الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للنيفرون في الكلى الطبيعية والكيسية

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

توماس بلانك 1،2،7 ، نيكولاس جودين 3،7 ، محمد زيدان 1،4،7 ، مريم جارفا تراوري 3 ، فرانك بينيم 1،5 ، ليزا تورينسكي 1 ، سيرج غارباي 1 ، كليمين نجوين 1 ، مارتين بيرتين 1 ، جيرارد فريدلاندر 1،6 ، فابيولا Terzi1،8 و Marco Pontoglio1،8

الكستانش مفيد للكلى

الكلمات الرئيسية: مرض الكلى الكيسي. الكلى؛ نفرون. التهاب الكلية.تطهير الأنسجة

تعتمد وظيفة الكلى بشكل أساسي على البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد للنيفرون. أي تشويه لشكلها قد يؤدي إلىضعف الكلى. تمثل الطرق النسيجية التقليدية قيودًا كبيرة لإعادة بناء الأنسجة ثلاثية الأبعاد. هنا ، قمنا بدمج تطهير الأنسجة والفوتون المجهري والتعقب الرقمي لإعادة بناء النيفرون الفردي في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. مجموعات منالنيفرونتم تحديد الاختلاف في الموقع والشكل والحجم حسب وظيفتهم. ومن المثير للاهتمام أن النيفرون تميل إلى الاستلقاء في الطائرات. عندما تم تطبيق هذه التقنية على نموذجمرض الكلى الكيسي، تم العثور على الخراجات لتتطور فقط في قطاعات نيفرون محددة. على طول نفس المقطع ، تكون الأكياس متجاورة داخل الأنابيب العادية غير المتوسعة. علاوة على ذلك ، تباينت أشكال الأكياس وفقًا لقطاع النيفرون. وبالتالي ، توفر هذه العناصر استراتيجية قيمة لتصور البنية المعقدة للكلى على مستوى النيفرون المفرد ، والأهم من ذلك أنها توفر أساسًا لفهم العمليات المرضية مثل تكوين المثانة.

بيان متعدية

توفر طرق المقاصة أداة فريدة لفهم كيف تؤدي التغيرات المورفولوجية إلى عواقب مرضية. الكلى هي أعضاء مهمة تحافظ على توازن الجسم من خلال الماء ، والمستقلبات ، ومعالجة الكهارل ، والتي تعتمد بشكل أساسي على التركيب المعقد 3- لأبعاد النيفرون. عندما يتم تغيير هذا التنظيم الهيكلي ، يترتب على ذلك فيزيولوجيا المرض الكلوي. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة قوية تعتمد على المقاصة الضوئية ،

الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، والتتبع الرقمي لدراسة الكلى على مستوى النيفرون المفرد في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. على وجه الخصوص ، نقدم 3- إعادة بناء الأبعاد الأولى للكلية متعددة الكيسات على مقياس النيفرون المفردة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من السياقات المرضية ، مما يسمح لنا بفهم العملية المعقدة لتدهور الكلى بشكل أفضل ، وبالتالي تطوير استراتيجيات علاجية أكثر استهدافًا.

تحافظ الكلى على توازن الجسم من خلال بنية النيفرون المعقدة 3- ثلاثية الأبعاد. عندما يتم تغيير هذا التنظيم الهيكلي ، يترتب على ذلك فيزيولوجيا المرض الكلوي.أمراض الكلى المزمنةتتميز بتطور الآفات الكلوية. من المثير للاهتمام ، أن علماء الأمراض قد أبلغوا عن وجود تباين واسع في توزيع الآفات أثناء أمراض الكلى المزمنة. ، غير معروف. لمعالجة هذه المشكلة ، من الضروري إعادة بناء الشكل ثلاثي الأبعاد للنيفرون في السياقات المرضية.

على حد علمنا،النيفرونتمت إعادة بنائها بالكامل فقط باستخدام أقسام ثنائية الأبعاد. هذا يرجع في المقام الأول إلى التشوهات الميكانيكية ، وهو تأثير لا مفر منه لإجراء التقطيع. علاوة على ذلك ، لا تسمح إعادة البناء ثلاثية الأبعاد من الصور ثنائية الأبعاد بالتصوير المباشر للهياكل ثلاثية الأبعاد في الأنسجة المركبة بالكامل.

لقد حسّن الفحص المجهري Multiphoton من قدرتنا على اكتشاف التغيرات المورفولوجية في المقاطع السميكة. ومع ذلك ، فإن القيد المهم هو العمق الضحل الذي يمكن الوصول إليه بسبب تشتت الضوء. من خلال تقليل فروق معامل الانكسار إلى الحد الأدنى ، حسنت عوامل التطهير بشكل كبير من القدرة على تصوير الأعماق. .9-17 أظهرت الدراسات الحديثة قدرتها على تصوير الأعضاء الصلبة الأخرى ، مثل الكبد أو البنكرياس أو الكلى .18-26

cistanche لمرض الكلى

مرض تكيس الكلىهو اضطراب غير متجانس وراثيًا يتضمن طفرات في العديد من الجينات الهدبية ، وهو أكثر أمراض الكلى الوراثية شيوعًا. يتميز مرض الكلى المتعدد الكيسات بتطور الأكياس التي تؤدي إلى التدمير الكامل للكلية. تتطور إما كـ "دفع للخارج" لجزء نيفرون ، كما هو الحال في تعدد الكيسات الجسدية السائدةمرض كلوي؛ كتمدد خارج الرحم لقنوات التجميع (CDs) ، كما هو الحال في الصبغي الجسدي المتنحي متعدد الكيساتمرض كلوي؛ أو بشكل حصري في الأنابيب النخاعية ، كما هو الحال في انحلال الكلية (NPHP). ومع ذلك ، لا تزال كيفية تطور الأكياس ثلاثية الأبعاد وتنظيمها مع بعضها البعض والأنابيب المجاورة الطبيعية غير معروفة.

هنا ، قمنا بدمج المقاصة الضوئية مع الفحص المجهري متعدد الفوتونات لتقديم رؤى جديدة حول الكيفيةالنيفرونتتشكل وتنظم في ظروف فسيولوجية وكيف يتم تعديلها أثناء المرض ، مثل تكون المثانة. تظهر نتائجنا أن هناك 3 أنواع من النيفرون وأن الأوعية قد تؤثر على التنظيم المكاني للنيفرون. ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أن النيفرون تميل إلى الاستلقاء في طائرات محددة. بشكل غير متوقع ، عندما طبقنا هذه التقنية على فئران jck ، لاحظنا أن الأكياس تطورت فقط في مقاطع نيفرون محددة مع أكياس مغزلية متداخلة مع الأنابيب الطبيعية.

النتائج

الإعداد التجريبية

لدراسة شكل كاملالنيفرونفيما يتعلق ببيئتهم ، اعتمدنا تقنية تعتمد على المقاصة الضوئية والفحص المجهري متعدد الفوتونات (الشكل التكميلي S1A). بمقارنة بروتوكولات المقاصة الضوئية المختلفة ، قررنا أنه بالنسبة للكلية ، كان كحول البنزيل / بنزوات البنزيل (BABB) هو الأنسب من حيث الفعالية (الشكل التكميلي S1B و C والجدول التكميلي S1).

