أظهرت الدراسات أن الالتهام الذاتي يلعب دورًا مهمًا في تنظيم ترسب LD الخلوي الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.14. مقايسة نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH)

وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، تم طلاء الخلايا 96- في لوحة بئر عند 5000 خلية / بئر ، وتم جمع وسط استزراع لقياس مستويات LDH باستخدام مجموعة الفحص (معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). ثم تم اكتشاف امتصاص العينات بواسطة Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) عند 450 نانومتر.

2.15. BODIPY493 / 503 و BODIPY 581/591 C11 و MitoTracker تلطيخ أحمر عميق

تم غسل الخلايا الحية باستخدام PBS واحتضانها بـ 2 ميكروغرام / مل BOD-IPY 493/5 0 3 (InvitrogenTM ، Cat D3922) أو BODIPY 581/591 C11 (BD-C11） （2. 0 ميكرومتر ، Invitrogen TM ، Cat D3861 في PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة. بالنسبة لتلطيخ MitoTracker Deep Red ، تم تحضين الخلايا الحية باستخدام 0.5 ميكروغرام / مل من MitoTracker Deep Red (Invitrogen TM ، Cat M22426) في PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. ثم الخلايا تم غسلها مرتين في برنامج تلفزيوني وتثبيتها في 3.5 في المائة من PFA لمدة 10 دقائق متبوعة بالغسيل والتلوين المضاد باستخدام Hoechst 3342 (Sigma ، Cat B2261) لمدة 10 دقائق قبل تغطيتها على شرائح زجاجية للتصوير.كم cistanche لاتخاذلوحظت الصور والتقطت الصور بالمجهر الفلوري (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

2.16.Hoechst و PI تلطيخ

كانت الخلايا ملطخة بـ Hoechst 33342 （1 ul مخففة في 5 0 0ul PBS و Sigma و Cat B2261） و （أو PI （0.1 ماي المخففة في 500ul PBS ، Solarbio ، (النوم المستمر) CA1020) لمدة 10 دقائق و ثم تم إصلاحه ومراقبته بالمجهر الفلوري (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).

2.17.قياس التدفق الخلوي

تم هضم الخلايا وشطفها باستخدام D-hank ثم ملطخة بـ Annexin V-FITC （5 ul المخفف في 5 0 0ul PBS） / PI （0.1 ul مخفف في 500ul PBS) مجموعة موت الخلايا المبرمج (CA1020 ، Solarbio ، بكين ، Chian ) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك ، تم تحليل الخلايا المبرمجة باستخدام قياس التدفق الخلوي (جوافة easyCyterM 8 ، ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء قياسات ROS للميتوكوندريا وقياسات غشاء الميتوكوندريا كما تم نشرها 【12】. كانت خلايا SH-SY5Y ملطخة بـ MitoSOX （2.5 ميكرومتر ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية） أو بـ JC1 （10 ميكروغرام / مل ، T -3168 ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية） عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين ، تم بعد ذلك تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني بارد يحتوي على 1 في المائة من FBS لتحليل التدفق الخلوي. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FCS Express (Guava Easy CyterM8، Millipore، Hayward، CA، USA).

2.18 فحوصات تنفس فرس البحر

تم قياس وظيفة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في خلايا SH-SY5Y الحية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse (XFe96) (Agi-lent ، سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكية) عبر التغييرات في معدل استهلاك الأكسجين （OCR）. تم السماح لخلايا SH-SY5Y المصنفة عند 3 × 10 خلايا / بئر بالالتصاق بألواح زراعة خلايا فرس البحر والوصول إلى ما يقرب من 80 في المائة في وقت التجربة. (شاي cistanche) في اليوم التالي ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا باستخدام Ka ثم تتعرض لـ MPP * لمدة 24 ساعة أخرى. تم اكتشاف التعرف الضوئي على الحروف في ظل الظروف القاعدية تليها إضافة متسلسلة من 1 ميكرومتر أوليغوميسين ، 1 ميكرومتر FCCP ، وكذلك 1 ميكرومتر روتينون ومضاد الميسين أ.

