عديد السكاريد عناب يخفف فقر الدم في الفئران المصابة بأمراض الكلى المزمنة

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

شيينغ هوانغ وآخرون

الملخص

عديد السكاريد عناب (JP) هي واحدة من الجليكانات النشطة من مصادر الغذاء في فاكهة Ziziphus jujuba ، والتي تم اعتبارها لعلاج نقص الدم. في هذه الدراسة ، أمزمنالكلىمرضتم استخدام نموذج الفئران (CKD) لتقييم تأثير JP وآليته على فقر الدم المرتبط بـ CKD. في الفئران CKD ، تحسن علاج JP بشكل ملحوظالكلىوظيفة, الكلىمرضيإصابة، والمعلمات الدموية ، بما في ذلك زيادة خلايا الدم الحمراء ، والهيموجلوبين ، والهيماتوكريت ، وعدد الصفائح الدموية. علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج الأيض المستهدفة LC-MS / MS أن JP عزز إطلاق الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) في الفئران CKD. إلى جانب ذلك ، قام JP بالتناوب على مستوى إرثروبويتين المصل (EPO) ، والكلى EPO mRNA ، والكلىبروتين EPO عبر HIF- تأشير. بشكل جماعي ، تقدم هذه النتائج دليلًا على أن تأثير JP على فقر الدم المرتبط بمرض الكلى المزمن قد يكون متورطًا في تنظيم إفراز SCFAs وإنتاج الإريثروبويتين ، مما يدعم المزيد من تطوير JP كمكملات غذائية في علاج فقر الدم المرتبط بمرض الكلى المزمن.

الكلمات الرئيسية: عديد السكاريد عنابمزمنالكلى مرضفقر الدم Erythropoietin عامل نقص الأكسجة - أحماض دهنية قصيرة السلسلة

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات حول Cistanche

1 المقدمة

مزمنالكلى مرضيُعرَّف (CKD) بأنه متلازمة إكلينيكية للتشوهات الهيكلية الكلوية أو الإعاقات الوظيفية وأصبح عبئًا متزايدًا على الصحة العامة في جميع أنحاء العالم (Webster، Nagler، Morton، & Masson، 2017). يعد فقر الدم الكلوي من أكثر المضاعفات شيوعًا لمرض الكلى المزمن الذي يساهم في زيادة خطر الوفاة (Locatelli et al. ، 2019). يعد عدم كفاية إنتاج الإريثروبويتين (EPO) عاملاً رئيسيًا معروفًا لفقر الدم في مرض الكلى المزمن (Pappa ، Dounousi ، Duni ، و Katopodis ، 2015). يتم إنتاج EPO في الكبد والكلى، وهو أمر ضروري لإنتاج كرات الدم الحمراء (Lappin & Lee ، 2019). في ظل ظروف نقص الأكسجين ، يمكن للعامل المحفز لنقص الأكسجة (HIF) تنشيط التعبير عن EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe ، 2019). وبالتالي ، فإن استهداف HIF للحث على إنتاج EPO يعتبر استراتيجية علاجية جديدة لعلاج فقر الدم المرتبط بـ CKD.

عناب هو ثمار Ziziphus Jujuba Mill. (Rhamnaceae) ، المعروف أيضًا باسم التاريخ الصيني. عناب له استخدام تقليدي طويل يمتد لآلاف السنين كعشب طبي ومكمل غذائي. يستخدم العناب كمكمل صحي للأشخاص الذين يعانون من أمراض الدم أو يعانون من سوء التغذية المزمن. عديد السكاريد عناب (JP) ، وهو مكون قابل للذوبان في الماء مركب بنسب مختلفة من السكاريد الأحادي وحمض اليورونيك (جي ، هو ، يان ، شي ، وليو ، 2020) ، هو أحد المكونات النشطة داخل العناب (جي وآخرون ، 2017 ) ، والذي تم قبوله جيدًا لإظهار تأثير وقائي للكبد ونشاط تعديل المناعة وتعزيز وظيفة الحاجز المعوي (Liu et al. ، 2015 ، Yue et al. ، 2015). في الواقع ، يُنظر أيضًا إلى JP بشكل شائع على أنه له تأثيرات محتملة على فقر الدم. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لـ JP في علاج فقر الدم لا تزال أقل شهرة.

في السنوات الأخيرة ، تم استخدام المستقلبات على نطاق واسع لفهم العوامل المحتملة التي تساهم في تطور المرض. تم استخدام المستقلبات المستهدفة على نطاق واسع في تحديد العلامات الجزيئية للأمراض البشرية المعقدة مثل CKD. تم التحقق من أن كبريتات الإندوكسيل (IS) وكبريتات p-cresyl (PCS) هي العلامة الحيوية لتطور CKD (Meijers & Evenepoel ، 2011) ، وزيادة درجة تريميثيلامين- N- أكسيد (TMAO) يمكن أن تؤدي مباشرة إلى تليف الكلى البيني والخلل الوظيفي. (تانغ وآخرون ، 2015). الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) ، المستقلبات المعتمدة على الميكروبات في الأمعاء ، هي ركائز الطاقة مع القدرة على التأثير على العمليات الفسيولوجية المختلفة (LeBlanc et al. ، 2017) ، وقد تم الإبلاغ عن تقليل SCFAs للمساهمة في تقدم CKD (Koh، De Vader، Kovatcheva-Datchary، & B¨ ackhed، 2016، Wang et al.، 2019). علاوة على ذلك ، تمكنت SCFAs من حماية بنية الكلى من التلف من خلال تثبيط الإجهاد التأكسدي (Li، Ma، & Fu، 2017). بالتزامن مع ذلك ، وجد أن SCFAs تظهر تأثيرًا مفيدًا على امتصاص الحديد وتنظم التعبير الجيني للجلوبين الجنيني / الجنيني ، مما يحفز الكريات الحمر ويصحح فقر الدم (Tako و Glahn و Knez و Stangoulis ، 2014). آلية SCFAs في فقر الدم الكلوي ومع ذلك لا تزال بحاجة إلى توضيح.

في هذه الدراسة ، نفترض أن JP يمكن أن ينظم إطلاق SCFAs ويحفز إنتاج EPO بوساطة HIF ، والنتيجة هي تصحيح فقر الدم الكلوي. هنا ، سوف نتحرى تأثير JP في تخفيف فقر الدم الكلوي في 5/6 فئران CKD التي يسببها الكلى ، بما في ذلك وظائف الكلى ومعلمات الدم. تم تطوير نهج الأيض المستهدف باستخدام LC-MS / MS لتحديد ثمانية SCFAs بما في ذلك حمض الأسيتيك وحمض البروبانويك وحمض الأيزوبوتريك وحمض الزبد 2- وحمض الميثيل وحمض الفاليريك وحمض الهكسانويك في البراز و يتم تقييم عينات الكلى ومستويات SCFAs المستهدفة في الفئران الصحية و CKD. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف أيضًا عن تورط إشارات HIF في الفئران المعالجة بالـ JP.

التين. 1. اللوني النموذجي GC-MS لـ JP. (أ) الصيغ الهيكلية أحادية السكاريد بعد اشتقاق خلات الألدونونتريل ؛ (ب) التوصيفات التمثيلية للكروماتوغرافيا الأيونية المختلطة GC-MS (MIC) لمزيج السكريات الأحادية القياسي والسكريات الأحادية المتحللة بالماء JP. كانت القمم في ملامح الكروماتوغرافيا مطابقة للعلامة الكيميائية الموضحة في (أ): 1. رامنوز ، 2. أرابينوز ، 3. فوكوز ، 4. زيلوز ، 5. مانوز ، 6. جلوكوز ، 7. جالاكتوز ، 8. إينوزيتول (ISTD) ).

2. المواد والأساليب

2.1. تحضير عديد السكاريد عناب

تم شراء ثمار Z. jujuba من Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co.، Ltd. تمت المصادقة على المواد من قبل الدكتور Jianping Chen وفقًا لدستور الأدوية لجمهورية الصين الشعبية لعام 2015. تم الاحتفاظ بعينات القسيمة في مستشفى شينزن للطب الصيني التقليدي برقم 18100601.

تم استخراج JP الخام من العناب كما هو موضح سابقًا ، مع تعديلات طفيفة (Ji et al. ، 2020). باختصار ، تم تحضين العناب بـ 10 حجم من الماء (ت / ث) في حمام مائي عند 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات واستخلاصها 3 مرات. بعد الترشيح ، اجمع بين المرشحات وقم بتكثيف هذا المزيج في مبخر دوار تحت فراغ متحكم فيه. تم ترسيب محلول المركز بشكل إضافي عن طريق إضافة أربعة أضعاف من الإيثانول (حجم / حجم) عند 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تم جمع الراسب بالطرد المركزي وتم تجفيفه تحت ضغط مخفض حتى التجفيف للحصول على JP الخام. تم تحديد نقاء JP ليكون 80 بالمائة باستخدام مقياس السعرات الحرارية.