تتطلب إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والتعقب الرقمي صورًا عالية الجودة ذات دقة عالية ونسبة إشارة إلى خلفية عالية. لاحظنا أن الإشارة الضوئية التي قدمتها الفلورة الأصلية لم تكن موحدة على أقسام الكلى. على وجه الخصوص ، كانت الصور من النخاع متناقضة بشكل سيئ مع نسبة منخفضة للإشارة إلى الخلفية (الشكل التكميلي S2). لتحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية ، قمنا بتلوين الأقسام باستخدام حمض-شيف الدوري (الشكل التكميلي S1D) ، لأننا لاحظنا تجريبياً أن هذا التلوين أدى إلى تباين عالٍ في الأقسام الرقيقة أثناء 2- تألق الفوتون. ومع ذلك ، لم تكن الإشارة موحدة في جميع أقسام الكلى الدورية السميكة الملطخة بحمض شيف (الشكل التكميلي S1E). لذلك ، قمنا بتلوين أقسام الكلى مع الليكتين المقترن بالفلوروكروم: راصات الفول السوداني وجراثيم القمح agglutinin ، التي تلطخ الكبيبات والأنابيب ، و Griffonia simplicifolia agglutinin ، الذي يميز الأوعية الدموية. تم زيادة نسبة الخلفية بشكل كبير بشكل كبيرأقسام الكلى، مع تحسن كبير في كل من المستوى xy والمحور z (الشكل التكميلي S1E والفيلم التكميلي S1).

تصور ثلاثي الأبعاد لقطاع النيفرون

لتصور شكل النيفرون بالكامل ، قمنا بتتبع مساراتها ، بدءًا من القطب البولي في الكبيبة وانتهاءً عند تقاطع القرص المضغوط (الفيلم التكميلي S2). على الرغم من حقيقة أن الليكتينات المستخدمة عالميًا تربط جميع قطاعات النيفرون ، فقد لاحظنا أنه عند فحصها بعناية ، تميزت هذه الليكتينات بنمط محدد في الطريقة التي تلطخ بها الأغشية القاعدية أو اللمعية في مقاطع النيفرون المختلفة. بمعنى آخر ، استفدنا من النمط النمطي لتلطيخ الليكتين لتحديد قطاعات النيفرون المختلفة. بهذه الطريقة ، يمكننا بسهولة تحديد 6 كيانات: الأنبوب القريب (PT) ، والطرف الرفيع (TL) من حلقة Henle (HL) ، والطرف الصاعد السميك (TAL) من HL ، والنبيب الملتوي البعيد (DCT) ، والنبيبات المتصلة (CNT). ) و CD. تميز الانتقال بين PT و TL بالفقدان المفاجئ لإشارة حدود فرشاة PT النموذجية وانخفاض عرض التجويف ، والذي كان غائبًا تقريبًا في TL (الشكل 1 أ). على العكس من ذلك ، تميز الانتقال بين TL و TAL بزيادة كبيرة في القطر الأنبوبي الخارجي وعرض التجويف الثابت نسبيًا (الشكل 1 ب). في الكلالنيفرون، تم العثور على انتقال TAL إلى DCT بشكل منهجي في القطب الوعائي للكبيبة. تميز هذا الانتقال بتوسيع مفاجئ للقطر الأنبوبي الخارجي الذي كان في الغالب بسبب زيادة كبيرة في قطر التجويف (الشكل 1 ج). تميز الانتقال بين DCT و CNT بانخفاض في كل من القطر الأنبوبي والتجويف (الشكل 1 د). أخيرًا ، تميز الاتصال بين CNT والقرص المضغوط القشري بزيادة مفاجئة في كل من القطر الأنبوبي والتجويف (الشكل 1 هـ). كان التحديد الكمي لهذه التحولات المورفولوجية ذا دلالة إحصائية (الشكل 1f) ، وتم التحقق من ملاءمته بالتلطيخ بعلامات أنبوبية محددة (الأشكال التكميلية S3 – S5 والفيلم التكميلي S3 – S5).

يختلف شكل وحجم PT باختلاف عمقها

تلطيخ سميكةأقسام الكلىسمح لنا بتتبع إحداثيات التطور المكاني لقطاعات PT بأكملها. ومن المثير للاهتمام ، اكتشفنا أن شكلها كان متغيرًا للغاية ويتم تحديده من خلال موضع الكبيبات في القشرة. على الصعيد العالمي ، حددنا 3 أنماط. استجاب المركز الأول إلى معظم النيفرونات الفائقة (SNs) (الشكل 2 أ ؛ الفيلم التكميلي S6) ، والتي احتلت الجزء الخارجي من القشرة (أكثر 30 في المائة خارجية قريبة من الكبسولة الكلوية). شكلت أجزائها الملتفة هياكل مدمجة بها 6 إلى 7 تلافيفات فقط حول الكبيبة الخاصة بها ، وتحتل مساحات صغيرة جدًا ومعبأة بإحكام. انتهى الالتواء من هذه SNs في الجزء المستقيم الطويل والمستقيم الذي نزل إلى النخاع. في الطرف الآخر من هذا الطيف ، لاحظنا النمط الثاني منالنيفرونتقع في أعمق جزء من القشرة (40 في المائة عمق داخلي أكثر) ، بجانب النخاع (النيفرون المتجاور [JNs]) (الشكل 2 أ ؛ الشكل التكميلي S6 والفيلم التكميلي S6). تميزت PT الخاصة بهم بحلقة أولية قصيرة تنحدر بشكل منهجي نحو الحليمة ثم تحول U للصعود نحو الكبسولة الكلوية. على النقيض من SNs ، تميزت الأنابيب الملتوية القريبة JN بملفات كبيرة تطورت حول الكبيبة الخاصة بها واحتلت نطاقات كبيرة معبأة بشكل غير محكم في القشرة المجاورة للنواة. كان الجزء الملتوي من PT من JNs يحتوي على 10 إلى 15 تلافيفًا ، مما يشكل نطاقات كبيرة. أخيرًا ، تضمن النمط الثالث النيفرون الموجود في الجزء الأوسط من القشرة (النيفرون الأوسط [MNs]) (الشكل 2 أ ؛ الفيلم التكميلي S6). ومن المثير للاهتمام ، أن هذه الأنابيب لها شكل واتجاه مكاني يمثلان انتقالًا بين SNs و JNs. في الواقع ، احتوتوا على 8 إلى 9 أغلفة تحويلية مع ملفات أكبر من SNs ، لكنها أصغر من JNs. بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى MNs أطول بارس مستقيم من JNs. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت مقارنة عالمية لأشكال PTs أن SNs و MNs كان لها نمط متجانس بينما كانت JNs غير متجانسة للغاية (الشكل التكميلي S6). بالإضافة إلى ذلك ، كشفت إعادة البناء المكاني للعديد من النيفرون أن PTs لا تختلط أبدًا (الفيلم التكميلي S6) ، مما يشير إلى أن كل نيفرون يشغل مساحة فردية خاصة به في القشرة.

أكدت التحليلات المورفومترية الاختلافات الكبيرة في حجم وشكل SNs و JNs ، مع جانب وسيط لـ MNs. كان PT لـ JNs أطول من 2- أضعاف من PT لـ SNs (الشكل 2 ب) ؛ ومع ذلك ، كان الاستقامة أكبر في SNs منه في JNs (الشكل 2 ج) ، بما يتفق مع الملاحظة القائلة بأن أنابيب JN كانت أكثر تعقيدًا (الشكل 2 أ ؛ الشكل التكميلي S6).