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

2.19 تحليل احصائي

تم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. تم تحديد أهمية الاختلاف من خلال اختبار الطالب ، أو تحليل التباين ثنائي الاتجاه ، أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey اللاحق. اعتبر الفرق كبيرا في P.<>

3. النتائج

النتيجة 1. كا يعيد الخلل الوظيفي الحركي ويزيد من مستويات الدوبامين في المخطط لفئران نموذج MPTP / p PD

لاستقصاء تأثير الحماية العصبية للتسبب في مرض كاون PD ، تم حقن {{0} فئران C57BL / 6 من الذكور البالغ من العمر شهرًا بالسم العصبي MPTP لتأسيس نموذج MPTP / p PD وتم علاجها باستخدام Ka (الشكل لا). بعد تحريض النموذج ، تم استخدام اختبار Rotarod واختبار القطب لتقييم الأداء الحركي والسلوكي للفئران في المجموعات المختلفة. كما هو موضح ، تم تقليل وقت أداء rotarod بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة بـ MPTP ، وتم منع هذا التأثير بواسطة Ka (الشكل 1 ب). (فوائد cistanche tubulosa) استعاد Ka أيضًا العجز السلوكي الناجم عن MPTP ، كما يتضح من التخفيضات في وقت الدوران والوقت الإجمالي في اختبار القطب (الشكل 1 ج و د) ، دون التأثير على أوزان جسم الفئران (الشكل 1 ج). لو). علاوة على ذلك ، أظهر تحليل HPLC أن مستوى الدوبامين في المخطط قد انخفض بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من MPTP / p ، وتم استعادة هذا المستوى بواسطة علاج Ka (الشكل 1f). التخفيض الناجم عن p في مستويات حمض الأسيتيك ثنائي هيدروكسي فينيل (DOPAC ، مستقلب الدوبامين) في المخطط (الشكل 1 جم).أعشاب سوبرمانتشير هذه النتائج إلى أن كا يعيد الخلل الوظيفي الحركي ويزيد من مستويات الدوبامين في المخطط في الفئران PD التي يسببها MPTP.

النتيجة 2. يخفف Ka من فقدان الخلايا العصبية DA في SNPC لفئران نموذج MPTP / p PD

بعد ذلك ، لإجراء مزيد من التقييم للتأثير الوقائي العصبي لضعف الخلايا العصبية DA الناجم عن Kaon MPTP / p ، قمنا بفحص الخلايا العصبية التيروزين هيدروكسيلاز (TH) في SNPC الفئران عن طريق التلوين المناعي. كما هو مبين في الشكل 2 أ و ب ، تسبب MPTP / p في حدوث انخفاض كبير في عدد الخلايا العصبية TH ، والتي تم تخفيفها بواسطة علاج Ka. علاوة على ذلك ، التهم المجسمة للخلايا العصبية الكلية في SNPC ، كما حددها Nissl

رسم بياني 1. يخفف علاج كا من الخلل الوظيفي الحركي ويزيد من مستويات الدوبامين في المخطط لفئران نموذج MPTP / p PD.

(أ) رسم تخطيطي للتصميم التجريبي. (cistanche tubulosa reddit) (ب) تم قياس الوقت على القضيب لاختبار rotarod على مدار ثلاثة أيام متتالية. (cd) تم تسجيل الوقت المستغرق للالتفاف (وقت الدوران) والنزول من القطب (وقت التسلق) لاختبار القطب. (هـ) تم قياس أوزان جسم الفأر في نهاية الدراسة. (fg) تم تحليل الدوبامين (DA) وحمض الخليك ثنائي هيدروكسي فينيل (DOPAC) في المخطط بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء. يتم التعبير عن البيانات بالمتوسط ​​± SEM.n =9-10 لكل مجموعة في (ب ، ج ، د) ؛ ن =6-8 لكل مجموعة في (و ، ز) .ns ، ليست كبيرة ، * ص<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">فوائد بيوفلافونويدسحسنت Ka بشكل كبير من التخفيض الناجم عن MPTP في تعبير بروتين TH و DAT ، كما تم قياسه بواسطة النشاف الغربي (الشكل 2e-g). يؤكد هذا الدليل التأثير الوقائي للأعصاب لـ Kaon في نموذج الماوس PD.