2.2. توصيف تكوين السكاريد الأحادي لعناب السكاريد

نظام Shimadzu GC – MS (Shimadzu GC – MS TQ8 0 4 0 متصل بـ Shimadzu GC 2010 plus) مزود بمصدر EI ، SH-Rxi -5 عمود شعري MS (30 م × 0.25 مم ID ، 0.25 ميكرون سمك الفيلم ، شيمادزو) لتحديد السكريات الأحادية المتحللة المشتقة بنسبة انقسام 10: 1. كانت درجة حرارة الحقن ومصدر الأيونات والواجهة 250 درجة مئوية و 200 درجة مئوية و 250 درجة مئوية. تم تعليق درجة الحرارة الأولية للعمود عند 120 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم تم رفعها عند 15 درجة مئوية / دقيقة إلى 160 درجة مئوية وتم الاحتفاظ بها لمدة 4 دقائق ، 2 درجة مئوية / دقيقة إلى 165 درجة مئوية وتم الاحتفاظ بها لمدة دقيقتين ، 20 درجة مئوية. /

دقيقة إلى 195 درجة مئوية ، 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 250 درجة مئوية ، وتبقى لمدة 3 دقائق. تم الاحتفاظ بمعدل تدفق غاز حامل الهليوم عند 46 سم / ثانية وتم حقن 2 ميكرولتر من كل عينة في الأداة. تم تحديد كمية التحليلات في وضع مراقبة الأيونات (SIM) المحدد ، الأيون المستهدف: رهامنوز (م / ض 129. 00) ، أرابينوز (م / ض 115. 00) ، الفوكوز (م / ض) z 103. 00) ، زيلوز (م / ع 115. 00) ، مانوز (م / ع 115. 00) ، جلوكوز (م / ع 115. 00 ) ، الجالاكتوز (م / ض 115. 00) ، إينوزيتول (م / ع 126. 00). تم إدراج معايير السكريات الأحادية على النحو التالي: L (زائد) -arabinose (1506-200202) ، fucose (112014–201902) ، D-xylose (111508–201605) ، D-glucose (110833–201908) ، rhamnose (111683–201502) ) ، الجالاكتوز (100226-2017) ، D-mannose (140651–201805) تم شراؤها من المعاهد الوطنية لمراقبة الغذاء والدواء. تم الحصول على الإينوزيتول من سيجما (أنا 7508-50 ز).

تم تحلل الـ JP المستخلص (10 مجم) إلى سكريات أحادية مع 10 مل من 2 مول / لتر من حامض الخليك ثلاثي الفلور (TFA) عند 105 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، وتم تركيز السكريات الأحادية المتحللة بالماء من JP وغسلها تحت ضغط منخفض عند 60 درجة مئوية إلى إزالة TFA ، وأعيد تكوين البقايا بواسطة 2 مل ماء. تمت إضافة 250 ميكرولتر من 20 مجم / مل من محلول هيدروكسيل أمين هيدروكلوريد / بيريدين إلى 100 ميكرولتر من محلول السكريات الأحادية المتحلل بالماء وحفظه في حمام مائي 90 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم تمت إضافة 250 ميكرولتر من أنهيدريد الخل وتبقى في حمام مائي 90 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة أخرى. في نهاية التفاعل ، تم استخلاص الخليط بمقدار 1 مل من الهكسان الحلقي 5 مرات ، وتم تركيز طبقة الهكسان الحلقي إلى 1 مل. حقن طاف 1 ميكرولتر في GC-MS للتحليل (لي وشي ، 2013).

2.3 الحيوانات

تم إجراء جميع التجارب مع البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة استخدام رعاية الحيوان المؤسسية بجامعة قوانغتشو للطب الصيني. تم الحصول على جرذان Sprague-Dawley ، ذكورًا وإناثًا ، بوزن 180-220 جم ، من مركز حيوانات المختبر الطبي في قوانغدونغ (فوشان ، الصين ، رقم الإذن SCXK (Yue) 2008-0002) وتم الحفاظ عليها في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ) منشأة حيوانية تحت دورة مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة ، مع الطعام والماء بحرية.

للحث على الفشل الكلوي ، تم إجراء استئصال الكلية 5/6 وفقًا للوصف السابق (Chen et al. ، 2019). تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت التخدير بنسبة 10٪ كلورال هيدرات. اتخذت مجموعة العمليات الصورية (ن=6) نفس الخطوات لفتح تجويف البطن وكشف الكلى. تم تقسيم فئران استئصال الكلية 5/6 بشكل عشوائي إلى مجموعتين. الجرذان بدون علاج (مجموعة CKD ، n=6) ، والجرذان التي تتلقى JP (CKD plus JP group ، n=6) ​​عن طريق الفم بجرعة 1.2 جم / كجم / يوم. بعد 90 يومًا من العملية ، بدأت 90 يومًا من الإعطاء. كان اليوم التسعون هو آخر وقت لإعطاء الجرذان JP إلى الفئران ، وبعد 24 ساعة تم التضحية بالحيوانات عن طريق أخذ الدم من الشريان الأورطي البطني ، وتم جمع عينات البول والبراز والمصل والكلى من كل جرذ. تم تخزين جميع العينات عند -80 درجة مئوية قبل إجراء مزيد من التحليل.

2.4 التحليل البيوكيميائي

وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، تم قياس نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) وكرياتينين المصل (Scr) بواسطة مجموعة أدوات الكشف عن مصل الكرياتينين ومجموعة أدوات الكشف عن BUN (WAKO ، Ginza ، اليابان) ، وتم قياس البروتين البولي بواسطة Elisa kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution ، نانجينغ ، الصين). تم تحليل خلايا الدم الحمراء (RBC) والهيموغلوبين (Hb) والهيماتوكريت (HCT) وعدد الصفائح الدموية (PLT) بواسطة أنظمة أمراض الدم (Siemens 2021i ، Erlangen ، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

2.5 الفحص النسيجي

تم استخدام تلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) وتلطيخ ماسون لتقييم الإصابة المرضية الكلوية ، من بينها ، تم استخدام تلطيخ PAS للكشف عن الضمور الأنبوبي الكلوي ومنطقة الكبيبات ، وكان تلطيخ ماسون للتليف الخلالي الكلوي (Xie et al. ، 2020). تم إجراء طريقة التحليل الكمي وفقًا للدراسات السابقة (Chen et al. ، 2019). باختصار ، تم تعريف درجة الضمور الأنبوبي في تلطيخ PAS على النحو التالي: 1. أنبوب ضامر وحيد نادر. 2. عدة مجموعات من الأنابيب الضامرة. 3. ضمور جسيم. تم قياس المنطقة الكبيبية بواسطة برنامج ZEN 3.1 (Axio Scope A1 ، ZEISS ، Jena ، ألمانيا). تم قياس المنطقة الليفية في تلطيخ ماسون باستخدام برنامج Image J (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التقاط ما لا يقل عن عشرة حقول مجهرية (200 ×) من 6 فئران لكل مجموعة بشكل عشوائي لقياس درجة الضمور ، ومنطقة الكبيبات ، ومنطقة التليف ، مع وجود كُبيبة واحدة على الأقل في كل حقل مجهري.

2.6. تحليل الكيمياء المناعية

كان قسم البارافين الكلوي (4 ميكرومتر) من كل عينة عبارة عن تجفيف تدريجي بواسطة الزيلين مرتين ، والإيثانول المتدرج (1 0 0-95-90-80-70٪) ، تم استرجاع المستضد باستخدام محلول حامض الستريك (درجة الحموضة 6.0 ) لمدة 30 دقيقة ، مسدودًا بنسبة 3 في المائة من بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق ومصل الماعز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين أقسام الأنسجة بشكل منفصل بواسطة الجسم المضاد الأولي HIF -1 (Bioss، bs -0737 R، 1: 500، Lot: BA01279129)، HIF -2 (Bioss، bs -1447 R ، 1: 500 ، Lot: BJ2044786) عند 4 درجات مئوية لمدة 10 ساعات والجسم المضاد الثانوي المضاد للأرنب الماعز المقترن HRP (Abcam ، ab6712 ، 1: 1000) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، تم استخدام DAB (ديامينوبيزيد في) الكشف عن نشاط HRP ، تم مقاومة النواة بواسطة الهيماتوكسيلين. ال. تم تحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية تحت الحقول المجهرية 400 × من كل مجموعة وتم إصلاح شريط المقياس=20 ميكرومتر بواسطة Axio Scope A1 ، ZEISS ، Jena ، ألمانيا. كان النوى عبارة عن تلطيخ باللون الأزرق بواسطة الهيماتوكسيلين وكانت الإيجابية المناعية لـ DAB بنية اللون ، أما تلطيخ DAB الأعمق يعني أقوى كيمياء مناعية إيجابية.

2.7. كشف EPO

تم اكتشاف محتوى مصل EPO بواسطة مجموعة ELISA (Abcam ، ab274398) ، وكانت التجربة تشير إلى بروتوكول مجموعة ELISA. كما تم تلخيصه ، تمت إضافة كوكتيل الأجسام المضادة لـ EPO إلى العينة واحتضانها لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، تغسل كل بئر بغسل المخزن المؤقت 3 مرات ، تضاف TMB إلى الثانية المحتضنة لمدة 15 دقيقة وتوقف التفاعل.

