد الاشعال المستخدمة في الجدول التكميلي S1 عبر الإنترنت. تم تحليل دورية تذبذب الرنا المرسال بعد تحفيز خلايا TCMK -1 بواسطة تحليل الانحدار متعدد المتغيرات الذي حدد منحنى الشبكة (MESS) والسعة (AMP) والمرحلة (TZ1) عن طريق تحسين منحنى جيب التمام باستخدام طريقة المربعات الصغرى: تقديرات MESS و AMP و TZ1 ؛ تم حساب فواصل الثقة بنسبة 95 في المائة باستخدام طريقة المصادفة الواحدة.
تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا TCMK {0}}تم إصلاح خلايا TCMK -1 بنسبة 4 بالمائة لامتصاص العرق. بعد الغسل بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ PPAT
(Sigma-Aldrich) مخفف 250 مرة والجسم المضاد أحادي النسيلة للأرنب (Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) مخفف 300 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم إجراء تخفيف 1 ، 000- أضعاف من Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (Invitrogen) ، كجسم مضاد ثانوي ، للتفاعل في الظلام لمدة ساعة واحدة.
المناعة في الكلى من جرذان WKY و SHRالكلوينخاعالكلىمن 5- فئران WKY / Izm و SHR / Izm التي تبلغ من العمر أسبوعًا وتم عزلها ودمجها في البارافين ، واحتضانها بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ PPAT المخففة 250 مرة ، وتم تخفيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة في الأرانب المضادة لـ FXR1 200 مرة. تم تطبيق Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences ، طوكيو ، اليابان) كجسم مضاد ثانوي. تم تجفيف الشرائح ، وتنظيفها ، وختمها بالمارينول ، وتم ملاحظتها تحت المجهر الضوئي.
النشاف الغربي لبروتينات FXR1 و PPAT في الكلى من فئران WKY و SHRالكلويتم إخضاع النخاع لاستخراج البروتين باستخدام المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي (Nacalai Tesque ، كيوتو ، اليابان). تم نقل الشرائح إلى غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيل مع iblot (Invitrogen) وتم حظرها باستخدام محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 5 بالمائة لمدة ساعة واحدة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية ، والتي كانت الأرانب أحادية النسيلة المضادة لـ FXR1 ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ PPAT. تم استخدام IgG الماعز المترافق مع بيروكسيداز الفجل (Jackson ImmuneReseach ، West Grove ، PA) كجسم مضاد ثانوي. تم استخدام GAPDH كمعايير داخلية.
تحاليل احصائيةتم الإبلاغ عن القيم على أنها تعني ± SE. تم استخدام اختبار الطالب t لتحليل البيانات غير المزاوجة. تم أيضًا استخدام تحليل طريقة 2- للتباين مع إجراء Bonferroni / Dunn كاختبار لاحق. قيم P<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">
النتائج
ضغط الدمكان ضغط الدم الانقباضي {0} لجرذان WKY / Izm بعمر أسبوع ، وفئران SHR / Izm ، وفئران SHRSP / Izm 116 ± 3.0 (n=6) ، 121 ± 3.3 (n=6) ، و 125 ± 3.4 (ن=5) ملم زئبق ، على التوالي. لم يختلف ضغط الدم الانقباضي بين السلالات الثلاث إلى حد معتد به إحصائياً.
ابحث عن الجينات باستخدام E-box في المروج بواسطة تحليل GSEAلقد بحثنا عن الجينات التي تحمل تسلسل ربط E-box (CACGTG) لـ CLOCK و BMAL1 heterodimer في الجينوم بأكمله. نتيجة لذلك ، تم تحديد 1032 جينة تحمل صندوقًا إلكترونيًا بين 2 ، 000 نقطة أساس في المنبع أو في اتجاه التيار من نقطة بدء النسخ (الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت).