النتيجة 3. يقلل كا من تراكم فجوات LD والإجهاد التأكسدي في SNPC للفئران المعالجة بـ MPTP / p

أظهرت الأدلة المتزايدة مشاركة LDs في NDDs [10] ، بشكل ثابت ، حدد عملنا السابق زيادة LDs في SNpc لفئران PD المستحثة بـ MPTP [12]. محتويات غير متبلورة [28]. عادة ، يمكن أن تتدهور LDs عن طريق الالتهام الذاتي لتجنب التراكم [29].شراء cistancheلاستكشاف ما إذا كان كا يمكن أن ينظم LDs في PD ، تم تحليل تراكم LDs عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) في SNPC للتحكم ، MPTP / p ، و MPTP / p Ka الفئران. كما هو مبين في عملنا السابق [12] ، كان عدد وحجم أصحاب التعلم LD

زادت في الفئران MPTP / p مقارنة بالضوابط المعالجة بالمحلول الملحي (الشكل 3 أ و ب) وانخفضت بشكل كبير في الفئران المعالجة كا (الشكل 3 ج-هـ). علاوة على ذلك ، في الفئران المعالجة بـ Ka ، لوحظت LDs بشكل متكرر في مكان قريب أيضًا ، محاطًا أو متحللًا بواسطة الجسيمات الذاتية ، والتي تم تعريفها على أنها حبيبات ليبوفوسين كثيفة الإلكترون. أظهر المزيد من التلوين النسيجي للخلايا العصبية TH مع BODIPY ، صبغة تحدد على وجه التحديد الدهون المحايدة وتستخدم بشكل شائع للكشف عن LDs [30] ، أن كلاً من عدد وحجم BODIPY بالإضافة إلى LDs في SNPC كانت أعلى في الفئران PD مقارنة بالضوابط ، وانخفضت بشكل ملحوظ بواسطة علاج Ka (الشكل 3f-h).

إذا لم يكن من الممكن تدهور LDs في الوقت المناسب ، فقد تخضع LDs المتراكمة للأكسدة وتساهم في إجهاد الميتوكوندريا بوساطة ROS [4] ،مسافه: بعدالذي يضخم السمية العصبية وتطور المرض. ومن ثم ، قمنا أيضًا بفحص ملفات تعريف الجينات المرتبطة بالحماية من سمية FA الحرة (Gpx8) ، وتحييد الأنواع المؤكسدة ، وجذور الأكسيد الفائق (Sod3) وبيروكسيد الهيدروجين (Cat) ، واستقلاب FA (Acsbg1 و Dbi) كما ورد [31] ، والتي انخفضت جميعها بشكل لافت للنظر في SNPC للفئران المعالجة بـ MPTP مقارنةً بالضوابط ، وتم تحسين هذه التأثيرات في الفئران PD المعالجة بـ Ka (الشكل 3i). وبالمثل ، زاد MPTP / p أيضًا من مستويات تعبير mRNA

الصورة 2. يحسن Ka من فقدان الخلايا العصبية DA في SNPC لفئران نموذج MPTP / p PD.

(أ ب) الصور المجهرية للخلايا العصبية الإيجابية للتيروزين هيدروكسيلاز (أ) والتعداد المجسم للخلايا العصبية الإيجابية لـ TH في المادة السوداء بارس كومباكتا (SNpc) (ب). أشرطة مقياس كما هو مبين. (cd) الصور المجهرية للخلايا الإيجابية للكريسيل البنفسجي (ج) والتعداد المجسم للخلايا الإيجابية للكريسيل البنفسجي في SNPC (د). شريط المقياس ، 120 ميكرون. (على سبيل المثال) تحليل اللطخة الغربية لتعبير بروتين TH و DAT في SNpc (e) والتحليل الكمي (f ، g). يتم تطبيع البيانات الكمية لمجموعة مراقبة المياه المالحة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SEM. * P.<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

