الإنزيمات النانوية المستشعرة للالتهاب والتي تحاكي الكاتلاز تخفف من إصابة الكلى الحادة عن طريق عكس الإجهاد التأكسدي المحلي Ⅱ

التوزيع الحيوي لإنزيم PTC-M في الفئران IRI

تمت دراسة التوزيع الحيوي لـ PTC في الفئران IRI عن طريق تحميل صبغة الفلورسنت IR780 كدواء نموذجي (PTC-IR780). قمنا أيضًا بمقارنة التوزيع الحيوي لجهازي PC-IR780 وIR780 وحدهما ولاحظنا أن جميع المجموعات أظهرت مضانًا في الأعضاء الرئيسية، إلا أن PTC-IR780 أظهر تراكمًا معززًا في الكلى على عكس مجموعة PC-IR780 أو IR780 (ملف إضافي 1: الشكل S14 A) ). قمنا أيضًا بفحص ملف التوزيع الحيوي لـ PTC-IR780 في الفئران العادية ووجدنا أنه أظهر تراكمًا أعلى في الكبد وهو أمر شائع بالنسبة للجسيمات النانوية بعد الحقن في الوريد ولكنه لم يتراكم كثيرًا في الكلى (ملف إضافي 1: الشكل S15). وهكذا نستنتج أن المحسنكليةتراكممن PTC يتم بوساطة في الغالب عن طريق التهاب الكلى. في دراستنا، قمنا بتصميم جزيئات PTC النانوية بحيث تنتشر في الدم وتتراكم تدريجيًا في موقع الالتهاب، وبعد الوصول إلى موقع الالتهاب، يتزعزع استقرار PTC بسبب وجود ROS المحسن وسيتم تفجير IR780 المحمل. تم إطلاقه والذي يبقى في الكلى لفترة أطول مما يؤدي إلى تعزيز التألق. وتمت مقارنة تراكم الكلى بين جميع المجموعات عن طريق قياس شدة التألق خارج الجسم الحي ولاحظ أن PTC أظهر أداءً متفوقًا.تراكم الكلىعلى الرغم من أنه يظهر مضانًا في الأعضاء الرئيسية الأخرى وهو أمر لا مفر منه في حالة الحقن الجهازي (ملف إضافي 1: الشكل S14 B) كما هو مبين في الشكل 6A، لوحظت كثافة مضان IR780 قوية في الكلى من 6 ساعات بعد حقن PTC -IR780. كانت شدة التألق للأعضاء الرئيسية عالية بترتيب الكبد والرئتين والطحال والكلى. انخفضت كثافة مضان الأجهزة الأخرى مع مرور الوقت، في حين ظلت كثافة مضان الكلى ثابتة نسبيا حتى 48 ساعة. وهكذا،شدة مضان الكلىمقابل الكبد تميل إلى الزيادة تدريجيا مع مرور الوقت (الشكل 6B). قد يكون هذا متسقًا مع الدراسات السابقة التي تشير إلى زيادة فيالتهاب الكلىيمكن أن يؤدي إلى تعزيز نفاذية الأوعية وبالتالي زيادة تراكم NMs في الكلى [16]. تم تأكيد التوزيع الحيوي أيضًا عن طريق فحص محتوى المنغنيز في الأعضاء المختلفة باستخدام تحليل مطياف كتلة البلازما المقترن الحثي (ICP-MS). كما هو مبين في الشكل 6C، بلغ تركيز المنغنيز في كلتا الكليتين ذروته عند 6 ساعات بعد الحقن وانخفض تدريجيًا حتى 48 ساعة. عند مقارنة تركيز المنغنيز في الأنسجة مع تركيز الأعضاء الرئيسية الأخرى، وصلت الكلى إلى تركيز المنغنيز في الأنسجة أعلى من الكبد والرئتين والطحال في أي نقطة زمنية. للتأكد من تصفية PTCM، قمنا بإجراء تحليل ICP-MS لجميع الأعضاء والبراز والبول في نهاية الدراسة، وبعد أسبوع لاحظنا أن جزءًا كبيرًا من المنغنيز ظهر في الأمعاء والبراز. . وقد لوحظ أن تصفية المنغنيز اتخذت في المقام الأول طريق الكبد الصفراوي بدلاً من تصفية الكلى. نحن نفترض أنه بعد تراكمها في الكلى، تتحلل جسيمات Mn3O4 النانوية إلى أيونات Mn والتي تتبع التصفية الكبدية الصفراوية المعتادة لـ Mn (ملف إضافي 1: الشكل S16) [17].

الأعشاب العضوية لأمراض الكلى

إنزيم PTC-M يقلل من علامات تلف الكلى ويخفف من التغيرات المورفولوجية في كليتي الفئران IRI

أخيرًا، أجرينا تجربة على الجسم الحي لتحديد مدى فعالية PTC-M لتقليل تلف الكلى في IRI الكلوي. للتحقيق في الوضع العام للأضرار فيالكلى IRI، قمنا بقياس الليبوكالين المرتبط بجيلاتيناز العدلات البلازمية (NGAL)، وهو علامة معروفة للإصابة الأنبوبية في AKI [18]. كان مستوى NGAL في البلازما أعلى بكثير في مجموعة IRI منه في المجموعة الوهمية ولكن تم تخفيضه عن طريق علاج PTC-M (الشكل 7B). أجرينا تلطيخ حمض شيف (PAS) الدوري للأقسام الكلىللتحقق من التغيرات المورفولوجية (الشكل 7C). وعلى النقيض من الفئران الصورية، لوحظ تورم أنبوبي كلوي، وتوسع مملوء بمواد نخرية. وقد لوحظت الخلايا الالتهابية التي تضخم المساحات الخلالية في كلى الفئران IRI. تم تحسين هذه التغييرات عن طريق العلاج PTC-M. تم تخفيف التورم الأنبوبي والمواد النخرية في الأنابيب وتسلل الخلايا الالتهابية نسبيًا في الفئران IRI المعالجة بـ PTC-M. على عكس التغيرات في الأنابيب، لم تكن هناك اختلافات شكلية كبيرة لوحظت في الكبيبات في كل مجموعة.