تم استخراج مرنا الكلى الكلي من أنسجة الكلى المجمدة باستخدام Trizol وترجمة mRNA إلى (كدنا). تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA USA ، K0223) وفقًا لبروتوكول الشركات المصنعة. تم الحصول على إشارة SYBR الخضراء وقياسها بواسطة ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems، Foster City، CA). كانت المواد الأولية: 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC -3 ′ و 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG -3 ′ للجرذان EPO (214 نقطة أساس ، NM _017001. 2) ؛ 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G -3 ′ و 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C - 3 ′ لـ GAPDH (181 بت في الثانية ، NM _017008. 3) ، عشيرة التدبير المنزلي كرقابة داخلية في جميع الأحوال. وتم حساب الكمي النسبي للتعبير الجيني بطريقة التعبير الجيني الطبيعي (2− ΔΔCT).

تم تحميل كميات متساوية من البروتين من محلولات قشرة الكلى وفصلها بنسبة 10 في المائة من هلام SDS ثم نقلها إلى أغشية النيتروسليلوز. بعد تجميدها في حليب خالي من الدسم بنسبة 5 في المائة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، تم تحضين الأغشية بجسم مضاد أولي عند 4 درجات مئوية طوال الليل. ثم تم تحضين الأغشية باستخدام HRP (بيروكسيداز الفجل) - المقترن IgG (تقنيات الحياة) المضادة للفأر في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. تم تصور نشاط HRP باستخدام Clarity Western ECL Substrate وتحليله بواسطة نظام التصوير Tanon. تم استخدام الجسم المضاد الأولي التالي في هذه الدراسة: أحادي النسيلة EPO (B - 4) من الفئران (Santa Cruz Biotechnology ، sc -5290 ، 1/500 التخفيف) ، وحيد النسيلة -اكتين من الفئران (تقنية إشارات الخلية ، 8H10D10 ، تخفيف 1/1000).

2.8. تحليل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة

نظام Shimadzu UHPLC-LCMS / MS (Shimadzu LC-MS 8045 مع واجهة Shimadzu LC -20 AD) مزود بمصدر ESI.

تم إجراء عمليات الفصل الكروماتوغرافي على Shim-pack GIST C18 (2.1 × 1 0 0 عمود ، 2 ميكرومتر) ، باستخدام {{1 0}}. 1٪ حمض الفورميك في الماء ( المذيب أ) والأسيتونيتريل (المذيب ب) بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة بواسطة شطف متدرج: 0-9 دقائق ، 25-30٪ ب ؛ 9-11 دقيقة ، 30-40 في المائة ب ؛ 11-20 دقيقة ، 40-50 بالمائة ب ؛ 20-20.1 دقيقة ، 50-100 بالمائة ب ؛ 20.1-23 دقيقة ، 100 بالمائة ب ؛ 23.1 دقيقة -25 بالمائة ب لإعادة الموازنة. كانت درجة حرارة العمود 35 درجة مئوية ، وتم الاحتفاظ بجهاز أخذ العينات عند 4 درجات مئوية أثناء التحليل ، تم حقن 1 ميكرولتر من كل عينة في الأداة. تم إجراء الكشف عن المادة التحليلية في وضع مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) ، والتي تعمل في وضع الأيونات الموجبة. معلمات MS: تدفق غاز البخاخات: 3.0 لتر / دقيقة ؛ تدفق غاز التجفيف: 10 لتر / دقيقة ؛ تدفق غاز التسخين: 10 لتر / دقيقة ؛ درجة حرارة DL: 250 درجة مئوية ؛ درجة حرارة الواجهة: 300 درجة مئوية ؛ كتلة التسخين: 400 درجة مئوية. تم اختيار انتقالات MRM وطاقة الاصطدام (CE) وتحسينها عن طريق التسريب المباشر لكل مشتق قياسي. تم تلخيص كميات التحليلات انتقالات MRM في الجدول S1.

SCFAs البرازية: تمت إضافة 100 ميكرولتر من 50 بالمائة من الأسيتونيتريل إلى 3 ملغ من البراز المجفف بالتجميد ودوامة لمدة دقيقتين. ثم تم الطرد المركزي للخليط عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 ْم والمادة الطافية ماصة.

SCFAs في الكلى: يتم وزن 100 مجم من أنسجة الكلى ويتم تدويرها على الجليد مع 4 أضعاف محلول ملحي طبيعي (100 مجم / 400 ميكرولتر) لتحضير تجانس الأنسجة. تمت إضافة الميثانول البارد 3 مرات إلى تجانس الأنسجة 300 ميكرولتر ودوامة لمدة دقيقتين ، ثم تم الطرد المركزي للخليط عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية والمادة الطافية. تم تجفيف المادة الطافية بواسطة N2 وإعادة تكوينها بواسطة 100 ميكرولتر 50 بالمائة أسيتونتريل.

تمت إضافة 500 مليمول / لتر N - (3- ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -Ń-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC ، علاء الدين ، شنغهاي ، الصين) ، 50 مليمول / لتر 3 ساعات- [1،2،3] -Triazolo [4 ، 5- ب] بيريدين -3- أول (HOAT ، علاء الدين ، شنغهاي ، الصين) و 50 مجم / مل 12C-Dansylhydrazine (12C-DnsHz ، J&K ، بكين ، الصين) في 20 ميكرولتر من العينة المستخرجة في تسلسل مع نفس الحجم. تم تحضير EDC و HOAT باستخدام 500 مليمول / لتر 2- (N-Morpholino) من حمض إيثان سلفونيك (MES ، Macklin ، شنغهاي ، الصين). بعد الحضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، تمت إضافة 20 ميكرولتر 50 ملي مول / لتر من CuCl2 (Macklin ، شنغهاي ، الصين) إلى الخليط لإخماد تفاعل الاشتقاق عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (Zhao & Li ، 2018). في نهاية عملية الاشتقاق ، تم تخفيف الخليط 10 مرات بنسبة 25 بالمائة أسيتونيتريل. قبل التحليل ، تم خلط 100 ميكرولتر طاف بمحلول قياسي داخلي 100 ميكرولتر. تم استخدام ملصق 13C-DnsHz كمعايير داخلية (ISTD 1-8) وفقًا لتفاعل الاشتقاق نفسه. معيار SCFA: حمض الخليك (AA ، A116173) ، وحمض البروبانويك (PA ، P110446) ، وحمض الأيزوبيوتريك (IBA ، I103524) ، وحمض الزبد (BA ، B110438) ، 2- حمض الميثيل الزبداني (2- تم توفير BA ، M107377) ، وحمض isovaleric (IVA ، I108280) ، وحمض الفاليريك (VA ، V108271) ، وحمض hexanoic (HA ، H103632) من Aladdin (شنغهاي ، الصين).

2.9 تحليل احصائي

تم التعبير عن بيانات كل مجموعة على أنها تعني ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء الأهمية الإحصائية بين المجموعات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه والتحليل اللاحق مع اختبار Student-Newman-Keuls (SNK) أو اختبار Dunnett's T3. تم اعتبار قيمة P <0. 0="" 5="" ذات="" دلالة="" إحصائية.="" تم="" إجراء="" جميع="" البيانات="" باستخدام="" برنامج="" إحصائيات="" spss="" (الإصدار="" 22.0="" ،="" spss="" inc.="" ،="" chicago="" ،="" il="" ،="" الولايات="" المتحدة="">

3. النتائج

3.1. تحسن JP من وظائف الكلى لفئران CKD

تم تمييز السكاريد الأحادي لـ JP قبل العلاج على الحيوانات. يتكون JP المستخدم في هذه الدراسة من سبعة سكريات أحادية ، وهي رهامنوز (1.62 بالمائة) ، أرابينوز (15.79 بالمائة) ، فوكوز (0. 21 بالمائة) ، زيلوز (4.56 بالمائة) ، مانوز (3. 00 بالمائة) ، جلوكوز (73.44 بالمائة) ، وجالاكتوز (4.99 بالمائة) (الشكل 1). تم التحقق من صحة طريقة التحليل الخاصة بنا عن طريق الخطية والدقة والتكرار والاستقرار والاسترداد (الجداول S2 إلى S3). تم التأكد من ثبات المواد التحليلية عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. يجب أن يكون عائد JP أعلى من 8.63 في المائة ، ويجب ألا تقل درجة النقاء عن 77.16 في المائة. خدم التحليل الكيميائي المذكور أعلاه لـ JP كنهج لمراقبة الجودة لضمان استنساخ الدراسات الحيوانية أدناه.