الشكل 1|المعايير المورفولوجية المستخدمة لتحديد قطاعات النيفرون. (أ - هـ) مورفولوجيا الأجزاء المختلفة من النيفرون في الفئران الضابطة. تم تتبع النيفرون من القطب البولي في الكبيبة إلى قناة التجميع (النبيب القريب [PT]: الفيروز ؛ الطرف الرفيع [TL] من حلقة هنلي: رمادي فاتح ؛ الطرف الصاعد السميك [TAL] من حلقة هنلي: رمادي غامق ؛ النبيبات الملتوية البعيدة [DCT]: وردي ؛ النبيب المتصل [CNT]: أصفر ؛ قناة التجميع القشرية [CCD]: برتقالي). تشير الأسهم إلى قطر مقاطع النيفرون المختلفة. (واصلت)

الشكل 1|(تتمة) (و) التحديد الكمي للقطر الأنبوبي الخارجي لقطاعات النيفرون المختلفة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: ** P <0. 0="" 1="" ،="" ***="" p=""><>

الشكل 3|تكشف إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد (3D) عن 3 أنواع مختلفة من النيفرون. (أ) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية لكليونات كاملة (اللوحات اليسرى) من الكبيبات إلى مجرى التجميع في القشرة الاصطناعية الفائقة (الزرقاء) والقشرة الوسطى (الخضراء) والمنطقة المجاورة (الحمراء) في الفئران الخاضعة للتحكم. تجزئة النيفرون (اللوحات اليمنى) لثلاثة أنواع مختلفة من النيفرون. شريط ¼ 150 مم. (ب) التحديد الكمي للمسافة بين طرفي حلقة Henle للأنواع الثلاثة من النيفرون. (ج) التحديد الكمي لطول النيفرون لـ (تابع)

الشكل 3|(تابع) 3 أنواع من النيفرون. (د) التحديد الكمي لطول الأجزاء المختلفة من النيفرون وفقًا لنوع النيفرون. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني -SEM. تحليل التباين متبوعًا باختبار Tukey-Kramer: النيفرون juxtamedullary (JN) مقابل النيفرون الفائق (SN): ### P <0. 0="" 0="" 1؛="" jn="" مقابل="" النيفرون="" الأوسط="" (mn):="" *="" p=""><0. 05="" ،="" **="" p=""><0.01 ،="" ***="" p=""><0.001. cnt="" ،="" توصيل="" الأنابيب="" ؛="" dct="" ،="" نبيب="" ملتوي="" بعيد="" ؛="" pt="" ،="" النبيبات="" القريبة.="" tal="" ،="" الطرف="" الصاعد="" السميك="" لحلقة="" henle="" ؛="" tl="" ،="" طرف="" رفيع="" من="" حلقة="">

يختلف حجم الكبيبات باختلاف العمق

ثم قمنا بتحليل عمق وقطر الكبيبات التي تم اختيارها عشوائيًا من كل منطقة من المناطق الثلاث. كشفت التحليلات المورفومترية أن الكبيبات كانت تقع في المتوسط ​​783 و 355 ملم من الكبسولة الكلوية في JNs و SNs ، على التوالي. كما ذكرنا سابقًا ، لاحظنا أن حجم الكبيبات يختلف باختلاف عمقها. على وجه الخصوص ، كان الحجم الكبيبي لـ JNs أكبر بثلاث مرات من حجم SNs و MNs (الشكل 2 د).

إعادة بناء النيفرون ثلاثي الأبعاد

ثم قمنا بتتبع التطور المكاني للكليونات بأكملها من PT إلى CNT. أكدت النظرة العالمية لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد الخاصة بهم أن شكل النيفرون يختلف بين SNs و MNs و JNs (الشكل 3 أ ؛ الفيلم التكميلي S7). كان هذا الاختلاف يرجع بشكل أساسي إلى هيكل PT. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن HL لديها تنظيم مكاني ثلاثي الأبعاد مختلف. على وجه الخصوص ، تم فصل TL و TAL بشكل بعيد في JNs منه في SNs و MNs (الشكل 3 ب). كشفت التحليلات المورفومترية أن JNs كانت عالميًا {{5} أضعاف أطول من SNs (الشكل 3 ج). تم توزيع الطول المتزايد بشكل متناسب في جميع القطاعات ، باستثناء TAL و DCT ، والتي تميل إلى أن يكون لها نفس الطول المطلق في جميع أنواع النيفرون (الشكل ثلاثي الأبعاد). هذا يشير إلى أن استطالة النيفرون هي عملية نمطية متجانسة بشكل مدهش.

تتدفق الأوعية المقوسة إلى الالتواء PT juxtamedullary

للحصول على منظور أكثر شمولاً لملفهيكل الكلى، استفدنا من تلطيخ Griffonia simplicifolia agglutinin ، والذي سمح لنا بتتبع الأوعية المقوسة وفروعها في الأوعية المشعة القشرية (الشكل 4 أ ؛ الفيلم التكميلي S8). ومن المثير للاهتمام ، أن إعادة البناء ثلاثية الأبعاد المصاحبة للكليونات والأوعية أظهرت أن الأوعية المقوسة تميل إلى أن تكون في تنظيم مكاني موازٍ مدهش مع الأنابيب القريبة. على وجه الخصوص ، لاحظنا أن المسار الذي يتبعه JNs محددة (JNs المقيدة) يميل إلى اتباع مسار السفينة المجاورة (الشكل 4 ب ؛ الفيلم التكميلي S9). بشكل ملحوظ ، هذا التحيز (لوحظ فقط في مجموعة فرعية من نيفرون JN) كان مسؤولاً عن عدم التجانس الكبير في أشكال PT (الشكل التكميلي S6). كشفت التحليلات المورفومترية أن PTs "المقيدة" كانت أطول بشكل ملحوظ وأكثر تعقيدًا (استقامة منخفضة) من تلك "غير المقيدة" (الشكل 4 ج و د). تجدر الإشارة إلى أن الأجزاء الملتفة من كل من SNs و MNs كانت موضوعة فوق الأوعية المقوسة ولم تكن مقيدة.

تميل الأنابيب الصغيرة إلى الاستلقاء في الطائرات

ومن المثير للاهتمام ، أن فحص الأشكال ثلاثية الأبعاد للنيفرون أشار إلى أنها تميل إلى الاستلقاء في الطائرات (الشكل 5 أ ، الفيلم التكميلي S1 0). لتقدير هذه المعلمة وتقييم التحيز الإحصائي المحتمل لهذا التشكل ، قمنا بقياس الاتجاه العام للأنابيب للانحناء عن المستوى المحدد بواسطة حلقاتها. أظهرت قياساتنا أنه بالمقارنة مع نموذج محاكاة للمشي العشوائي الذي تم إنشاؤه باستخدام نفس المجموعة من الزوايا المقاسة المتتالية والطول بين النقاط المتتالية (الشكل 5 ب) ، تميل الأنابيب إلى التطور بانحراف أصغر عن المستوى (الشكل 5 ج). يشير هذا إلى أن الأنابيب تميل إلى تقييد مسارها على طول المستوى. كانت الفروق الملحوظة ذات دلالة إحصائية عالية (P <>

يمكن أن يحسن cistanche وظائف الكلى

تكشف إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد عن نمط محدد لتطور الكيس

لتحديد ما إذا كان بروتوكولنا يسمح بتتبع النيفرون في الأنسجة المرضية غير المنظمة ، قمنا بتمييز الأشكال والتوزيع المكاني للكيسات في فئران jck ، وهو نموذج مستخدم على نطاق واسع من NPHP والمرض الكيسي .31 - 33 3 أظهرت صور D ذلك على الرغم من من ظهور الخراجات البارزة ، لم يختلف المسار العام ثلاثي الأبعاد للنيفرونات بشكل كبير عن مسار الفئران الضابطة (فيلم إضافي S11). وبالمثل ، أكدت التحليلات المورفومترية أن الطول الكلي للنيفرون والحجم الكبيبي وطول كل منهانفرونكان المقطع قابلاً للمقارنة مع فئران التحكم (الشكل التكميلي S7). تجدر الإشارة إلى أنه بسبب تطور الكيس ، لم نتمكن من التفريق بين TL من TAL في HL. طورت جميع النيفرون كيسات مغزلية (الأفلام التكميلية S11 و S12). كانت إحدى السمات الأكثر لفتًا للنظر هي ملاحظة أن التوسعات الكيسية المغزلية حدثت في مواقع متعددة على طول نفسنفرونالمقطع (الافلام التكميلية S12 و S13). ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أن الأكياس لم تتطور أبدًا في الأطراف النازلة PTs و HL (الشكل 6 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). في المقابل ، تم اكتشافها في الغالب في الأطراف الصاعدة HL ، و DCTs ، و CNTs ، وفي الجزء العلوي من الأقراص المضغوطة ، بالتزامن مع CNT (الشكل 6 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). على وجه الخصوص ، لاحظنا أن DCT ، وكذلك مقاطع CNT ، لديها احتمالية متزايدة بشكل غريب لتطوير الخراجات في الأجزاء البعيدة لكل منها (الشكل 6 ب). كشفت التحليلات المورفومترية الكمية لصور إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد أن الحجم الكلي للكيس لكلنفرونكان مرتفعًا بشكل خاص في CNT (الشكل 7 أ). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن الكيسات الكبيرة في HL و DCT كانت أكبر في JNs منها في SNs و MNs (الشكل 7 أ ؛ الفيلم التكميلي S12). علاوة على ذلك ، كان حدوث الكيس أعلى بشكل ملحوظ في JNs من الأنواع الأخرى من النيفرون (الشكل 7 ب). لاحظنا أيضًا أن متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية (المحسوبة على أقرب 5 كُبيبات) تميل إلى الزيادة بشكل خاص في الفئران الكيسية ، خاصة في القشرة المخية الفائقة (الشكل التكميلي S8).