مقارنة التعبير الجيني في الكلى من فئران WKY و SHR و SHRSP عن طريق تحليل ميكروأري للحمض النوويقارنا التعبير الجيني فيالكلىمن 5- فئران WKY / Izm البالغة من العمر أسبوعًا وفئران SHR / Izm باستخدام مصفوفات الحمض النووي الدقيقة. تم التعبير بشكل كبير عن ثلاثمائة وثلاثة وستين جينًا (أكثر من 2- ضعف) فيكلويقشرة فئران SHR / Izm بالمقارنة مع فئران WKY / Izm. مستويات التعبير عن 281 جينًا فيالكلىكانت أكثر من 0. 5- أضعاف مقارنة بفئران WKY / Izm. في الكلويالنخاع في جرذان SHR / Izm ، أظهر 284 جينًا مستويات تعبير أعلى و 203 جينًا
أظهرت مستويات تعبير أقل مقارنة بفئران WKY / Izm. في الكلويقشرة فئران SHRSP / Izm ، كانت مستويات التعبير لـ 267 جينًا أكثر من 2- ضعف مقارنة بتلك الموجودة في فئران WKY / Izm. كانت مستويات التعبير لـ 58 0 جينًا أقل من 0. 5- أضعاف مقارنةً بفئران WKY / Izm. في الكلوينواة SHRSP / Izm ، أظهر 639 جينًا مستويات تعبير أعلى وأظهر 251 جينًا مستويات تعبير أقل مقارنةً بفئران WKY / Izm. من بين 1032 جينًا مع صندوق إلكتروني ، كان مستوى التعبير لـ 17 جينًا mRNAs أكثر من 2- ضعف فيكلويقشرة الفئران SHR / Izm بالمقارنة مع
الشكل 2. الاختلاف في التعبير عن الجينات المرشحة mRNAs في خلايا TCMK -1 بعد تحفيز الديكساميثازون. تم تحفيز خلايا TCMK -1 باستخدام 0. 5 ميكرو مول / لتر ديكساميثازون لمدة ساعتين. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي كل 4 ساعات بعد تحفيز الديكساميثازون ، وتم تقييم وفرة Npm1 و Nptx1 و Trim46 و Plbd1 و Plagl1 و Bcl6 و Fxr1 و Tbl1 و Hnrnpa3 و Ppat و Tef mRNAs من خلال تفاعل سلسلة البوليميراز في الوقت الفعلي. تم تحليل التعبير الجيني النسبي بالمقارنة مع GAPDH مرنا. يتم تقديم البيانات على أنها المتوسط ± SEM (ن=6).
فئران WKY / Izm. من بين هذه الجينات الـ 17 ، زاد التعبير عن 4 جينات (Bcl6 و Nr1d1 و Ppat و Tef) أكثر من 2- ضعف فيكلويقشرة فئران SHRSP / Izm بالمقارنة مع فئران WKY / Izm (الجدول 1). في الكلويقشرة فئران SHR / Izm ، تم الكشف عن تعبير واحد 0 من الجينات mRNA ، والتي انخفضت إلى أقل من 0. 5- أضعاف مقارنة بفئران WKY / Izm ؛ 8 من هذه الجينات (Fxr1 ، Hnrnpa3 ، Npm1 ، Nptx1 ، Plagl1 ،
تم أيضًا تقليل Plbd1 و Tbl1x و Trim46) إلى أقل من 0. 5- أضعاف فيكلويقشرة فئران SHRSP / Izm (الجدول 1). التعبير mRNA عن 10 جينات فيكلويتمت زيادة النخاع من فئران SHR / Izm أكثر من 2- ضعف مقارنة بفئران WKY / Izm. من بين هذه الجينات العشرة ، يكون التعبير Nr1d1 و Tef mRNA فيكلويتمت زيادة النخاع من فئران SHRSP / Izm أكثر من 2- ضعف مقارنة بفئران WKY / Izm (الجدول 1). تعبير مستقبلات الترانسفيرين (Tfrc) مرنا فيكلويأظهر نخاع فئران SHR / Izm أقل من 0. 5- أضعاف مقارنة بفئران WKY / Izm. ومع ذلك ، تمت زيادة تعبير Tfrc مرنا فيكلوينخاع فئران SHRSP / Izm (الجدول 1).