كان Scr و BUN والبروتين البولي أكثر تمثيلًا لوظائف الكلى. كانت مستويات البروتينات Scr و BUN والبروتين البولي في جرذان CKD أعلى بكثير من تلك الخاصة بالمجموعة الصورية (P <{{0}. 01).="" بعد="" 90="" يومًا="" من="" العلاج="" باستخدام="" jp="" ،="" انخفضت="" مستويات="" scr="" و="" bun="" والبروتين="" البولي="" مقارنة="" بمجموعة="" ckd="" (p=""><0.01) (الشكل="" 2="">

3.2 خفف JP من الإصابة المرضية الكلوية في الفئران CKD

تم استخدام وزن الكلية اليمنى الكاملة للمجموعة الصورية والكلى اليمنى المتبقية لمجموعة CKD و CKD بالإضافة إلى مجموعة JP لتقييم مورفولوجيا الكلى عن طريق وزن الكلى (KW) ووزن الكلى / وزن الجسم (KW / BW). في نهاية التجارب ، تمت زيادة KW و KW / BW لمجموعة CKD مقارنة بالمجموعة الصورية (جميع P <{0}}. 0="" 5).="" في="" نموذج="" ckd="" الناجم="" عن="" استئصال="" الكلية="" 5/6="" ،="" تسبب="" انخفاض="" أنشطة="" بروتينات="" الكلى="" في="" نمو="" كلوي="" تعويضي="" ،="" والشركات="" المصابة="" بتضخم="" كلوي="" (morton="" &="" griffiths="" ،="" 1985)="" ،="" وأكدنا="" هذا="" البيان.="" بعد="" علاج="" jp="" ،="" انخفض="" kw="" بشكل="" ملحوظ="" (p=""><0. 05)="" وأغلق="" لمجموعة="" الصور="" (p="" 0.05)="" ؛="" بينما="" انخفض="" kw="" bw="" بشكل="" طفيف="" (p="" 0.05).="" (الشكل="">

الشكل 2. يحمي JP وظيفة الكلى في الفئران CKD. مستوى Scr (A) و BUN (B) والبروتين البولي (C) في مجموعة مختلفة. (د) وزن الكلى (E) KW / BW. تم تقديم البيانات كوسيلة ± SD ، n=6 لكل مجموعة (** P <0. 0="" 1="" مقارنة="" بالمجموعة="" الصورية="" ؛="" #p=""><0. 05="" ،="" ##="" p=""><0.01 مقارنة="" بمجموعة="">

في مجموعة CKD ، أظهر الأنبوب الكلوي ضمورًا هائلاً مقارنةً بالمجموعة الصورية (P <{0}. 0="" 1)="" ،="" وكانت="" منطقة="" الكبيبة="" والتليف="" الخلالي="" الكلوي="" تقريبًا="" أكثر="" من="" ضعف="" أن="" المجموعة="" الزائفة="" في="" التحليل="" الكمي="" (p=""><0. 0="" 1).="" بعد="" علاج="" jp="" ،="" انخفضت="" درجة="" الضمور="" الأنبوبي="" بمقدار="" الضعف="" تقريبًا="" (p=""><0.01) ،="" وتم="" استعادة="" منطقة="" الكبيبة="" تقريبًا="" إلى="" مجموعة="" صورية="" (p=""><0.01) ،="" وانخفض="" التليف="" الخلالي="" الكلوي="" بمقدار="" الثلث="" (p=""><0.01). مقارنة="" بمجموعة="" ckd="" (الشكل="">

التين. 3. JP يحمي بنية الكلى في الفئران CKD. (أ) تلطيخ PAS. (ب) تلطيخ ماسون. (ج) درجة ضمور أنبوبي. (D) المنطقة الكبيبية (E) المنطقة الليفية. يتم عرض جميع الصور بتكبير مماثل ، 2 0 0 × ، شريط المقياس=100 ميكرومتر. تم تقديم البيانات كوسيلة ± SD ، n=6 لكل مجموعة (** P <0. 01="" مقارنة="" مع="" مجموعة="" الصور="" ؛="" #p=""><0.05 ،="" ##="" p=""><0.01 مقارنة="" بمجموعة="" ckd="">

3.3 قام JP بتعديل المعلمات الدموية في الفئران CKD

تم قياس التحليل الكيميائي الحيوي للمعلمات الدموية ، RBC ، Hb ، HCT ، و PLT. في الفئران CKD ، انخفض مستوى كرات الدم الحمراء من 9. 0 6 إلى 7.2 0 × 1012 / لتر ، الهيموغلوبين من 15.28 إلى 13.22 جم / ديسيلتر ، HCT من 47.1 إلى 40.4 بالمائة ، ورفع PLT من 1012 إلى 1526 × 109 / لتر مقارنة بالمجموعة الصورية (P <0.01) ،="" مما="" يشير="" إلى="" أن="" علامات="" فقر="" الدم="" قد="" لوحظت="" في="" الفئران="" ckd.="" تمت="" استعادة="" المستويات="" المنخفضة="" من="" rbc="" و="" hb="" و="" hct="" و="" plt="" في="" فئران="" ckd="" المعالجة="" بـ="" jps="" (p=""><0.01) (الشكل="">

الشكل 4. JP أعاد تأهيل المعلمات الدموية في الفئران CKD. مستوى PLT (A) ، RBC (B) ، Hb (C) ، HCT (D). تم تقديم البيانات كوسيلة ± SD ، n=6 لكل مجموعة (** P <0. 0="" 1="" مقارنة="" بالمجموعة="" الصورية="" ؛="" #p=""><0. 05="" ،="" ##="" p=""><0.01 مقارنة="" بمجموعة="">

3.4. JP تحفيز التعبير EPO

مقارنة بالمجموعة الصورية ، انخفض مستوى EPO في الدم وكمية EPO mRNA في الكلى بشكل ملحوظ في الفئران المصابة بفقر الدم CKD (P <0. 0="" 1).="" كشف="" تحليل="" النشاف="" الغربي="" أن="" مستوى="" بروتين="" epo="" قدم="" انخفاضًا="" طفيفًا="" في="" مجموعة="" ckd="" دون="" اختلاف="" كبير.="" بعد="" العلاج="" jp="" ،="" تمت="" ترقية="" مستوى="" epo="" في="" الدم="" ،="" epo="" في="" الكلى="" ،="" والبروتين="" بشكل="" ملحوظ="" مقارنة="" بمجموعة="" ckd="" (p=""><0. 01="" أو="" p=""><0.05) (الشكل="">

في قشرة الكلى ، تم إنتاج HIF -1 بشكل أساسي بواسطة الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية ، وتم التعبير عن HIF -2 بشكل أساسي في الخلايا البطانية والأرومات الليفية الخلالية الكلوية (Sch¨ odel & Ratcliffe ، 2019). أظهر تحليل الكيمياء المناعية أنه ، كما في HIF -1 ، في فئران CKD ، كانت الأنابيب الملطخة أقوى من المجموعة الصورية. بعد علاج JP ، كان للأنبوب الكلوي تلطيخ أقوى وأكبر في المنطقة مقارنة بمجموعة CKD كما هو موضح في السهم الأحمر في الشكل 5E. أظهر HIF -2 كيمياء مناعية ضعيفة نسبيًا إيجابية في الخلالي الكلوي في مجموعة الشام. في مجموعة CKD ، أظهر HIF -2 كيمياء مناعية إيجابية. بعد العلاج JP ، أظهر HIF -2 كيمياء مناعية أقوى مقارنة بمجموعة CKD (الشكل 5F).

الشكل 5. حفز JP التعبير EPO. (أ) محتوى مصل EPO. (ب)الكلىEPO النسبي مرنا. تم اعتبار GAPDH بمثابة جين التدبير المنزلي. (ج) صور لطخة غربية حسية ممثلة لتعبير بروتين EPO. (د) تحليل قياس كثافة المكتب الأوروبي للبراءات. (هـ) الكيمياء المناعية لـ HIF {0}. (F) الكيمياء المناعية لمحتوى HIF - 2 الذي تم تطبيعه مع محتوى -actin. يتم تقديم صور الكيمياء المناعية بتكبير مماثل ، 4 0 0 × ، شريط مقياس=20 ميكرومتر. كان النوى عبارة عن تلطيخ باللون الأزرق بواسطة الهيماتوكسيلين وكانت الإيجابية المناعية لـ DAB بنية اللون ، أما تلطيخ DAB الأعمق يعني أقوى كيمياء مناعية إيجابية. يشير السهم الأحمر إلى الكيمياء المناعية الإيجابية. تم تقديم البيانات كوسيلة ± SD ، n=6 لكل مجموعة (* P <0.05 مقارنة="" مع="" المجموعة="" الشام="" ؛="" #p=""><0.05 ،="" ##="" p=""><0.01 مقارنة="" بمجموعة="">

3.5 تسبب JP في إطلاق SCFAs

تم تطوير نهج الأيض المستهدف المستند إلى LC-MS لتحديد كمية إطلاق ثمانية SCFAs في عينات البراز. تم التحقق من صحة الطريقة المحددة من خلال تقييم الخطية والحساسية والدقة وتأثير المصفوفة والدقة والاستقرار. تم اختيار عينات مراقبة الجودة ذات التركيز المنخفض والمتوسط ​​والعالي (LQC و QMC و HQC) من أجل الحساسية والدقة والدقة والتحقق من الاستقرار وفقًا لنقاط التركيز الأدنى والمتوسطة والأعلى لمنحنى معيار المصفوفة والنتائج تم عرضها في الجداول من S4 إلى S6. تم تأكيد أن المواد التحليلية مستقرة عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة. تم عرض مخطط كروماتوجرافي LC-MS / MS لـ SCFAs في الشكل 6.