النتيجة 4. Ka يحمي خلايا SH-SY5Y ضد MPP plus-induced apoptosis

MPP ، المستقلب النشط لـ MPTP ، يثبط إنزيمات الميتوكوندريا المعقدة ويسبب موت الخلية المرتبط مباشرة بـ PD [32]. قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كان بإمكان Ka منع موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن MPPt في المختبر. كما هو مبين في الشكل 4 أ و ب ، تسبب MPPt (40 ميكرومتر ، 24 ساعة) في إطلاق LDH من خلايا SH-SY5Y ، و Ka (30 و 60 ميكرومتر) يخفف بشكل كبير من إطلاق LDH دون التأثير على بقاء الخلية (الشكل 4 أ). منذ أن تسبب كا في تأثير وقائي كبير بتركيز 30 ميكرومتر （. 4 ب ، استخدمنا هذا التركيز في التجارب اللاحقة. أظهرت نتائج تلطيخ Hoechst / PI أيضًا أن Ka قلل بشكل كبير النسبة المئوية للخلايا مع تكاثف الكروماتين الناجم عن MPPt (الشكل 4 ج و د) وموت الخلايا المبرمج الخلوي ، كما يتضح من زيادة كثافة مضان Hoechst (الشكل 4 ج) ونسبة خلايا Hoechst / PI الملطخة (Hoechst plus / PI ') (الشكل 4 هـ). أيضًا ، كما تم اكتشافه بواسطة قياس التدفق الخلوي ، تمت حماية MPP بالإضافة إلى موت الخلايا المبرمج الخلوي المستحث ، والذي يتضح من زيادة النسبة المئوية للخلايا الملطخة بـ Annexin V (AV / PI و AV plus / PI plus) بواسطة Ka (الشكل 4f و g). بالإضافة إلى ذلك ، عكست Ka بشكل ملحوظ التغييرات الناتجة عن MPP في التعبير البروتيني المرتبط بموت الخلايا المبرمج ، كما يتضح من زيادة تنظيم Bcl -2 ، وتقليل تنظيم Bax (الشكل 4hi-j) ، وتقليل انقسام الكاسبيز -3 (الشكل 4 ح ، ك). تشير هذه البيانات إلى أن كا يمكن أن يلغي التأثيرات الضارة لـ MPPt على بقاء الخلية.

النتيجة 5. يمنع كا تراكم LD الناجم عن MPPt وأكسدة الدهون ، والتي تتوسط تلف الميتوكوندريا في خلايا SH-SY5Y

أظهرت الدراسات الحديثة أن تراكم LD غير المتوقع يمكن أن يؤدي إلى زيادة الضغط الناتج عن بيروكسيد الدهون ويسرع من خلل الميتوكوندريا ، مما يعزز التنكس العصبي [10]. أظهر عملنا السابق أيضًا أن LDs المتزايد في SNPC كان مرتبطًا بأمراض PD في الفئران [12]. لاستكشاف ما إذا كان التأثير الوقائي لـ Ka مرتبطًا بتراكم LD في المختبر ، أجرينا أولاً تلطيخًا خاصًا بـ LD في خلايا SH-SY5Y باستخدام BODIPY 493/503 ولاحظنا زيادة ترسب LD (مستويات محسنة من الدهون المحايدة)

النتيجة 6. يعزز Ka الالتهام الذاتي ويقلل من إنتاج mtROS في خلايا SH-SY5Y المعالجة بـ MPP بالإضافة إلى