تحريض الجينات mRNAs على مدار الساعة في الخلايا الكلويةيوضح الشكل 1 التباين في تعبير Per1 و Bmal1 و Nr1d1 و Cry1 mRNAs بعد إضافة dex- amethasone في خلايا TCMK -1. أظهرت سعة تعبير Per1 و Bmal1 و Nr1d1 mRNA ذروتها عند 28 و 44 ساعة بعد 4 ساعات من تحفيز الديكساميثازون. أظهرت سعة تعبير Cry1 mRNA قممًا عند 4 و 28 و 44 ساعة بعد 4 ساعات من تحفيز الديكساميثازون. وبالتالي ، تسبب تحفيز الديكساميثازون في تقلب تعبير الرنا المرسال لجين الساعة في TCMK -1 (الشكلان 1 و 2).
تحفيز ديكساميثازون. بلغ التعبير mRNA لـ Ppat ذروته في 28 ساعة بعد التحفيز باستخدام الديكساميثازون ، ثم زاد مرة أخرى بعد 44 ساعة. أظهر Hnrnpa3 قممًا عند 16 و 28 و 44 ساعة وأظهر سعة مماثلة نسبيًا لـ Per1. أظهر Npm1 ذروة عند 28 ساعة ، على غرار Per1. أظهر Fxr1 ذروة في 24 و 44 ساعة (الشكل 2). أجرينا تحليل الانحدار الدوري لتقييم الأهمية الإحصائية لهذه الاختلافات. أشار التحليل إلى أن الاختلاف في تعبير Cry1 و Bmal1 mRNA أظهر تواترًا كبيرًا (P <0. 0="" 5)="" بعد="" تحميل="" الديكساميثازون="" في="" خلايا="" tcmk="" -1="" (الشكل="" التكميلي="" s1="" والجدول="" s3="" عبر="" الانترنت).="" تظهر="" نتائج="" تحليل="" الانحدار="" الدوري="" لـ="" 7="" جينات="" في="" الشكل="" التكميلي="" s2="" والجدول="" s3="" عبر="" الإنترنت.="" أشار="" التحليل="" إلى="" أن="" fxr1="" و="" ppat="" أظهران="" انحدارًا="" معنوًا="" (p=""><0.05). في="" انحدار="" fxr1="" ،="" أظهرت="" كل="" من="" الفترة="" والسعة="" موجات="" كبيرة="" ،="" بينما="" في="" ppat="" ،="" كانت="" كل="" من="" الفترة="" والسعة="" صغيرين="" وأظهرت="" إيقاعًا="">
المناعة المناعية لـ PPAT و FXR1 في الخلايا الكلوية وفي الكلى من فئران WKY و SHRتم ترجمة PPAT في كل من السيتوبلازم والنواة. تم ترجمة FXR1 فقط في السيتوبلازم لخلايا TCMK -1 (الشكل 3). كان ملطخ PPAT في كل من النوى والبلازم الخلوي في الأنابيب القريبة والبعيدة (الشكل 4). كان FXR1 ملطخًا بشكل رئيسي في السيتوبلازم في الأنابيب القريبة والبعيدة (الشكل 4). لم تكن هناك اختلافات واضحة في تلطيخ أو توطين في كليتي فئران WKY و SHR.
تعبير البروتين FXR1 و PPAT في الكلى من فئران WKY و SHRيوضح الشكل 5 النشاف الغربي لبروتينات FXR1 و PPAT فيكلويmedulla من فئران WKY و SHR البالغة من العمر أسبوعًا 5-. كانت وفرة بروتين FXR1 فيكلويكان نخاع فئران SHR أقل بكثير بالمقارنة مع فئران WKY (P <0. 05).="" تعبير="" البروتين="" ppat="">كلويلم تختلف نواة فئران WKY و SHR إلى حدٍ كبيرٍ إحصائيًا.