التين. 6. اللوني UHPLC-MS / MS من SCFAs. (أ) كان الجزء العلوي معادلة كيميائية اشتقاق SCFAs ؛ كان الجزء السفلي هو الصيغة الهيكلية لـ SCFAs بعد اشتقاق dansylhydrazine ؛ (ب) مخطط كروماتوجرافي UHPLC / MRM-MS لمعايير الخلط وعينة البراز ، استجابت القمم الكروماتوجرافية في (B) للعلامة الكيميائية الموضحة في (أ): 1. 12C- حمض الخليك. 2 - حامض الخليك 13 سي (ISTD1) ؛ 3. حمض 12C- بروبانويك. 4. حمض 13C- بروبانويك (ISTD2) ؛ 5. 12C-iso butyric acid؛ 6. حمض 12C- الزبد ؛ 7. حمض 13C-isobutyric (ISTD3) ؛ 8. حمض 13C- الزبد (ISTD4) ؛ 9. حمض 12C -2- methylbutyric؛ 10. حمض 12C-isovaleric ؛ 11. 12C حمض الفاليريك ؛ 12. حمض 13C -2- methylbutyric (ISTD5) ؛ 13. حامض 13C-isovaleric (ISTD6) ؛ 14- حمض 13C فاليريك (ISTD7) ؛ 15. حمض 12C- هيكسانويك ؛ 16. حمض 13C- هيكسانويك (ISTD8).

بالنسبة لعينة البراز ، في مجموعة CKD ، انخفضت مستويات AA و PA بشكل ملحوظ تقريبًا 4 مرات و 5 مرات مقارنة بالمجموعة الصورية (P <0. 0="" 1)="" ؛="" بينما="" بعد="" العلاج="" jp="" ،="" تمت="" استعادة="" كميات="" aa="" و="" pa="" مرة="" أخرى="" إلى="" 4/5="" من="" المجموعة="" الصورية="" (p=""><{{1 0}}.="" 0="" 1).="" وبالمثل="" ،="" انخفضت="" مستويات="" ba="" و="" va="" بشكل="" قوي="" تقريبًا="" 3="" 0="" مرات="" و="" 4="" مرات="" في="" مجموعة="" ckd="" مقارنة="" بمجموعة="" صورية="" (p=""><0. 01).="" أظهر="" علاج="" jp="" اتجاهًا="" متزايدًا="" ولكن="" ليس="" تحسنًا="" كبيرًا.="" لم="" يُظهر="" محتوى="" iba="" و="" iva="" و="" 2-="" ba="" تغييرًا="" ملحوظًا="" بين="" ckd="" والمجموعة="" الصورية.="" بعد="" علاج="" jp="" ،="" تمت="" زيادة="" مستوى="" baa="" و="" iva="" و="" 2-="" ba="" (p=""><0.01). ومع="" ذلك="" ،="" لم="" تظهر="" ha="" تغيير="" واضح="" بين="" المجموعات="" الثلاث="" (الشكل="" 7="" أ).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" بالنسبة="" لأنسجة="" الكلى="" ،="" في="" مجموعة="" ckd="" ،="" انخفضت="" كميات="" ثمانية="" scfa="" بشكل="" كبير="" (p=""><0.01) ،="" بينما="" بعد="" علاج="" jp="" ،="" زادت="" مستويات="" scfas="" باستثناء="" ba="" و="" ha="" (p=""><0.01 أو="" p="">< 0.5).="" تمت="" زيادة="" ba="" بشكل="" طفيف="" بدون="" زيادة="" ملحوظة="" ،="" ولم="" يظهر="" ha="" تغيرًا="" بعد="" علاج="" jp="" (الشكل="" 7="">

الشكل 7. محتوى SCFAs في مجموعة مختلفة. (أ) براز SCFAs. (ب) SCFAs الكلى. تم تقديم البيانات على أنها الوسيلة ± SD ، n=6 لكل مجموعة (** P <0. 0="" 1="" مقارنة="" بالمجموعة="" الوهمية="" ؛="" ##="" p=""><0. 01="" ،="" #="" p=""><0.05 مقارنة="" بمجموعة="">

4. مناقشة

في نموذج الفئران CKD لاستئصال الكلية 5/6 الحالي ، فإنالكلىوظيفةتم زيادة المؤشرات (Scr ، BUN ، وبروتين البول) بشكل ملحوظ ، وظهرت بقايا تضخم الكلى وظهرت الإصابة المرضية الكلوية ، مصحوبة بمعايير الدم. كانت هذه البيانات متوافقة مع الدراسات السابقة (Garrido et al. ، 2015 ، Morton & Griffiths ، 1985). أظهرت المؤشرات المذكورة أعلاه أن فئران CKD - ​​فقر الدم الناجم عن استئصال الكلية 5/6 قد تم تأسيسها بنجاح ويمكن التحقق من التأثير المفيد لـ JP في علاج فئران CKD- فقر الدم. مع الالكلىوظيفةبعد تدهور حالة فقر الدم ، تم التعرف على فقر الدم كمضاعفات انتهازية معروفة لمرض الكلى المزمن ، مما أثر سلبًا على جودة حياة المرضى (Locatelli، Fishbane، Block، Macdougall، 2017). سيساعد فهم عوامل الخطر المتعلقة بتقدم فقر الدم الكلوي في تطوير مناهج علاجية. في الوقت الحاضر ، جذبت الصلة بين المرض والتمثيل الغذائي لميكروبات الأمعاء اهتمامًا متزايدًا ، في حين أن العلاقة بين SCFAs وفقر الدم الكلوي لا تزال أقل شهرة. SCFAs ، التي يتم استقلابها بشكل أساسي بواسطة Clostridium و Coprococcus و Bacteroides (Koh et al. ، 2016) ، تستهدف مستقبلات محددة مرتبطة بالغشاء ، والتي تلعب دورًا مهمًا في الحفاظ على توازن بيئة الأمعاء وصحة الجسم بالكامل. أثبتت SCFAs بالفعل أن لها علاقة لا تنفصم مع CKD ، وتم تقليل مستويات حمض الأسيتيك وحمض البروبيونيك وحمض الزبد في CKD (Wang et al. ، 2019). في فئران CKD التي يسببها الأدينين ، تغيرت وفرة ميكروبيوتا الأمعاء وتنوعها بشكل كبير ، حيث خفضت الشركات مستوى حمض البروبانويك وحمض الزبد وحمض الفاليريك (لاكشمانان ، علي ، وتيرانجرا ، 2021). استنادًا إلى دراستنا السابقة ، أظهر تسلسل 16S rDNA أنه تم عرض دسباقتوزيس مجهريات البقعة المعوية في 5/6 فئران CKD المستحثة بالكلية مقارنة بمجموعة الشام. بعض SCFAs المنتجة للأجناس وخاصة حمض الزبد من Clostridium ، أظهرت Coprococcus اختلافات في الفئران CKD (Zheng et al. ، 2020). تماشياً مع هذا ، أظهرت نتائجنا أن كميات حمض الأسيتيك ، وحمض البروبيونيك ، وحمض الزبد ، وحمض الفاليريك قد انخفضت بنحو 60 في المائة ، و 80 في المائة ، و 85 في المائة ، و 60 في المائة في الفئران المصابة بداء الكلى المزمن ، مما يشير إلى أن انخفاض SCFA يتوافق مع عدم توازن بيئة القناة الهضمية. من الجدير بالذكر أن اضطراب بيئة الأمعاء الناجم عن مرض الكلى المزمن تسبب في استقلاب ميكروبيوتا الأمعاء غير الطبيعي (Feng et al. ، 2019). بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أنه في الفئران المصابة بفقر الدم CKD ، انخفضت ثمانية أنواع من مستويات SCFAs. على سبيل المثال ، قد ينتج خلل في المنتجات النهائية الأيضية ، مثل SCFAs عن تطور CKD.