PTC-M يخفف الالتهاب وموت الخلايا المبرمج في كلى الفئران IRI

لدراسة ما إذا كان PTC-M يمكن أن يقلل من حركة الرضيع الناجمة عن الإصابة التأكسدية، قمنا بفحص مستوى التعبير البروتيني لـ H O -1 عن طريق تحليل اللطخة الغربية لتقييم درجة الإجهاد التأكسدي في كليتي الفئران IRI. لقد وجدنا مستويات تعبير مرتفعة إلى حد كبير لـ H O -1 في كليتي الفئران IRI، والتي تم تخفيفها عن طريق علاج PTC-M (الشكل 8A). أظهر تلطيخ مناعي كيميائي مناعي لـ H O -1 تعبيره المتزايد في مسراق الكبيبات، والمساحات المحيطة بالكبيبات، والفضاء الخلالي حول الأنبوب لكلى الفئران IRI، والذي انخفض في كليتي الفئران المعالجة بـ PTC-M (الشكل 8C). لتوضيح الالتهاب النشط في كليتي الفئران IRI، قمنا بفحص مستويات النسخ من السيتوكينات المسببة للالتهابات وجزيئات الالتصاق عن طريق تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) (الشكل 8B). مستويات التعبير Te mRNA للإنترلوكين (IL) -6، بروتين الجاذب الكيميائي أحادي الخلية (MCP) -1، عامل نخر الورم (TNF) -، جزيء الالتصاق داخل الخلايا (ICAM) -1، التصاق الخلايا الوعائية تمت زيادة الجزيء (VCAM -1) وعامل النمو المحول (TGF) - بشكل ملحوظ في كليتي الفئران IRI، وقام العلاج باستخدام PTC-M بقمع هذه التغييرات (الشكل 8B). كشف تلطيخ كيميائي مناعي لـ F4 / 80، وهو علامة على البلاعم الفأرية، عن زيادة التعبير في المساحات المحيطة بالكبيبات والخلالي لكليتي الفئران IRI، والتي تم تخفيفها أيضًا عن طريق علاج PTC-M (الشكل 8C). تشير بيانات Tese إلى أن PTC-M يقمع الالتهاب الكلوي والإجهاد التأكسدي في الفئران IRI.

لتقييم درجة موت الخلايا الأنبوبية الكلوية في الفئران IRI، تم تقييم مستوى التعبير البروتيني للبروتينات المبرمج. كشف النشاف المناعي عن زيادة في نسبة Bax/Bcl-2 ونسب caspase 3/caspase 3 المشقوقة في أنسجة الكلى لدى الفئران IRI، مما يشير إلى تفاقم موت الخلايا المبرمج (الشكل 9A). ولم يتم ملاحظة هذه التغييرات في الفئران المعالجة بـ PTC-M. قلل علاج PTC-M بشكل كبير من شلالات موت الخلايا المبرمج في كلية الفئران IRI الناجم عن الإجهاد التأكسدي. لتحديد ما إذا كان PTC-M يمنع موت الخلايا المبرمج بوساطة ROS عبر بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK)، قمنا بتقدير التغييرات في مسار إشارات MAPK. أجرينا تحليل مناعي لمستويات بروتين مسار MAPK وأشكالها المفسفرة (المنشطة) (الشكل 9B). تم تعزيز مستويات Te من ERK وJNK وP38 الفسفورية في كليتي الفئران IRI مقارنة بالفئران الوهمية، والتي تم تخفيفها بواسطة PTC-M، على الرغم من عدم ملاحظة انخفاض كبير في JNK الفسفورية. أظهر تلطيخ نيكند (TUNEL) للديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي المزيد من الخلايا الظهارية الأنبوبية الإيجابية لـ TUNEL في قشرة كليتي الفئران IRI مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الوهمية، في حين أن علاج PTC-M قلل من أعداد الخلايا الإيجابية لـ TUNEL (الشكل 1 أ). 9ج). تشير نتائج Tese إلى أن PTC-M قلل من موت الخلايا المبرمج في كليتي الفئران IRI من خلال التأثير على مسار إشارات MAPK. كانت هذه النتائج في كليتي الفأر IRI متسقة مع النتائج في خلايا الكلى البشرية المحفزة بـ H2O2-، مما يدل على آلية مشتركة لحماية PTC-M الكلوية. تم إجراء تلطيخ H&E على الأعضاء الرئيسية التي تم جمعها من المجموعات الطبيعية والمجموعات المعالجة بـ PTC-M ولم تلاحظ أي تغييرات نسيجية كبيرة تشير إلى الأضرار (ملف إضافي 1: الشكل S17).