نقاشارتفاع ضغط الدم يستحث القلب والأوعية الدموية وكلويالمضاعفات ، مثل المزمنةمرض كلوي(كد). من المعروف أن المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن يعانون من اضطرابات تقلبات ضغط الدم ، مما يشير إلى أنالكلىقد تكون متورطة في ضغط الدم غير الطبيعي في إيقاعات الساعة البيولوجية في ارتفاع ضغط الدم. 19 في الدراسة الحالية ، سعينا بالتالي إلى تحديد الجزيئات المسؤولة عن تكوين إيقاع ضغط الدم خلال فترة زمنية محددة تحت سيطرة الساعة البيولوجيةالكلىفي ارتفاع ضغط الدم. حصلنا على 1 ، 0 32 جينًا مرشحًا يحمل تسلسل E-box من قاعدة بيانات GSEA. نظرًا لأن BMAL1 / CLOCK heterodimer يربط E-box لتنظيم نسخ الجينات في اتجاه مجرى النهر ، فإن هذه الجينات يتم التحكم فيها بواسطة ساعة بيولوجية بيولوجية. من أجل تحديد الجزيئات المتضمنة في إيقاع الساعة البيولوجية لضغط الدم في الكلى ، قمنا بفحص شامل للتعبير الجيني في الكلى من فئران SHR و SHRSP و WKY باستخدام ميكروأري للحمض النووي. من بين 1032 جينًا ، اخترنا نصوصًا زادت أكثر من 2- أضعاف أو انخفضت أقل من 0. 5- أضعاف
في SHRالكلىنسبة إلى الفئران WKY. ثم ركزنا على الجينات التي أظهرت اتجاهات مماثلة فيالكلىمن SHRSP ، على وجه التحديد ، Bcl6 و Nr1d1 و Ppat و Tef و Fxr1 و Hnrnpa3 و Npm1 و Nptx1 و Plagl1 و Plbd1 و Tbl1x و Trim46. هذه الجينات الـ 12 التي تحمل تسلسل E-box ، والتي أظهرت مستويات تعبير أعلى أو أقل في كل من الفئران النموذجية المصابة بارتفاع ضغط الدم (SHR و SHRSP) مقارنةً بفئران WKY ذات الضغط الطبيعي ، ربما ترتبط بإيقاع الساعة البيولوجية لضغط الدم. من بين هذه الجينات ، تم الإبلاغ عن Nr1d1 المعروف أيضًا باسم فيروس أرومات الدم الحمراء العكسي (Rev-erb) ، لتشكيل حلقة فرعية من الساعة البيولوجية. 20
تم التأكيد على أن تعريض الخلايا المستنبتة لتحميل الديكساميثازون أو صدمة مصل الحصان عالية التركيز أعاد إنتاج سعة التعبير الجيني على مدار الساعة في المختبر. 21،22 تعتبر إضافة مصل عالي التركيز وجلوكوكورتيكويد مفيدة لإعادة إنتاج إيقاع الساعة البيولوجية للتعبير الجيني على مدار الساعة في الأنسجة المحيطية. 18،23 في هذه الدراسة ، نجحنا في إحداث سعة جينات ساعة Per1 و Cry1 و Nr1d1 mRNA في الجسم الحي مع تحميل الديكساميثازون في الخلايا الظهارية الأنبوبية للفأر. مع تحميل ديكساميثازون ، تمت زيادة Per1 عند 4 و 2 0 - 24 و 44 ساعة بعد التحفيز ، تمت زيادة Cry1 في 0 - 8 و 24-32 ساعة ، وزاد Nr1 d1 عند 0– 4 و 16-24 و 40-44 ساعة. هذه التغييرات مماثلة لتلك المذكورة في التقارير السابقة. 21 باستخدام نظام الديكساميثازون هذا ، حددنا تحريض السعات لجينين: Fxr1 و Ppat. علاوة على ذلك ، أظهر التلميع المناعي أنه تم التعبير عن PPAT في النواة والسيتوبلازم للأنابيب ، وتم التعبير عن FXR1 في سيتوبلازم الأنابيب. تشير هذه النتائج إلى أن هذين الجزيئين يتحكم فيهماكلويالساعة المحيطية وهي مرشحة محتملة لتشكيل إيقاع الساعة البيولوجية لضغط الدم.