تم العثور على السكريات ، وهو أحد المكونات النشطة في العديد من الأعشاب ، مثل Dioscoreae Rhizoma و Schisandra Chinensis و Astragali Radix و Jujubae Fructus. يمكن أن تتخمر السكريات وتتحلل عن طريق ميكروبيوتا الأمعاء. نتيجة لذلك ، يتم تقديم السكريات كركيزة لميكروبات الأمعاء لتتحول إلى SCFAs أو تعتبر تمتلك تأثيرًا يشبه البريبايوتيك لتحسين تكوين ميكروبيوتا الأمعاء لتسهيل إنتاج SCFAs (Cai et al. ، 2019). في هذه الدراسة ، كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن عديد السكاريد من العناب حفز إطلاق ميكروبيوتا الأمعاء من SCFAs ، مثل حمض الأسيتيك ، وحمض البروبانويك ، وحمض الأيزوبوتريك ، 2- حمض ميثيل الزبد في فئران CKD. علاوة على ذلك ، بعد علاج JP ، تم تحسين مستوى SCFAs في كلوي الفئران CKD وفقر الدم ، وكان اتجاه التغيير متسقًا مع عينة البراز. بناءً على الأبحاث الحالية ، أصبحت العلاقة بين SCFAs و CKD واضحة تدريجياً. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن حمض الأسيتيك لتعديل جهاز المناعة وتحسين الحالة الحادةالكلىإصابةعن طريق تثبيط إشارات NADPH أوكسيديز في الخلايا التائية (الحربي وآخرون ، 2018). ثبت أن حمض البروبانويك يمنع تطور CKD الناجم عن الأدينين عبر مستقبلات الأحماض الدهنية الحرة 2 (FFA2) و FFA3 (Mikami et al. ، 2020). لذلك ، استنتجنا أن استعادة مستوى SCFA في الكلى كان مفيدًا للكلية المريضة. تم الإبلاغ عن أن JP زاد تنوع الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء ويزيد من الجراثيم النشطة لـ SCFA (Bacteroides) الوفرة النسبية في فئران سرطان القولون والمستقيم (Ji et al. ، 2020). إلى جانب ذلك ، زاد JP من تركيز إجمالي SCFAs في عينات البراز (Ji et al. ، 2019). لذلك ، استنتجنا أن JP يمكن أن يحفز إنتاج SCFAs لتحقيق الغرض من تأخير تقدم CKD. قد يكون JP أيضًا ركيزة استقلابية للميكروبات المهيمنة SCFAs لتحفيز إنتاج SCFAs في CKD ، أو مكونًا يشبه البريبايوتيك لاستعادة بيئة الأمعاء ، وخاصة تنوع الكائنات الحية الدقيقة المهيمنة SCFAs ، وزيادة تعزيز إطلاق SCFAs ، وذلك منع تطور مرض الكلى المزمن.

بشكل عام ، يصعب تحليل SCFAs (الخالية من الكربون من 6) ذات الوزن الجزيئي الصغير والقطبية الكيميائية العالية مباشرة من خلال مناهج الكروماتوغرافيا. يمكن أن يؤدي الاشتقاق الكيميائي المسمى بالنظائر لإستراتيجية SCFAs إلى تحسين حساسية الأداة وتقليل أخطاء التحليل ، مما يوفر استراتيجية مفيدة لتحديد SCFAs في تحليل LC-MS / MS (Higashi & Ogawa ، 2016). في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق dansyl hydrazine المسمى بشكل مرض في الكشف عن مستقلبات البلازما البشرية المستهدفة التي تحتوي على حمض الكربوكسيل (Chen & Zhang ، 2020). دعماً لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير الاشتقاق الكيميائي بناءً على نهج LC-MS / MS لتحديد 8 SCFAs في براز الفئران. يتم إنتاج SCFAs عن طريق ميكروبيوتا الأمعاء ، ويتم إخراج ما يقرب من 10 في المائة من SCFAs من خلال البراز (Boets et al. ، 2015). لذلك ، يمكن لتحليل العينة البرازية لـ SCFAs أن يعكس التغييرات في بيئة الأمعاء بشكل مباشر وله مرجعية أكثر في التحليل المشترك متعدد omics بين SCFAs وميكروبات الأمعاء. بشكل ملحوظ ، التحقق من عدم الاستقرار ، وجدنا أن SCFA المسمى dansyl hydrazine كان غير مستقر في درجة حرارة الغرفة ، وأظهرت شدتها على الطيف الكتلي ميلًا هبوطيًا مع مرور الوقت ، لكنها يمكن أن تظل مستقرة لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. وبالتالي ، بعد اشتقاق SCFAs ، يجب أن تبقى التحليلات عند 4 درجات مئوية قبل التحليل.

في مراحل CKD المتقدمة 4-5 ، يؤدي نقص إنتاج EPO إلى تقييد تكون الكريات الحمر ، مما يساهم في العامل الأكثر أهمية في تطور فقر الدم الكلوي (Sakashita ، Tanaka ، Nangaku ، 2019). اقترحت إرشادات الممارسة السريرية العلاج الروتيني بعوامل تحفيز تكون الكريات الحمر (ESAs) لفقر الدم. ومع ذلك ، يجب أن تكون سلامة ESAs المرتبطة بزيادة خطر الوفاة وأحداث القلب والأوعية الدموية معنية (Thavarajah & Choi ، 2019). في مرضى فقر الدم الكلوي ، يجب أن يكون تعبير EPO متسقًا أو مرتفعًا بصريًا مقارنة بالأجسام السليمة (بابيت ولين ، 2012). في مرحلة مبكرة ، قدم مستوى المكتب الأوروبي للبراءات اتجاه الترقية ، بينما في المرحلة المتأخرة ، أظهر مستوى المكتب الأوروبي للبراءات اتجاهًا هبوطيًا مقارنة بالمرحلة المبكرة ، حتى أقل من المعتاد (Panjeta ، Tahirovic ، Sofi's ، ´ Cori's ، Derviˇsevi ´c ، 2017). بالتوافق مع التجارب السابقة (Chen et al. ، 2019 ؛ Wang et al. ، 2020) ، أشارت نتائجنا إلى أن مستوى EPO في المصل قد انخفض في فئران CKD-anemia. اكتشفنا على التوالي EPO mRNA في الكلى ومستوى البروتين في فئران CKD ، وانخفض مستوى بروتين EPO في الكلى بشكل طفيف مقارنة بالمجموعة الصورية بينما تدهورت كمية EPO mRNA في الكلى وكانت درجتها أكبر من مستوى EPO في الدم. الكلى هي المصدر الرئيسي لتخليق EPO عند البالغين ومرضى ERSDالكلىلا يزال يحتفظ بالقدرة على إنتاج إرثروبويتين (برنهاردت وآخرون ، 2010). لتصحيح مستويات EPO في المصل الداخلي والتكيف مع فقر الدم الكلوي ، تم تنشيط إنتاج EPO في الكلى ، على الرغم من ذلكالكلىإصابةتقليل تعبير EPO mRNA (Sch¨ odel & Ratcliffe ، 2019). بعد علاج JP ، تم زيادة مستوى EPO في المصل ، وكذلك تم ترقية مستويات البروتين EPO mRNA في الكلى. في دراستنا السابقة ، يمكن لـ JP تحفيز نشاط نسخ التربية على حقوق الإنسان وتعزيز جين EPO (Chen et al. ، 2014). ومن ثم ، فقد توقعنا أن JP يمكن أن يستعيد مستوى EPO في مصل الفئران CKD لفقر الدم الكلوي المنظم ، والذي قد يساهم في التعبير الجيني المحفز EPO للكلية على مستوى mRNA.

في القشرة ، تم العثور على HIF -1 بشكل رئيسي في الأنبوب ، و HIF -2 في النسيج الخلالي الكلوي. نظرًا لأن EPO يتم إنتاجه بشكل أساسي بواسطة الخلايا الليفية التي يوجد فيها HIF -2 في نفس المكان ، فإن هذا يدعم أن HIF -2 قد يكون مسؤولاً عن تنظيم إنتاج EPO (Maxwell ، 2003). وجدنا في دراستنا أنه يمكن تنشيط HIF -1 و HIF -2 بواسطة CKD ، ويمكن أن يحفز علاج JP نشاط HIF -1 و HIF -2 مقارنةً بفئران CKD . لقد ثبت أن HIF -2 يلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم إنتاج EPO (Kapitsinou et al. ، 2010) ، بينما قد يلعب تنظيم HIF -1 تأثير حماية الكلى في الكلى (Jiang et ، 2020) ، مما يحسن بشكل غير مباشر إنتاج المكتب الأوروبي للبراءات. تم تنظيم إنتاج EPO في الكلى أولاً على مستوى mRNA ، تحت فقر الدم أو نقص الأكسجة ، يمكن زيادة تعبير EPO mRNA عن طريق تحفيز بروتين HIF. في السابق ، أظهرت الأبحاث الدوائية أن العناب حفز تعبير EPO عن طريق تنظيم مستوى بروتين HIF في النموذج الخلوي (Chen et al. ، 2014 ، Lam et al. ، 2016). لذلك ، استنتجنا أن JP قد ينظم تعبير EPO mRNA عبر بروتين HIF لتحقيق الغرض من تخفيف فقر الدم الكلوي.

علاوة على ذلك ، استنادًا إلى النتائج الحالية ، نتوقع أن يكون للحد من SCFAs أدوارًا حاسمة في تعبير EPO بوساطة HIF ، مما يساهم في فقر الدم CKD. بما يتعارض مع هذا ، فقد تم توضيح أن زيادة مستوى حمض الأسيتيك كان مفيدًا لتوليد مركب HIF -2 الأسيتيل والبروتين المرتبط بـ CREB-HIF 2 ، والتعبير المستحث عن EPO (Xu et al. ، 2014). حمض البروبيونيك الموهن اضطراب الميتوكوندريا ، وموت الخلايا المبرمج في الحصين ، والعجز العصبي عبر مسار HIF -1 / ERK (Cheng et al. ، 2019). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على حمض الزبد لتثبيت HIF -1 ، والجينات النشطة المستهدفة لـ HIF على خلايا القولون ، وتخفيف الاستجابة الالتهابية للقولون (Kelly et al. ، 2015). في دراستنا ، وجدنا أن مستويات حمض الأسيتيك ، وحمض البروبانويك ، وحمض الزبد قد انخفضت بشكل كبير مصحوبة بفئران HIF- التعبير غير الطبيعي لفئران CKD ، مما يشير إلى أن استقرار HIF- قد يكون مرتبطًا بانخفاض SCFA ، وقد يكون لـ SCFAs تأثير تثبيت HIF لتنظيم تعبير EPO.