كشفت إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للعديد من الأكياس أنها كانت متغيرة للغاية في الشكل والحجم (الشكل 6 ج ؛ الأفلام التكميلية S11 و S13). في الطرف الصاعد HL ، كان للخراجات شكل مغزلي بقطر صغير. في DCT ، كان للخراجات شكل كروي إلى حد ما وأكبر وتتخللها نبيبات غير متضخمة. ومن المثير للاهتمام ، أن الانتقال بين DCT و CNT تميز بشكل منهجي بهيكل طبيعي غير متماسك. في المقابل ، في CNT ، لاحظنا بشكل منهجي بنية كيسية متوسعة متصلة مباشرة بالقرص المضغوط. ومن المثير للاهتمام ، في القرص المضغوط ، تقلص هذا الهيكل تدريجيًا إلى حجم النبيبات الطبيعي. وبشكل أكثر بعدًا ، لا يمكن الكشف عن أي كيسات أخرى في الجزء المجاور للقرص المضغوط. ميزة أخرى متسقة هي التنظيم المكاني الغريب للخراجات في الطرف الصاعد HL. في الواقع ، على الرغم من أن الخراجات كانت أعمق وأقرب إلى الحلقة في SNs ، إلا أنها كانت أكثر اصطناعية وأقرب إلى DCT في JNs (الشكل 6 ج). مرة أخرى ، احتلت الأكياس موقعًا وسيطًا في MNs (الشكل 6 ج).

الشكل 5|تميل نبيبات النيفرون إلى التطور كهيكل مسطح. (أ) مسار نموذجي للنبيبات القريبة من النيفرون. يوضح هذا المسار ميله إلى الاستلقاء في المستوى. يمكن رؤية مستوية تطور المسار بشكل أفضل عند تدويرها بشكل صحيح ومواءمتها مع وجهة نظر المراقب (انظر التمثيل الأيمن لنفس القطعة الأنبوبية ، والتي ، على الجانب الأيسر ، يتم تمثيلها على شكل مختلف زاوية). (ب) تمثيل تخطيطي لمسار أنبوبي يتكون من 4 أجزاء (بين 5 نقاط تحدد مسارًا أنبوبيًا معينًا كما هو موضح كمثال). يمكن تمثيل الدرجة التي تميل بها المسارات إلى "الخروج من مستواها" بالزاوية المشار إليها هنا باسم "بيتا". (واصلت)

الشكل 5|(تابع) يتم قياس هذه الزاوية بين المقطع p 3- p4 فيما يتعلق بالمستوى (المحدد بالنقاط السابقة مباشرة p3 و p2 و p1) ويمثلها مستطيل رمادي غامق في المخطط. ثم تم حساب زوايا بيتا بشكل متكرر على طول مجموعة النقاط في مسار أنبوبي. لتقييم مدى انحياز زوايا بيتا هذه ، قمنا بمحاكاة المشي العشوائي (محاكاة مونت كارلو [MC]) باستخدام نفس مجموعة زوايا ألفا المتتالية لكل مسار أنبوبي (مقاسة بين جميع المقاطع المتتالية). أنشأ هذا المشي العشوائي مسارًا بمجموعة متطابقة من زوايا ألفا وزوايا بيتا العشوائية. (ج) قطع الكمان للتوزيع العالمي لزوايا بيتا ونتيجة MCs في الأنبوب القريب (PT) ، والطرف الرفيع (TL) من حلقة Henle ، والطرف الصاعد السميك (TAL) لحلقة Henle ، والنبيب الملتوي البعيد ( DCT) والنبيب الضام (CNT). MCs، P <0.>

نقاش

الطرق النسيجية التقليدية محدودة في قدرتها على اكتشاف التغيرات المرضية التي تؤثر على الشكل العالمي للكليونات. هنا ، نقدم نهجًا قويًا يعتمد على تطهير الأنسجة الذي لديه القدرة على معالجة الأسئلة الحاسمة حول بنية الكلى بتفاصيل مكانية غير مسبوقة في ظل الظروف العادية والمرضية. أكدت نتائجنا وجود 3 أنواع من النيفرون تختلف في موقعها وشكلها وحجمها بما يتوافق مع خصائصها الوظيفية. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن النيفرون تميل إلى الاستلقاء في الطائرات والتكيف مع التنظيم المكاني للسفينة. المثير للاهتمام ، عندما طبقنا هذه التقنية على نموذجمرض الكلى الكيسي، لاحظنا أن الخراجات تتطور في الكل

النيفرون ، ولكن فقط في قطاعات محددة. ومن المثير للاهتمام ، لقد أظهرنا أن شكل الكيس يختلف باختلاف شريحة النيفرون ، وأنه على طول نفس النيفرون ، تتداخل الكيسات مع الأنابيب الطبيعية غير المتضخمة. إجمالاً ، توفر هذه النتائج التوصيف ثلاثي الأبعاد الأول للترتيب المكاني للنيفرون والأوعية وتوفر بشكل مهم الأساس لفهم عملية مرضية ، مثل تكوين المثانة.

يعد المقاصة الضوئية للكلى أمرًا صعبًا بسبب المستويات العالية من التألق الذاتي وكثافة الخلايا. من خلال مقارنة بروتوكولات المقاصة المختلفة ، حددنا في BABB تقنية قوية لتنفيذ التصور وإعادة بناء الهياكل الموجودة في أعمق جزء منالكلى، وهذا هو ، النخاع. علاوة على ذلك ، فإن BABB سريع وقابل للتطوير ، وبمجرد مسحه ، يمكن تخزين العينات لعدة أشهر قبل الحصول على الصورة. الميزة الرئيسية الأخرى لهذه التقنية هي تكلفتها المنخفضة. قد تؤدي عوامل المقاصة إلى تقلص الهياكل أو تضخمها. أحد أهم القيود هو التعليق التوضيحي للهياكل التي تستغرق وقتًا طويلاً. ومع ذلك ، هناك عدد متزايد من التقنيات القائمة على التعلم العميق والتي يجب أن تتغلب بسرعة على هذا القيد.

تمشيا مع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التقنيات الكلاسيكية ، أظهرت دراستنا أن النيفرون تختلف في شكلها وطولها وفقًا لموقعها. على وجه الخصوص ، لاحظنا أن JNs لديها PTs معقدة أكثر تطوراً وكبيبات أكبر وأطول مرتين من SNs. الطول المتزايد هو نتيجة لعملية متناغمة لأن الإطالة تؤثر بشكل متناسب على جميع قطاعات النيفرون. لاحظنا أيضًا أن JNs لديها HL أكبر. إجمالاً ، تُظهر هذه البيانات بوضوح أن التشريح الجزئي لـ SNs و JNs مختلفان بشكل كبير وأن MNs تعرض ميزات وسيطة. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات الفسيولوجية أظهرت أن النيفرون أيضًا مختلف وظيفيًا .2 الأحداث المورفولوجية التي تكمن وراء هذه الاختلافات غير معروفة حتى الآن. وبالتالي ، من المغري التكهن بأن البنية الخاصة لشبكات JN قد تفسر خصوصية وظائفها.