عادة ، يتم تسليم LDs إلى الجسيمات عن طريق الالتهام الذاتي ويمكن تقسيمها إلى FAs لتجنب بيروكسيد. ومع ذلك ، تشير الدلائل إلى ضعف الالتهام الذاتي ، والذي يلعب دورًا حاسمًا في شلل الرعاش [2]. عندما تتضمن الالتهام الذاتي تقسيم LDs ليتم تفكيكها في الجسيمات الحالة (الشكل 6 أ) ، تسمى العملية بالتحديد التهاب الدهون [2]. للتحقق مما إذا كان الالتهام الذاتي متورطًا في التأثير الوقائي للأعصاب لـ Ka ، قمنا بفحص مستويات البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي. كما هو مبين في الشكل 6 ب-د ، في خلايا SH-SY5Y المستزرعة ، انخفض مستوى السلسلة الخفيفة 3 (LC3) -II المرتبطة بالأنابيب الدقيقة بشكل ملحوظ ، بينما زاد التعبير عن p62 بشكل ملحوظ في خلايا MPP بالإضافة إلى المعالجة ، كما تم قياسه بواسطة التكتل المناعي ، وقد تم عكس هذا التأثير بشكل كبير بواسطة Ka. قمنا أيضًا بفحص التغييرات في الالتهام الذاتي عن طريق التلوين المناعي لـ LC3. للسماح لجسيمات البلعمة الذاتية بالتراكم داخل الخلايا ، تمت إضافة بافيلوميسين لمنع اندماج البلعمة الذاتية مع الجسيمات الحالة. كما هو مبين ، تم الكشف عن أعداد متزايدة من نقاط LC3b في الخلايا المعالجة MPP * ، مما يشير إلى ضعف البلع الذاتي ، وتم عكس هذا التأثير أيضًا بواسطة Ka (الشكل 6 هـ و و). تشير هذه النتائج إلى أن LDs في خلايا SH-SY5Y يتم تعبئتها عن طريق الالتهام الذاتي للإزالة النهائية وأن كا يمكن أن تعزز الالتهام الذاتي لتقليل تراكم الدهون المؤكسدة. يمكن أن تؤدي زيادة بيروكسيد الدهون إلى تفاقم تلف الميتوكوندريا عن طريق زيادة الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا [4]. بالإضافة إلى ذلك ، قلل علاج Ka بشكل كبير من توليد mtROS القوي ، كما هو محدد بواسطة تلطيخ MitoSOX (الشكل 6 ز و ح) ، وقلل من عدد الميتوكوندريا المختلة ، على النحو الذي تحدده الملصقات الخاصة بالميتوكوندريا للتمييز بين التنفس (أحمر عميق MitoTracker) والإجمالي ( MitoTracker green) الميتوكوندريا (الشكل 6i و j). بالإضافة إلى ذلك ، للحصول على عرض مباشر لتعديلات الميتوكوندريا ، اكتشفنا أيضًا معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بواسطة محلل Seahorse XF. كما هو مبين في الشكل 6 ك ، تم تقليل تنفس الميتوكوندريا في الخلايا المعالجة بـ MPPt ، بينما يعكس علاج Ka بوضوح هذا الضرر الناجم عن MPP plus (الشكل 6 ك).

النتيجة 7. تثبيط الالتهام الذاتي يعكس التأثير القمعي لتراكم Kaon LD ، وخلل الميتوكوندريا ، وإصابة الخلايا العصبية DA في المختبر

لفحص ما إذا كانت الالتهام الذاتي هي إحدى الآليات الرئيسية التي تتوسط كا من خلالها الحماية العصبية DA ، تم استخدام مثبط الالتهام الذاتي 3- MA. وجدنا أن التأثيرات المثبطة لـ Ka على الإصابة الناتجة عن MPP # ، بما في ذلك انخفاض تراكم LD (الشكل 7 أ و ب) ، وانخفاض إنتاج mtROS (الشكل 7 ج و د) ، وتخفيف الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا (الشكل 7 هـ و و) في تم حظر خلايا SH-SY5Y بشكل كبير بواسطة 3- MA. نظرًا لأن أكسدة LD وخلل الميتوكوندريا مرتبطان ارتباطًا وثيقًا بموت الخلايا العصبية DA ، قمنا بعد ذلك بفحص الخلايا العصبية الأولية DA المستزرعة. عالجنا الدماغ المتوسط ​​المزروع بالإضافة إلى الخلايا العصبية باستخدام Ka و / أو MPPf وحددنا عدد وطول TH بالإضافة إلى العمليات العصبية عن طريق التلوين المناعي. كشف التحليل المورفولوجي أن عدد وطول العمليات العصبية قد انخفض بشكل ملحوظ بواسطة MPP plus وحمايتها بواسطة Ka ، وتم عكس هذه الحماية بشكل أكبر بواسطة 3- MA (الشكل 7g-i). تشير هذه البيانات إلى أن كا يخفف من تلف الخلايا العصبية DA عن طريق تعزيز الالتهام الذاتي.