5. الاستنتاجات

في الختام ، أثبتنا أن JP يحسن CKD وفقر الدم المرتبط به ، والذي شاركت آليته في تنظيم إطلاق SCFAs وإنتاج EPO. و JP قد يكون العنصر النشط بيولوجيا من العناب لعلاج فقر الدم. قد تقدم هذه النتائج دليلاً على مزيد من تطوير JP كمكملات غذائية لعلاج فقر الدم المرتبط بمرض الكلى المزمن.

بيان أخلاقي

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات في بحثنا وفقًا لبروتوكولات معتمدة من لجنة الأخلاقيات بجامعة قوانغتشو للطب الصيني ووفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 80-23 ، المنقحة 1996). لا يوجد انتهاك للإرشادات المذكورة أعلاه في بحثنا.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة قوانغدونغ (2018A030313305) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (81804052 ، و 81973577 ، و 82004248) ، ومشروع خطة العلوم والتكنولوجيا في Shenzhen (JSGG20191129102216637 و ZDSYS201606081515458) ، ومكتب الطب الصيني التقليدي لمقاطعة قوانغدونغ ( 20201320).

مراجع

الحربي ، لا ، نديم ، أ ، أحمد ، سادس ، العتيبي ، م. حمض دهني قصير السلسلة ، أسيتات يخفف من حدة الإصابة بالإنتانالكلىإصابةعن طريق تثبيط إشارات NADPH أوكسيديز في الخلايا التائية. علم الأدوية المناعي الدولي ، 58 ، 24-31.
بابيت ، جيه إل ، ولين ، هاي (2012). آليات فقر الدم في كد. مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، 23 (10) ، 1631-1634.
Bernhardt، WM، Wiesener، MS، Scigalla، P.، Chou، J.، Schmieder، RE، Günzler، V.،… Eckardt، KU (2010). تثبيط هيدروكسيلاز البرولايل يزيد من إنتاج إرثروبويتين في الداء الكلوي بمراحله الأخيرة. مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، 21 (12) ،
2151–2156.
Boets، E.، Deroover، L.، Houben، E.، Vermeulen، K.، Gomand، SV، Delcour، JA،… Verbeke، K. (2015). القياس الكمي لإنتاج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة في القولون في الجسم الحي من الأنسولين. العناصر الغذائية، 7 (11) ، 8916-8929.

كاي ، واي. ، ليو ، دبليو ، لين ، واي. ، تشانغ ، س. ، زو ، ب ، شياو ، دي ، ... شي ، زي (2019). تعمل السكريات المركبة على تحسين التهاب القولون التجريبي عن طريق تعديل تكوين ووظيفة ميكروبيوتا الأمعاء. مجلة أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، 34 (9) ،1554–1562.

Chen، G.، & Zhang، Q. (2020). القياس الكمي المتزامن للأحماض الدهنية الحرة والأسيل كارنيتيني في عينات البلازما باستخدام وضع العلامات dansylhydrazine والكروماتوجرافيا السائلة - مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي. تحليلي وتحليلي بيولوجيكيمياء ، 412 (12) ، 2841-2849.

Chen، J.، Lam، CT، Kong، AY، Zhang، WL، Zhan، JY، Bi، CW،… Tsim، KW (2014). يستحث مستخلص فاكهة العناب Ziziphus التعبير عن إرثروبويتين عن طريق العامل المحرض بنقص التأكسج -1 في خلايا Hep3B المزروعة. بلانتاميديكا ، 80 (17) ، 1622-1627.

Chen، J.، Wang، F.، Huang، S.، Liu، X.، Li، Z.، Qi، A.،… Li، S. (2019). يخفف مغلي Jian-Pi-Yi-Shen فقر الدم الكلوي في 5/6 فئران nephrectomized: إنتاج إرثروبويتين عبر إشارات عامل نقص الأكسجة. الطب البديل والمبني على البراهين ، 2019 ، 1-8.
تشنغ ، واي. ، ماي ، كيو ، تسينج ، إكس ، وانغ ، إتش ، شياو ، واي ، تانغ ، إل ، ... دينغ ، إتش (2019). يخفف البروبيونات من النوبات التي يسببها البنتيلينتيترازول ، وما يترتب على ذلك من اضطراب الميتوكوندريا ، ونخر الخلايا العصبية والعجز العصبي في الفئران. علم العقاقير البيوكيميائية ، 169 ، المادة 113607.
Feng، YL، Cao، G.، Chen، DQ، Vaziri، ND، Chen، L.، Zhang، J.،… Zhao، YY (2019). تكشف عملية التمثيل الغذائي للميكروبيوم عن مجهريات البقعة المعوية المرتبطة بالمستقلبات المقترنة بالجليسين وأيض البوليامين في أمراض الكلى المزمنة. علوم الحياة الخلوية والجزيئية، 76 (24) ، 4961-4978.
Garrido، P.، Ribeiro، S.، Fernandes، J.، Vala، H.، Bronze-da-Rocha، E.، Rocha-Pereira، P.،… Reis، F. (2015). عسر التمثيل الغذائي بالحديد الهبسيدين ، فقر الدم ونقص الأكسجة الكلوي ، الالتهاب والتليف في نموذج الفئران الكلوي المتبقي. بلوس ون ، 10 (4) ، المادة e124048.
هيغاشي ، ت. ، وأوجاوا ، س. (2016). كواشف اشتقاق ESI المعززة بالنظائر للتحليل التفاضلي ، والقياس الكمي ، وتحديد ملامح المستقلبات في العينات البيولوجية بواسطة LC / MS: مراجعة. مجلة التحليل الصيدلاني والطب الحيوي ، 130 ، 181-193.
Ji، X.، Hou، C.، Gao، Y.، Xue، Y.، Yan، Y.، & Guo، X. (2020). التحليل الميتاجينومي للتأثيرات المعدلة للجراثيم المعوية لعديد السكاريد (Ziziphus jujuba Mill.) في نموذج فأر لسرطان القولون والمستقيم. الغذاء والوظيفة ، 11 (1) ، 163-173.
جي ، إكس ، هو ، سي ، يان ، واي ، شي ، إم ، وليو ، واي (2020). مقارنة التوصيف الهيكلي والنشاط المضاد للأكسدة للسكريات من فاكهة العناب (Ziziphus jujuba Mill.). المجلة الدولية للجزيئات البيولوجية الكبيرة ، 149 ، 1008-1018.

Ji ، X. ، Hou ، C. ، Zhang ، X. ، Han ، L. ، Yin ، S. ، Peng ، Q. ، ... Wang ، M. (2019). تحليل Microbiomemetabolomic لتأثير Zizyphus jujuba cv. استهلاك موزاو عديد السكاريد على فئران سرطان القولون والمستقيم الميكروبات والأيضات البرازية.المجلة الدولية للجزيئات البيولوجية ، 131 ، 1067-1076.