ومن المثير للاهتمام ، من خلال توفير إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للنيفرون والأوعية المحيطة بها للمرة الأولى ، اكتشفنا قيودًا مكانية بين الأوعية المقوسة ومجموعة فرعية من النيفرون. وبالتالي ، فمن المتصور أن السفن قد تملي الطريقالنيفرونإطالة أثناء التطوير. 34،35 كشف فحص الأشكال ثلاثية الأبعاد للنيفرون جنبًا إلى جنب مع المحاكاة الحسابية أن النيفرون لا يختلط أبدًا وأن كل نفرون يميل إلى الاستلقاء في المستوى. لا يزال يتعين توضيح الأهمية الوظيفية لهذه الملاحظة.

تطور الكيس خلالمرض تكيس الكلىلا تزال عملية مثيرة للاهتمام. NPHP ، حالة مرضية تتميز بتطور الكيس ، هي أكثر الأمراض الوراثية شيوعًا - تسبب مرض الكلى في نهاية المرحلة عند الأطفال والمراهقين. تم تحديد عشرين جينًا من NPHP حتى الآن .36 من بينها ، يرمز NEK8 عضوًا من عائلة كيناز أبدًا في الانقسام الفتيلي A ، والتي تلعب دورًا في وظيفة الأهداب وتطور دورة الخلية. الفئران jck 32 بشكل ملحوظ ، تبين أن طفرة في نفس مجال البروتين تؤدي إلى NPHP9 في البشر. 38 2 اقترحت دراسات D أن تطور الكيس يختلف اختلافًا كبيرًا بين الأشكال المختلفة لمرض الكلى المتعدد الكيسات. ، في NPHP ، يبدو أن الخراجات مشتقة حصريًا من CD و DCT.31 على الرغم من كونها مفيدة ، لا يمكن لهذه الدراسات الكيميائية المناعية أن تجادل ضد احتمال أن فقدان علامات أنبوبية معينة يفسر هذه الملاحظة بشكل اصطناعي. وبالتالي ، توفر دراستنا ثلاثية الأبعاد أول دليل واضح على أن تطور الكيس هو عملية قد تتضمن فقط مقاطع نيفرون محددة. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من أن NIMA (أبدًا في الجين A الانقسام الفتيلي) - يتم التعبير عن كيناز 8 المتصل (NEK8) في السيتوبلازم لجميع قطاعات النيفرون ، فإن تعبيره في الأهداب يقتصر على DCT و CD. نظرًا لأن هذه الأجزاء فقط هي عرضة لتطوير الأكياس 31 ، يمكننا أن نفترض أن تعطيل الوظيفة الهدبية NEK8 هو الحدث الحاسم لتكوين الكيس. ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أيضًا أن الأكياس المغزلية مستمرة مع الأنابيب الطبيعية غير المتضخمة. تشير حقيقة أن طفرة سلالة جرثومية متنحية تؤدي إلى نمط ظاهري مرضي في مجموعة فرعية فقط من الخلايا إلى أن حدثًا ثانيًا قد يؤدي إلى تطور كيس في هذه الخلايا ، كما هو مقترح في حالة تعدد الكيسات الجسدية السائدة.مرض كلوي.40,41

لاحظنا أيضًا أن تضخم الكيس يكون مهيمنًا بشكل أكبر في JNs منه في SNs ، على الأقل بالنظر إلى الخراجات الموجودة بين PT و CNT. على الدوام ، تم الإبلاغ عن أنه في سياق تصلب الكبيبات ، توجد الآفات الكبيبية بشكل متكرر في JNs منها في SNs.نفرونمعدلات الترشيح الكبيبي وأنشطة النقل / الأنزيمية مسؤولة عن زيادة قابلية JNs للتدهور هي فرضية مثيرة للاهتمام تستحق مزيدًا من البحث.

باختصار ، نصف تقنية جديدة لتصوير الكلى في صورة ثلاثية الأبعاد مع خصوصية جزيئية كافية ودقة لتسجيل التوزيع المكاني والكمي للتركيبات الداخلية المحددة على وجه التحديد (النيفرون ، والأوعية ، والخراجات). نظرًا للراحة والسرعة والقدرة على القياس الكمي المباشر ، نتوقع أن تصبح هذه التقنية أداة قوية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للكلى.

الشكل 6|تكشف إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد (3D) أن الأكياس تتطور فقط في قطاعات نيفرون محددة. (أ) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية مع عرض حجم الكيس من نيفرون كامل (اللوحات اليسرى) من الكبيبات إلى مجرى التجميع في القشرة الاصطناعية الفائقة (الزرقاء) والقشرة الوسطى (الخضراء) والمنطقة المجاورة (حمراء) في الفئران jck. تجزئة النيفرون (اللوحات اليمنى) لثلاثة أنواع مختلفة من النيفرون. شريط ¼ 150 مم. (ب) احتمال تطوير الأكياس في قطاعات النيفرون المختلفة في فئران jck. (واصلت)

الشكل 6|(تتمة) المحور الأفقي هو طول طبيعي من النيفرون يقابل 50 صندوقًا (نبيب قريب [PT] ، فيروزي ؛ حلقة هنلي [HL] ، أبيض ؛ نبيب ملتوي بعيد [DCT] ، وردي ؛ نبيب متصل [CNT] ، أصفر) . (ج) صور إعادة بناء الكيسات ثلاثية الأبعاد التمثيلية مع عرض حجم الكيس للطرف الصاعد لـ HL (الألواح اليسرى) و DCTs (الألواح الوسطى) و CNTs وقنوات التجميع القشرية (CCDs) (الألواح اليمنى) في فوق اصطناعي (الألواح العلوية) ، وسط (الألواح الوسطى) ، و nephrons juxtamedullary (الألواح السفلية) في الفئران jck. شريط ¼ 50 مم.

طُرق

الحيوانات

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" ومن قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة Paris Descartes. تم استخدام الفئران FVB / N البالغة من العمر شهرين (n¼ 20) لإعداد الحالة التجريبية لتطهير الكلى. تم إجراء الدراسة بعد ذلك على 2- فئران ذكور عمرها أسبوع (ن ¼ 4) وزملاء في فضلات التحكم (ن ¼ 3).

تحضير أنسجة الكلى

قبل القتل ، تم تروية الفئران ، عن طريق قسطرة داخل القلب ، مع 25 مل من محلول ملحي مملح (1000 وحدة دولية / لتر) متبوعًا بـ 75 مل من بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). أجريت التجارب تحت تأثير الزيلازين (Rompun 2٪ ، Bayer ، Leverkusen ، ألمانيا ، 6 مجم / جرام من وزن الجسم) والكيتامين (Clorketam 1000 ، Vetoquinol SA ، Lure ، فرنسا ، 120 مجم / جرام من وزن الجسم).

بالنسبة لدراسات المقاصة ، تم تقطيع الكلى بنسبة 4 في المائة بارافورمالدهيد لمدة 4 ساعات وتم دمجها في 4 في المائة من الاغاروز و 1. تم قطع أقسام بسمك {4} مم تحيط بالنقير الكلوي وتخزينها في برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية.أقسام الكلىكانت ملطخة فيمس ثم تم تطهيرها.

للدراسات المناعية على المقاطع الرقيقة ،الكلىتم تخليصها في 4 في المائة من بارافورمالدهيد طوال الليل وتم قطع المقاطع المضمنة بالبارافين و 4- ملم.