النتيجة 8. ألغى إسكات Atg5 الوقاية بوساطة كا لفقدان الخلايا العصبية في الجسم الحي

للتأكيد بشكل أكبر على أن Ka يحمي من TH الناجم عن MPTP / p بالإضافة إلى فقدان الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على الالتهام الذاتي ، قمنا بإسكات Atg5 عن طريق الحقن الدقيق لفيروس مرتبط بالغدية (AAV) - معبرًا عن shRNA المميز سابقًا ضد Atg5 في الدماغ المتوسط ​​الثنائي (الشكل .8 أ) كما تم وصفه سابقًا [25]. في التجارب الأولية ، لاحظنا أن تعداء Atg5 shRNA لمدة أسبوعين حقق تعبيرًا كافيًا من GFP في الخلايا العصبية TH بالإضافة إلى (الشكل 8 ب) وتثبيط تعبير ATG5 في SNPC للفئران المحقونة (الشكل 8 ب). 8 ج). وجدنا أن ضربة قاضية Atg 5- عكست التأثير الوقائي العصبي لـ Ka ، كما يتضح من التعبير البروتيني المنتظم لـ TH (الشكل 8 د و هـ) وزيادة عدد الخلايا العصبية بالإضافة إلى TH (الشكل 8f و g). تدعم هذه البيانات كذلك مساهمة الالتهام الذاتي في التأثير الوقائي لـ Ka في الفئران PD. في الختام ، أكدنا أن Ka يحمي من الإصابة التي يسببها MPTP / p عن طريق تقليل أكسدة LD وخلل الميتوكوندريا من خلال تعزيز الالتهام الذاتي.

4. مناقشة

أظهرت الدراسة الحالية أن الجزيء الطبيعي الصغير Ka كان عاملاً رئيسياً يمكن من خلاله أن تمنع الإشارات الذاتية التسمم المؤكسد للدهون. أظهرت نتائجنا أن مسار الالتهام الذاتي هو حلقة تنظيمية رئيسية يخفف من خلالها كا من بيروكسيد LD وضرر الميتوكوندريا اللاحق ويركز على دور سمية LD التي ينظمها الالتهام الذاتي في التخفيف من تلف الميتوكوندريا أثناء التنفيس المسبق عن التنكس العصبي بسبب الإجهاد التأكسدي المفرط (الشكل. 9).

LDs هي المواقع داخل الخلايا لتخزين الدهون المحايدة [5] وهي ضرورية لعملية التمثيل الغذائي للدهون واستتباب الطاقة ، في حين تم ربط ضعف LD مع العديد من الأمراض [16]. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الأدوار التي تلعبها صعوبة التعلم في علم الأحياء وعلم الأمراض أوسع بكثير مما كان يعتقد سابقًا. في الجهاز العصبي المركزي ، أظهرت الأدلة أن زيادة LDs في الخلايا العصبية والدبقية متورطة في أمراض التنكس العصبي [10،36]. بالتفصيل ، تم اكتشاف LDs في كل من محاور عصبونات Aplysia المزروعة في المختبر [37] وفي أقسام الدماغ من نماذج مرض هنتنغتون [38] بالإضافة إلى ذلك ، فقد تبين أن الخلايا العصبية حساسة بشكل خاص لسمية الدهون ، وتراكم LDs الذي لا يمكن إزالته في الوقت المناسب يؤدي إلى تسريع أكسدة LD ويمكن أن يؤدي إلى تنكس عصبي [17].

يعتبر تراكم الدهون في الخلايا العصبية المفرطة النشاط سامًا ليس فقط بسبب قابلية هذه الدهون للبيروكسيد. علاوة على ذلك ، قد تدخل محتويات LDS الزائدة في مسارات التمثيل الغذائي غير المؤكسدة ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج السيراميد ، وهو مادة سامة للخلايا [39]. أظهرت الدراسات الحديثة أيضًا أنه في الخلايا التي بها خلل في LD ، يمكن تحويل FAs إلى acylcarnitines ، والتي تسبب بعد ذلك خللًا وظيفيًا في الميتوكوندريا وإنتاج ROS [40]. من المحتمل أن يكون لهذه العمليات عواقب محددة وعميقة في الخلايا العصبية مفرطة النشاط لأن الميتوكوندريا المختلة تؤدي إلى المساس بالقدرة على استهلاك FA ، كما يتسبب إنتاج mtROS في زيادة أكسدة الدهون في الغشاء.