كشف النشاف الغربي أن التعبير البروتيني لـ FXR1 كان أقل فيكلوينخاع الفئران SHR من تلك الموجودة في فئران WKY. لم يختلف التعبير عن PPAT في النخاع الكلوي لفئران WKY و SHR إلى حد ذي دلالة إحصائية. ينتمي Fxr1 إلى نفس عائلة الجينات مثل جين التخلف العقلي X الهش 1 (Fmr1) ، والذي يعتبر الجين المسبب لمتلازمة X الهشة. FXR1 هو بروتين رابط لـ RNA يتفاعل مع FMR1 و FXR2. من المفترض أن السيتوبلازم والنواة يمكن أن يكونا متبادلين لأن لديهما إشارات توطين نووية وإشارات تصدير نووية. 24 في البشر ، تبين أن التعبير الشاذ عن Fxr1 في العضلات الهيكلية يسبب الحثل العضلي الوجهي العضدي. 25 في هذه الدراسة ، تم تقليل تعبير Fxr1 فيالكلىمن فئران SHR و SHRSP وتم التعبير عنها في السيتوبلازم الأنبوبي من أصل متوسط ، والذي هو نفسه الموجود في العضلات الهيكلية ، وقد يكون متورطًا في تكاثر الخلايا الأنبوبية ونموها. يشكل PPAT متجانسة متجانسة على شكل دونات ويصبح homotetramer معطلاً عن طريق ربط نيوكليوتيدات البيورين للتأثير على استقلاب حمض البوليك. في هذه الدراسة ، تم زيادة التعبير عن PPAT فيالكلىمن جرذان SHR و SHRSP ، وتم توطين PPAT في السيتوبلازم ونواة الخلايا الأنبوبية. بما أن حمض البوليك له سمية قوية في الأوعية الدموية وهو عامل خطر مستقل لتصلب الشرايين. وبالتالي ، قد ترتبط وظيفة PPAT الشاذة بالسمات الفيزيولوجية المرضية لـ SHR.
طبقت هذه الدراسة تحليلات التسلسل والتعبير وتجارب الخلايا المستنبتة في محاولة جديدة لتضييق نطاق الجزيئات المرتبطة بتنظيم ضغط الدم والتي تتحكم فيها الساعة البيولوجية. علاوة على ذلك ، يتم التحكم في Fxr1 و Ppat بواسطة الساعة البيولوجية وترتبط بتنظيم ضغط الدم. مزيد من الدراسات ضرورية لقياس وتأكيد التباين الزمني للتعبير الجيني Fxr1 و Ppat في الفئرانالكلى.من المتوقع أن يتم توضيح آليات عمل هذه الجزيئات. يعتبر التحكم في هذه الجزيئات هدفًا للمعالجة البيولوجية لاضطرابات تذبذب ضغط الدم.
بناءً على نتائج الدراسة الحالية ، يمكن حدوث حلقة تغذية مرتدة يومية محتملة فيالكلىمن SHR في الشكل 6. يحتوي كل من PPAT و FXR1 على EBOX حيث يرتبط كل من BMAL1 و CLOCK بالمحفز ، مما يشير إلى أنهما متورطان في تكوين إيقاع الساعة البيولوجية في الأنابيب تحت سيطرة جينات الساعة. يُعتقد أنهم يشاركون في إعادة امتصاص وإفراز الماء والكهارل في الأنابيب ، وقد تؤثر على ارتفاع ضغط الدم وإيقاع ضغط الدم اليومي.
وهكذا ، تم اعتبار PPAT و FXR1 جزيئات متورطة في تكوين إيقاع الساعة البيولوجية لضغط الدم فيالكلى. فيما يتعلق بآليات تنظيم ضغط الدم ، فإن هذه الجزيئات هي مرشحة رئيسية للدراسات التي تسعى إلى توضيح الآليات الكامنة وراء تكوين إيقاع ضغط الدم اليومي.