تلطيخ

حمض الدوري - شيف تلطيخ. تم تحضين أقسام الكلى 1. 5- مم في حمض شيف دوري نقي أو 1: 100 PBS مخفف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل التطهير.

الكيمياء الهيستولوجية المناعية على أقسام رقيقة مضمنة بالبارافين. تم تسخين أربعة مقاطع ميكرومتر من الكلى المضمنة في البارافين لاسترجاع المستضد واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام محاضرات مقترنة بالفلوروكروم لتتبع الأنابيب (رودامين راصات الفول السوداني [RL -1072-5] ورابطة جرثومة جنين الرودامين [RL {{ 6}}] ، Vector Laboratories ، Burlingame ، CA ، المخفف عند 1: 200) والأجسام المضادة الأولية الخاصة بالقطعة لتصوير مقاطع أنبوبية مميزة (Lotus tetragonolobus lectin [B -1325] ، Vector Laboratories ، مخفف في 1: 100؛ mouse anti-Calbindin D28K [D -4]، Santa Cruz، Heidelberg، Germany، مخفف عند 1: 200؛ goat anti AQP2 [C -17]، Santa Cruz، مخفف عند 1: 200) . في اليوم التالي ، تم تحضين المقاطع بالجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (Alexa Fluor 488 مقترن [S32354] ، Invitrogen ؛ antigoat Alexa Fluor 488 [A -11055] ، Invitrogen ، مضاد للفأر Alexa Fluor 488 [A -21202] ، Invitrogen ، Carlsbad ، CA ؛ تم تخفيفها جميعًا عند 1: 500) قبل تلوينها بـ 40 ، 6- Diamidino -2- phenylindole. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne ، فرنسا) وتم تحضيرها باستخدام برنامج FiJi (الإصدار 1.50).

تلطيخ اللاكتين على أقسام سميكة. تم تحضين أقسام الكلية التي يبلغ سمكها 1 5- مم عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد في تكساس الأحمر أو إيزوثيوسيانات مقترنة بـ flfluorescein: الفول السوداني agglutinin (RL -1072-5) وراصات جرثومة القمح (RL {{6} }) ، المخفف عند 1: 1 0 0 في 0.1 بالمائة أزيد PBS و 0.1 بالمائة Triton-X. تم بعد ذلك غسل المقاطع كل يوم لمدة أسبوعين باستخدام برنامج تلفزيوني قبل المقاصة.

المقاصة البصرية

لتصفية الميزان ، تم تحضين أقسام الكلية 1. 5- ملم في ScaleA2 (4 م يوريا ، 0. 1 بالمائة Triton X -100 ، 1 0 بالمائة glycerol) أو ScaleB4 (8 مليون يوريا ، 0.1 بالمائة Triton X -100) لمدة أسبوعين ، حتى عام واحد ، عند 4 درجات مئوية.

بالنسبة لتصفية BABB ، تم تجفيف أقسام الكلى 1. 5- ملم في عمليات الشطف المتتابعة من الإيثانول عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين العينات بعد ذلك في BABB (Sigma-Aldrich ، Saint Louis ، MO) بنسبة 1: 2 لمدة يومين على الأقل عند 4 درجات مئوية.

الحصول على صورة مجهرية ثنائية الفوتون

تم تصوير الأنسجة باستخدام هلام مائي على مجهر متعدد الفوتونات المقلوب (LaVision BioTec) مزودًا بليزر ماي تاي إتش بي تيتانيوم-سافير (Spectra-Physics ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) (الشكل التكميلي S1A). كان الطول الموجي للإثارة 815 نانومتر عند 8 بالمائة من الطاقة. استخدمنا 2 0 هدف للغطس في الماء (XLUMPLFL2 0 XW ، أوليمبوس [طوكيو ، اليابان] ؛ الفتحة الرقمية ، 0.95 ؛ مسافة العمل ، 2.0 مم). من أجل الحصول على flfluorescence ، استخدمنا كاشفًا غير قابل للتفريغ بنسبة 80 في المائة مع ممر نطاق فيفلتر 593/40 نانومتر.

تتألف الخطوة الأولى من الحصول على صورة فسيفساء ثنائية الأبعاد في المكدس z الأوسط باستخدام معلمات اكتساب دون المستوى الأمثل (400 مم و 400 مم و 1011 1011 بكسل ، مع تداخل بنسبة 10 في المائة ومتوسط ​​خط عند 2) لتوجيه اختيار الفيمس المركزية الأكثر صلة. (الشكل التكميلي S9A). بمجرد تحديد الشبكة xy و z fifields ذات الأهمية ، تم تعديل المعلمات للحصول على صور عالية الجودة. مثل هذا النهج قلل من المنطقة محل الاهتمام إلى 5 12 أخيًا لكل مكدس z. بعد ذلك ، حصلنا على 850 z مكدس / شرائح بصرية (حجم خطوة 1- مم) تحيط بالنقير الكلوي في الجزء الأوسط منقسم الكلى.

خياطة الصور ومعالجتها وتتبعها

تم تجانب كل حزمة وفقًا للطريقة التي طورها Preibisch et al. ، 43 والتي تسمح بخياطة مجموعة كبيرة من الصور باستخدام المكون الإضافي "Grid / Collection خياطة" لبرنامج Fiji (http: // fifiji.sc/Fiji) . نظرًا لأننا لاحظنا تحولًا مهمًا بين صورتين متجاورتين بعد التركيب ، فقد كتبنا برنامج مطابقة مخصصًا في Python. يقوم هذا البرنامج بتعويض تحول الصورة ، مما يسمح لنا بمحاذاة الصور بشكل صحيح (الشكل التكميلي S9B). تم تحليل الصور المصححة بالخياطة باستخدام الإصدار 8.4.2 من Imaris (Bitplane ، زيورخ ، سويسرا). تم تتبع الأنابيب والسفن باستخدام الوضع اليدوي لحزمة التتبع في Imaris وانضم إليها Imaris Xtension الذي طورناه باستخدام MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}} انضم {{12) }} الفتيل _ Tool.zip؟dl¼ 0) (الشكل التكميلي S9C). تم إعادة بناء الكبيبات والأكياس ثلاثية الأبعاد باستخدام الوضع اليدوي للحزمة السطحية لـ Imaris. تم عرض التنظيم المكاني ثلاثي الأبعاد للكبيبات باستخدام الوضع اليدوي لحزمة البقع من Imaris.

قياس الشكل

تم تحديد طول القطعة الأنبوبية ، وطول النيفرون ، والاستقامة باستخدام حزمة التتبع الخيطية من Imaris. وفقًا لبرنامج Imaris ، تم قياس الاستقامة على أنها النسبة بين المسافة بين نقطتين وطول مسار مقطع النيفرون. أعيد بناء 31 PT و 12 نيفرونًا كاملًا وقياسها في 3 فئران من النوع البري ، في حين أعيد بناء 37 PT و 17 نيفرونًا كاملًا وقياسها في 4 فئران jck. كيس و

تم تحديد الأحجام الكبيبية باستخدام "الحزمة السطحية" من Imaris. تم قياس واحد وثلاثين و 34 من الكبيبات في الفئران من النوع البري وفئران jck ، على التوالي. تم قياس أربعة وسبعين كيسًا في المجموع.

تم قياس زوايا "الخروج من المستوى" للانعطافات الأنبوبية (المشار إليها باسم "بيتا") بين المستوى (المحدد بثلاث نقاط متتالية) والاتجاه مع النقطة الرابعة المتتالية التالية في الفضاء (الشكل 5 ب). لتقييم الدلالة الإحصائية للتحيز الملحوظ ، قمنا بمحاكاة توزيع زوايا بيتا مع دوران عشوائي لزوايا بيتا (محاكاة مونت كارلو) في الهياكل التي تتكون من نفس الأجزاء بنفس مجموعة زوايا ألفا.