وبالتالي ، يجب التحكم في توازن LD بشكل جيد في الخلايا العصبية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتجنب السمية وفي النهاية الحفاظ على صحة الدماغ. في هذه الدراسة ، وجدنا أن الجزيء الطبيعي الصغير Ka يثبط سمية LD العصبية التي تتجلى في زيادة تراكم LD ، وارتفاع بيروكسيد الدهون ، والتعبير الجيني المرتبط بسمية الدهون المنتظمة في خلايا SH-SY5Y المستخلصة من MPP #. والأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أيضًا أن علاج Ka يقلل من 45]. في الدراسة الحالية ، لاحظنا خلل الالتهام الذاتي / الدهون في الخلايا العصبية المصابة MPPt ، بما في ذلك انخفاض مستويات LC 3- II وارتفاع تعبير p62 ، و زيادة عدد نقط LC3B المودعة في الخلايا. تم عكس التهاب الدهون المعيب في خلايا SH-SY5Y المصابة عن طريق العلاج بـ Ka. نتيجة لذلك ، قلل كا من تراكم LDs المؤكسد والميتوكوندريا التالفة وتوليد mtROS في خلايا SH-SY5Y المعالجة بـ MPP #. الأهم من ذلك ، أن تثبيط الالتهام الذاتي بواسطة 3- ألغى التخلص بوساطة Ka من LDs المؤكسد والميتوكوندريا التالفة والتخفيف من إصابة الخلايا العصبية DA في المختبر. علاوة على ذلك ، أدى تثبيط الالتهام الذاتي بواسطة ضربة قاضية Atg5 في الجسم الحي إلى عكس التأثيرات الوقائية لتنكس الخلايا العصبية Kaon DA في نموذج الماوس PD الناجم عن MPTP. بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن كا يمنع ضرر الميتوكوندريا المرتبط بسمية LD عن طريق تعزيز الالتهام الذاتي في نموذج PD تجريبي.

تشير الأدلة المتراكمة إلى أن زيادة توليد mtROS هي خاصية أساسية للخلايا العصبية عالية النشاط وقد لوحظ في العديد من NDDs ، بما في ذلك PD [46]. التقارير حول ما إذا كانت ROS هي سبب أو نتيجة لتكوين صعوبة التعلم متناقضة [47 ، 48]. ومن المثير للاهتمام ، أن نتائجنا في المختبر أظهرت أن التثبيط الدوائي لبيروكسيد LD مع o-tocopherol منع توليد mtROS والتشوهات المحتملة في غشاء الميتوكوندريا وتخفيف التخفيضات في الميتوكوندريا ، كما يتضح من تلطيخ Tomm20 في خلايا SH-SY5Y ، والتي تدعم فكرة أن LD بيروكسيد يلعب دور دور سببي في خلل الميتوكوندريا الناجم عن MPP وتوليد mtROS. ومع ذلك ، فمن الممكن أن يؤدي ارتفاع مستوى الأكسجين التفاعلية (ROS) في البداية إلى تسريع تكوين LD ، وبالتالي ، تحفز LDs المزيد من إنتاج ROS وتفاقم مستويات ROS داخل الخلايا والميتوكوندريا.

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن الفئران المصابة بـ PD المستحثة بـ MPTP كانت لديها مستويات عالية من تراكم LD ، والذي كان مصحوبًا بزيادة فقدان الخلايا العصبية DA ، والإجهاد المتسارع بوساطة ROS ، والعجز السلوكي. منع علاج كا سمية LD في المختبر وحسن فقدان الخلايا العصبية DA والعجز السلوكي في نموذج الفأر PD ، وكانت هذه التأثيرات تعتمد على الالتهام الذاتي. لذلك ، من المعقول أن نستنتج أن كا يعزز الالتهام الذاتي ، وهذا الالتهام الذاتي المعزز يقلل من تراكم LD المؤكسد ، ويقلل من إنتاج mtROS ، ويخفف من تلف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية DA ، مما يساهم في تثبيط سمية LD ، وبالتالي يخفف من أمراض PD (الشكل 1). 9).

التمويل

تم دعم هذا البحث بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81903587) ، والمشروع الممول من مؤسسة الصين لما بعد الدكتوراه (رقم 2019M661807) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (رقم BK20190120) ، و فتح مشروع تخصص المواد الطبية الصينية من الدرجة الأولى بجامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم 2020YLXK006) ، والمشروع الرئيسي لابتكار الأدوية (رقم 2018ZX 09711001-003-007).

تم استخراج هذه المقالة من Redox Biology 41 (2021) 101911