جي ، إكس ، بينغ ، كيو ، يوان ، واي. ، شين ، جي ، شي ، إكس ، آند وانج ، إم. (2017). العزلة والتركيبات والنشاط الحيوي لعديد السكاريد من فاكهة العناب (Ziziphus jujuba Mill.): مراجعة. كيمياء الغذاء ، 227 ، 349-357.
جيانغ ، إن ، تشاو ، هـ ، هان ، واي ، لي ، إل ، شيونغ ، إس ، تسينج ، إل ، ... صن ، إل (2020). يخفف HIF -1 الإصابة الأنبوبية في اعتلال الكلية السكري عبر HO -1- التحكم بوساطة ديناميكيات الميتوكوندريا. تكاثر الخلايا ، 53 (11) ، المادة e12909.
Kapitsinou، PP، Liu، Q.، Unger، TL، Rha، J.، Davidoff، O.، Keith، B.،… Haase، VH (2010). Hepatic HIF -2 ينظم استجابات الكريات الحمر لنقص الأكسجة في فقر الدم الكلوي. الدم ، 116 (16) ، 3039-3048.
Kelly، CJ، Zheng، L.، Campbell، EL، Saeedi، B.، Scholz، CC، Bayless، AJ،… Colgan، SP (2015). يعزز الحديث المتبادل بين الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة المشتقة من الميكروبات و HIF الظهارية المعوية وظيفة حاجز الأنسجة. مضيف الخلية والميكروب ، 17 (5) ، 662-671.
كوه ، أ ، دي فادر ، ف. ، كوفاتشيفا-داتشاري ، ب. ، وبو أكهيد ، ف. (2016). من الألياف الغذائية إلى فسيولوجيا المضيف: الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة كمستقلبات بكتيرية رئيسية. الخلية ، 165 (6) ، 1332-1345.
لاكشمانان ، AP ، Al ، ZM ، Ali ، BH ، & Terranegra ، A. (2021). تأثير أكاسيا صمغ البريبايوتك على تكوين ميكروبيوم الأمعاء في الفئران المصابة بمرض الكلى المزمن التجريبي. الطب الحيوي والعلاج الدوائي ، 133 ، مقال
110992.
لام ، سي ، تشان ، بي إتش ، لي ، بي ، لاو ، كيه إم ، كونغ ، إيه ، جونج ، إيه ، ... تسيم ، ك. (2016). التقييم الكيميائي والبيولوجي للعناب (Ziziphus jujuba) - يحتوي على مغلي الأعشاب: تحريض تعبير إرثروبويتين في الثقافات. مجلة الكروماتوغرافيا BAnalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences، 1026، 254–262.
Lappin ، TR ، & Lee ، FS (2019). تحديث عن الطفرات في HIF: مسار EPO ودورها في كثرة الكريات الحمر. مراجعات الدم ، 37 ، المادة 100590.
LeBlanc، JG، Chain، F.، Martín، R.، Bermúdez-Humaran، ´ LG، Courau، S.، & Langella، P. (2017). آثار مفيدة على استقلاب طاقة المضيف للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة والفيتامينات التي تنتجها البكتيريا المتعايشة والبروبيوتيك. مصانع الخلايا الميكروبية ، 16 (1) ، 79.
Li، L.، Ma، L.، & Fu، P. (2017). الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة المشتقة من الميكروبات المعوية وأمراض الكلى. تطوير تصميم الأدوية والعلاج ، 11 ، 3531–3542.
لي ، إل ، وشي ، جي واي (2013). تحليل مكونات السكاريد والدهون لقشرة سينامومي بواسطة GC-MS. Zhong Yao Cai ، 36 (4) ، 578-580.
Liu، G.، Liu، X.، Zhang، Y.، Zhang، F.، Wei، T.، Yang، M.،… Zhao، Z. (2015). التأثيرات الواقية للكبد للسكريات المستخرجة من Zizyphus Jujube cv. Huanghetanzao. المجلة الدولية للجزيئات البيولوجية الكبيرة ، 76 ، 169-175.

Locatelli، F.، Fishbane، S.، Block، GA، & Macdougall، IC (2017). استهداف نقص الأكسجة: العوامل المحفزة لعلاج فقر الدم لدى مرضى الكلى المزمنة. المجلة الأمريكية لأمراض الكلى ، 45 (3) ، 187-199.

Locatelli، F.، Hannedouche، T.، Fishbane، S.، Morgan، Z.، Oguey، D.، & White، WB (2019). سلامة القلب والأوعية الدموية وجميع أسباب الوفيات من ميثوكسي بولي إيثيلين

Glycol-Epoetin beta وعوامل تحفيز تكوين الكريات الحمر الأخرى في فقر الدم من CKD: تجربة عشوائية غير متدنية. المجلة السريرية للجمعية الأمريكية لأمراض الكلى: CJASN، 14 (12)، 1701-1710.
ماكسويل ، ب. (2003). HIF -1: نظام استجابة للأكسجين له صلة خاصة بالكلى. مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، 14 (11) ، 2712-2722.
Meijers، BK، & Evenepoel، P. (2011). محور الأمعاء والكلى: كبريتات الإندوكسيل ، كبريتات p-cresyl وتطور CKD. زرع الكلى لغسيل الكلى ، 26 (3) ، 759-761.
Mikami، D.، Kobayashi، M.، Uwada، J.، Yazawa، T.، Kamiyama، K.، Nishimori، K.،… Iwano، M. (2020). تخفف الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من مرض الكلى المزمن الناجم عن الأدينين عبر مسارات FFA2 و FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids ، 1865 (6) ، المادة 158666.
مورتون ، دي بي ، وجريفثس ، بي إتش (1985). مبادئ توجيهية للتعرف على الألم والضيق وعدم الراحة في حيوانات التجارب وفرضية للتقييم. السجل البيطري ، 116 (16) ، 431-436.
Panjeta، M.، Tahirovi´c، I.، Sofi´c، E.، Cori ´ ´c، J.، & Derviˇsevi´c، A. (2017). تفسير مستويات الإريثروبويتين والهيموجلوبين في المرضى الذين يعانون من مراحل مختلفة من أمراض الكلى المزمنة. مجلة الكيمياء الحيوية الطبية ، 36 (2) ، 145-152.
Pappa، M.، Dounousi، E.، Duni، A.، & Katopodis، K. (2015). الآليات الفيزيولوجية المرضية الأقل شهرة لفقر الدم لدى مرضى اعتلال الكلية السكري. طب المسالك البولية وأمراض الكلى الدولية ، 47 (8) ، 1365-1372.
ساكاشيتا ، إم ، تاناكا ، ت. ، ونانجاكو ، إم. (2019). مثبطات مجال Hypoxia-Inducible-Prolyl hydroxylase لعلاج فقر الدم في أمراض الكلى المزمنة. مساهمات في طب الكلى ، 198 ، 112-123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel، ¨ J.، & Ratcliffe، PJ (2019). آليات تأشير نقص الأكسجة: آثار جديدة لأمراض الكلى. مراجعات الطبيعة لأمراض الكلى ، 15 (10) ، 641-659.
تاكو ، إي ، جلان ، آر بي ، كنز ، إم ، وستانغوليس ، جي سي (2014). تأثير البريبايوتكس في القمح على عدد البكتيريا المعوية وحالة الحديد في الدجاج اللاحم الذي يعاني من نقص الحديد. مجلة التغذية ، 13 ، 58.
Tang ، WH ، Wang ، Z. ، Kennedy ، DJ ، Wu ، Y. ، Buffa ، JA ، Agatisa-Boyle ، B. ،… Hazen ، SL (2015). يساهم مسار ثلاثي ميثيل أمين N-oxide المعتمد على الميكروبات المعوية (TMAO) في تطوير القصور الكلوي ومخاطر الوفاة في أمراض الكلى المزمنة. بحوث الدورة الدموية، 116 (3) ، 448-455.
Thavarajah، S.، & Choi، MJ (2019). استخدام عوامل تحفيز تكوين الكريات الحمر في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن والسرطان: نهج سريري. المجلة الأمريكية لأمراض الكلى ، 74 (5) ، 667-674.
Wang، F.، Yu، H.، Huang، S.، Zheng، L.، Zheng، P.، Zhang، S.،… Chen، J. (2020). يقوم Jian-PiYi-Shen بتنظيم EPO وتعبيرات بروتين إعادة تدوير الحديد في الفئران المصابة بفقر الدم المصابة بأمراض الكلى المزمنة: تراكم العامل المحرض لنقص الأكسجة -2 عبر إشارات ERK. الطب البديل والمبني على البراهين ، 2020 ، 8894257.
Wang، S.، Lv، D.، Jiang، S.، Jiang، J.، Liang، M.، Hou، F.،… Chen، Y. (2019). يساهم التخفيض الكمي في الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة ، وخاصة الزبدات ، في تطور مرض الكلى المزمن. العلوم السريرية ، 133 (17) ، 1857-1870.
Webster، AC، Nagler، EV، Morton، RL، & Masson، P. (2017). فشل كلوي مزمن. لانسيت (لندن ، إنجلترا) ، 389 (10075) ، 1238-1252.
Xie، X.، Yang، X.، Wu، J.، Ma، J.، Wei، W.، Fei، X.،… Wang، M. (2020). يساهم Trib1 في الشفاء من إصابة الكلى الحادة الناجمة عن نقص التروية / ضخه عن طريق تنظيم استقطاب البلاعم الكلوية. الحدود في علم المناعة ، 11 ، 473.
Xu، M.، Nagati، JS، Xie، J.، Li، J.، Walters، H.، Moon، YA،… Garcia، JA (2014). ينظم مفتاح الأسيتات تكون الكريات الحمر في الإجهاد. طب الطبيعة ، 20 (9) ، 1018-1026.
Yue، Y.، Wu، S.، Li، Z.، Li، J.، Li، X.، Xiang، J.،… Ding، H. (2015). تحمي عديدات السكاريد عناب البري من مرض الأمعاء الالتهابي التجريبي من خلال تمكين وظيفة الحاجز المعوي المعزز. الغذاء والوظيفة ، 6 (8) ، 2568-2577.

تشاو ، س ، ولي ، إل (2018). وضع العلامات على نظير Dansylhydrazine LC-MS من أجل التنميط الشامل للحمض الكربوكسيلي. الكيمياء التحليلية ، 90 (22) ، 13514-13522.

Zheng، L.، Chen، S.، Wang، F.، Huang، S.، Liu، X.، Yang، X.،… Chen، J. (2020). ترتبط الاستجابات المميزة لميكروبات الأمعاء إلى ديكوتيون Jian-Pi-Yi-Shen بتحسين النتائج السريرية في 5/6 الفئران التي تم تفتيتها. الحدود في علم الأدوية ، 11 ، 604.