لحساب احتمال حدوث آفة كيسية على طولنفرونشرائح ، قمنا بتمثيل كل نفرون بمجموعة من النقاط في الفضاء. تم شرح كل نقطة فيما يتعلق بوجود كيس مقابل الهيكل الطبيعي ونوع المقطع. تم حساب الاحتمال عند كل طول معياري (تم تعيينه على 50 حاوية) على أنه النسبة بين عدد النقاط مع التعليق التوضيحي الكيسي والعدد الإجمالي للنقاط في الحاوية.

لحساب متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية ، أخذنا في الاعتبار لكل كبيبة متوسط ​​المسافة البينية الكبيبية المحسوبة على أقرب 5 كبيبات.

تحليلات البيانات والإحصاءات

يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​SEM. تم تقييم الفروق بين المجموعات التجريبية باستخدام تحليل التباين الذي تم اتباعه ، عندما كانت ذات دلالة (P <{0}. 0="" 5)="" ،="" بواسطة="" اختبار="" tukey-kramer.="" عندما="" تمت="" مقارنة="" مجموعتين="" فقط="" ،="" تم="" استخدام="" اختبار="" mann-whitney.="" تم="" إجراء="" التحليلات="" الإحصائية="" باستخدام="" برنامج="" graph="" prism="" (سان="" دييغو="" ،="" كاليفورنيا="" ،="" الإصدار="">

إفشاء

أعلنت جميع المؤلفين لا المصالح المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر مختبر التجارب المتحركة والحيوانية (LEAT) ، وعلم الأنسجة ومنصات التصوير لهيكل اتحاد Recherche Necker للمساعدة التقنية. نشكر بيير إيسنارد وماري كلير جوبلر ونيكولاس كوبرفاسر على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة والبحوث الطبية ، وجامعة باريس ديكارت ، و Assistance Publique - Hôpitaux de Paris ، و Agence Nationale de la Recherche ، و Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I ، Roche Pharma Research and Early Development (Basel ، سويسرا) ، ومعهد Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (باريس ، فرنسا).

الكاتب الاشتراكات

قام كل من TB و NG و MZ بتصميم وتنفيذ التجارب وتحليل البيانات. كما أجرى FB و LT ​​و MGT و SG بعض التجارب وقاموا بتحليل البيانات. أجرى MB و CN تجارب الماوس. ساهم كل من TB و MZ أيضًا في كتابة المخطوطة. نقح GF المخطوطة. قدم كل من FT و MP الإطار المفاهيمي وصمما الدراسة ، وأشرفوا على المشروع ، وكتبوا الورقة.

يمكن cistanche تنغيم الكلى

المواد التكميلية

ملف تكميلي (PDF)

الشكل S1. الإعداد التجريبي وإجراء الاستحواذ ومعالجة الصور.

الشكل S2. حدود إشارة التألق الذاتي في دقة xy و z.

الشكل S3. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين PT و TL على أقسام الكلى المضمنة في البارافين 4- ملم.

الشكل S4. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين TAL و DCT على أقسام الكلى المضمنة بالبارافين 4- مم.

الشكل S5. صورة ثنائية الأبعاد للانتقال بين DCT و CNT على أقسام الكلى المضمنة بالبارافين 4- مم.

الشكل S6. تكشف إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد عن 3 أشكال مختلفة من الأنابيب القريبة.

الشكل S7. تكشف إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد أن طول وتجزئة النيفرون لا يتأثران بالأكياس.

الشكل S8. كثافة الكبيبات في الكلى المتحكمة والكيسي.

الشكل S9. إجراءات الاقتناء ومعالجة الصور بعد المعالجة.

الجدول S1. مقارنة بين طرق المقاصة. ملف تكميلي (افلام)

فيلم S1. يحسن تلطيخ الليكتين بشكل ملحوظ الدقة ونسبة الإشارة إلى الخلفية.

فيلم S2. تتبع مسار الأنبوب.

فيلم S3. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكلية تم تطهيرها تظهر الوصلة بين النبيبات القريبة والطرف الرفيع لحلقة هنلي.

فيلم S4. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكلية تم تطهيرها تظهر الوصلة بين الطرف الصاعد السميك لحلقة هنلي والنبيب الملتوي البعيد.

فيلم S5. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكلية تم تطهيرها تظهر الوصلة بين النبيبات الملتوية البعيدة والنبيب الموصل.

فيلم S6. يختلف شكل وحجم الأنابيب القريبة باختلاف عمقها.

فيلم S7. إعادة بناء النيفرون ثلاثي الأبعاد في السيطرة على الفئران.

فيلم S8. تتبع مسار سفينة من وعاء مقوس إلى وعاء مشع قشري.

فيلم S9. تقوم الأوعية المقوسة بنمذجة شكل الأنابيب القريبة من juxtamedullary.

فيلم S10. تميل النيفرون إلى الاستلقاء في الطائرة.

فيلم S11. تُظهر إعادة بناء النيفرون ثلاثية الأبعاد نمطًا محددًا لتطور الكيس.

فيلم S12. يكشف تجزئة النيفرون ثلاثي الأبعاد أن الأكياس تتطور في قطاعات نيفرون محددة.

فيلم S13. الترتيب المكاني والعلاقة المتبادلة بين النيفرون والأوعية في الكلى متعددة الكيسات

المراجع

1. ريتش AR. ضعف غير موصوف حتى الآن في الكبيبات المجاورة للنخاع في الكلية الشحمية. مستشفى بول جونز هوبكنز. 1957 ؛ 100: 173 - 186.

2. Bankir L، Bouby N، Trinh-Trang-Tan MM. عدم تجانس تشريح النيفرون. ملحق Int الكلى. 1987 ؛ 20: S25 – S39.

3. كريستنسن إي ، جران ب ، كريستوفرسن آي بي وآخرون. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لنفرون الفئران. أنا J Physiol Physiol. 2014 ؛ 306: F664 – F671.

4. Zhai XY ، Birn H ، Jensen KB ، et al. إعادة البناء الرقمية ثلاثية الأبعاد والبنية التحتية الدقيقة للنبيبات القريبة من الماوس. J آم سوك نفرول. 2003 ؛ 14: 611-619.

5. Zhai XY ، Thomsen JS ، Birn H ، وآخرون. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لنفرون الماوس. J آم سوك نفرول. 2006 ؛ 17: 77-88.

6. Puelles VG ، Moeller MJ ، Bertram JF. يمكننا أن نرى بوضوح الآن: المقاصة البصرية والقياسات الشكلية للكلى. العملة الرئيسية Opin Nephrol Hypertens. 2017 ؛ 26: 179-186.

7. Seo J ، Choe M ، Kim SY. تقنيات المقاصة والتوسيم للأنسجة البيولوجية واسعة النطاق. خلايا مول. 2016 ؛ 39: 439-446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen، nebst Anhang: Über Knochenfärbung. لايبزيغ ، ألمانيا: S. Hierzel ؛ 1914.

9. Hama H ، Kurokawa H ، Kawano H ، et al. المقياس: نهج كيميائي للتصوير الفلوري الفلوري وإعادة بناء دماغ الفأر الشفاف. نات نيوروسسي. 2011 ؛ 14: 1481-1488.

10. Ertürk A ، Becker K ، Jährling N ، et al. التصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء التي تم تطهيرها من المذيبات باستخدام 3DISCO. نات بروتوك. 2012 ؛ 7: 1983-1995.

11. Kuwajima T ، Sitko AA ، Bhansali P ، et al. كليرت: طريقة تنظيف خالية من المنظفات والمذيبات للأنسجة العصبية وغير العصبية. تطوير. 2013 ؛ 140: 1364-1368.

12. Ke MT ، Imai T. المقاصة الضوئية لعينات الدماغ باستخدام SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014 ؛ 66: 2.22.1-2.22.19.

13. Chung K، Deisseroth K. CLARITY لرسم خرائط للجهاز العصبي. طرق نات. 2013 ؛ 10: 508-513.

14. Tomer R، Ye L، Hsueh B، Deisseroth K. Advanced CLARITY للتصوير السريع والعالي الدقة للأنسجة السليمة. نات بروتوك. 2014 ؛ 9: 1682–1697.

15. Yang B ، Treweek JB ، Kulkarni RP ، وآخرون. التنميط الظاهري للخلية الواحدة داخل الأنسجة السليمة الشفافة من خلال تطهير الجسم بالكامل. خلية. 2014 ؛ 158: 945-958.

16. Susaki EA ، Tainaka K ، Perrin D ، وآخرون. تصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة باستخدام الكوكتيلات الكيميائية والتحليل الحسابي. خلية. 2014 ؛ 157: 726-739.

17. Alanentalo T ، Asayesh A ، Morrison H ، et al. التصوير الجزيئي المقطعي والقياس الكمي ثلاثي الأبعاد داخل أجهزة الفأر البالغة. طرق نات. 2007 ؛ 4: 31-33.

18. Parra SG ، Chia TH ، Zinter JP ، et al. الفحص المجهري متعدد الفوتونات لأعضاء الفأر التي تم تطهيرها. J بيوميد Opt. 2010 ؛ 15: 036017.

19. Renier N ، Wu Z ، Simon DJ ، وآخرون. iDISCO: طريقة بسيطة وسريعة لعينات الأنسجة الكبيرة المناعية للتصوير الحجمي. خلية. 2014 ؛ 159: 896-910.

20. Lee H و Park JH و Seo I وآخرون. التطبيق المحسن لتقنية إزالة الأنسجة الكهربية ، CLARITY ، للأعضاء الصلبة السليمة بما في ذلك الدماغ والبنكرياس والكبد والكلى والرئة والأمعاء. BMC ديف بيول. 2014 ؛ 14: 1-7.

21. Iversen BM ، Amann K ، Kvam FI ، et al. زيادة ضغط الشعيرات الدموية الكبيبية وحجمها يتوسطان تصلب الكبيبات في قشرة SHR المجاورة للقشرة. أنا J Physiol Physiol. 1998 ؛ 274: F365-F373.

22. Angelotti ML ، Antonelli G ، Conte C ، Romagnani P. تصوير الكلى: من الضوء إلى الفحص المجهري فائق الدقة. زراعة الكلى. 2021 ؛ 36: 19-28.

23. Puelles VG ، van der Wolde JW ، Schulze KE ، et al. التحقق من صحة طريقة ثلاثية الأبعاد لعد وتغيير حجم خلايا القدم في الكبيبات الكاملة. J آم سوك نفرول. 2016 ؛ 27: 3093-3104.

24. Pannabecker TL، Dantzler WH، Layton HE، Layton AT. دور الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد في آلية تركيز البول في النخاع الكلوي الداخلي للجرذ. أنا J Physiol Physiol. 2008 ؛ 295: F1271-F1285.

25. Saritas T ، Puelles VG ، Su XT ، وآخرون. يكشف المقاصة البصرية في الكلى عن إعادة تشكيل الأنابيب بواسطة البوتاسيوم. ممثل الخلية .2018؛ 25: 2668–2675.e3.

26. Schuh CD ، Polesel M ، Platonova E ، وآخرون. يكشف التصوير الهيكلي والوظيفي المشترك للكلية عن اختلافات محورية رئيسية في الالتقام النبيبي القريب. J آم سوك نفرول. 2018 ؛ 29: 2696-2712.

27. براون DA ، هيلدبراندت F. Ciliopathies. كولد سبرينغ هارب بيرسبكت بيول. 2017 ؛ 9: a028191.

28. Bergmann C، Guay-Woodford LM، Harris PC، et al. مرض تكيس الكلى. نات ريف ديس بريم. 2018 ؛ 4:50.

29. ويلسون بد. مرض تكيس الكلى. إن إنجل جي ميد. 2004 ؛ 350: 151–164.

30. Laitinen L ، Virtanen I ، Saxén L. التغييرات في نمط الارتباط بالجليكوزيل أثناء التطور الجنيني لكلية الفأر كما يتضح مع اقتران الليكتين. ي هيستوكيم سيتوتشيم. 1987 ؛ 35: 55-65.

31. Smith LA ، Bukanov NO ، Husson H ، et al. تطور مرض الكلى المتعدد الكيسات في فئران الكلى الكيسية الأحداث: نظرة ثاقبة على التسبب في المرض ، والتشوهات الهدبية ، والسمات المشتركة مع الأمراض التي تصيب الإنسان. J آم سوك نفرول. 2006 ؛ 17: 2821-2831.

32. Liu S، Lu W، Obara T، et al. يتسبب عيب في كيناز عائلة Nek في الإصابة بمرض الكلى الكيسي في الفأر وفي أسماك الزرد. تطوير. 2002 ؛ 129: 5839-5846.

33. Franke M ، Baeßler B ، Vechtel J ، وآخرون. رسم خرائط بالرنين المغناطيسي T2 والتصوير الموزون بالانتشار للكشف المبكر عن تكون المثانة والاستجابة للعلاج في نموذج فأر لمرض الكلى المتعدد الكيسات. الكلى Int. 2017 ؛ 92: 1544-1554. 34. Barry DM، McMillan EA، Kunar B، et al. المحددات الجزيئية لتخصص الأوعية الدموية في الكلية. نات كومون. 2019 ؛ 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N، Jafree DJ، Long DA. التواصل البطاني الظهاري في مرض الكلى المتعدد الكيسات: دور إشارات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية. إشارة الخلية. 2020 ؛ 72: 109624.

36. سريفاستافا إس ، موليناري إي ، رامان إس ، ساير جا. كثير من الجينات - مرض واحد؟ علم الوراثة لسحاف الكلية (NPHP) والاضطرابات المرتبطة بـ NPHP. الجبهة بيدياتر. 2017 ؛ 5:287.

37. Fry AM ، O'Regan L ، Sabir SR ، Bayliss R. تنظيم دورة الخلية بواسطة عائلة NEK من البروتين كينازات. ي خلية العلوم. 2012 ؛ 125: 4423–4433.

38. Otto EA، Trapp ML، Schultheiss UT، et al. تؤثر طفرات NEK8 على التوطين الهدبي والوسطى وقد تسبب الإصابة بسرطان الكلية. J آم سوك نفرول. 2008 ؛ 19: 587-592.

39. Wilson PD. قطبية Apico-basal في ظهارة مرض الكلى المتعدد الكيسات. Biochim Biophys Acta. 2011 ؛ 1812: 1239-1248.

40. Happé H ، Leonhard WN ، van der Wal A ، et al. تؤدي الإصابة الأنبوبية السامة في الكلى من الفئران المحذوفة من Pkd 1- إلى تسريع تكوين المثانة المصحوب بقطبية خلية مستوية غير منظمة ومسارات إشارات Wnt الكنسية. همهمة مول جينيه. 2009 ؛ 18: 2532-2542.

41. Piontek K ، Menezes LF ، Garcia-Gonzalez MA ، et al. يحدد مفتاح التطور الحرج حركية تكوين كيس الكلى بعد فقدان Pkd1. نات ميد. 2007 ؛ 13: 1490-1495.

42. Ikoma M ، Yoshioka T ، Ichikawa I ، Fogo A. آلية القابلية الفريدة للكبيبات القشرية العميقة للكلى الناضجة للتصلب الكبيبي البؤري الشديد. بيدياتر الدقة. 1990 ؛ 28: 270-276.

43. Preibisch S ، Saalfeld S ، Tomancak P. الخياطة المثلى عالميًا لمقتنيات الصور المجهرية ثلاثية الأبعاد المبلطة. المعلوماتية الحيوية. 2009 ؛ 25: 1463-1465.