اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

انقر هنا للحصول على معلومات حول الجزء الثاني (المقدمة والمواد والأساليب) من هذه المقالة.

تنميط البروتينات أحادية الخلية القريبة من الأنبوب القريب وكبيبات الكلى البشرية الطبيعية

تارا ك.سيجدل¹، بول د²، سودشنا روي¹جوليان ليبرتو¹، جوشوا ر. هانسن²، آدم سوينسن²، روي تشاو³يينغ تشو³بريانكا راشمي¹، أندرو شرودر¹إيزابيلا دام¹، الصليب المعقوف صور¹، Jinghui Luo4 ، Yingbao Yang4 ، Wei-Jun Qian²* وميني م.سروال¹* لاتحاد مشروع طب الكلى الدقيق (KPMP)

¹قسم زراعة الأعضاء المتعددة ، قسم الجراحة ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة

²مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، قسم العلوم البيولوجية ، ريتشلاند ، واشنطن ، الولايات المتحدة

³مختبر العلوم الجزيئية البيئية ، مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، ريتشلاند ، واشنطن ، الولايات المتحدة

⁴قسم علم الأمراض ، جامعة ميشيغان ، آن أربور ، ميشيغان ، الولايات المتحدة

الكلمات الدالة:الكبيبة، مطياف الكتلة ، تحليل الخلية الواحدة ، البروتينات ،الكلى

يمكن للتقييمات الجزيئية على مستوى الخلية الواحدة تسريع البحث البيولوجي من خلال توفير تقييمات مفصلة للتنظيم الخلوي وعدم تجانس الأنسجة في كل من المرض والصحة. الانسانالكلىلديها حالات معقدة متعددة الخلايا ذات وظائف مختلفة ، يمكن الآن تسخير الكثير منها بالكامل مع التطورات التكنولوجية الحديثة في بروتينات الأنسجة على مستوى قريب من خلية واحدة. نناقش الخطوات التأسيسية في التطبيق الأول لطريقة البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) لتحليل الأقسام الفرعية للإنسان العادي.الكلى، كجزء من مشروع الطب الدقيق للكلى (KPMP). باستخدام ~ 30-40 ليزر لالتقاط خلايا الكلى المجهرية ، حددنا أكثر من 2500 بروتين بشري ، مع تحديدأنبوبي الداني(PT؛ n=25 من البروتينات) ومناطق الكبيبات (بروتينات Glom؛ n=67) فيالكلىووظائفها الأيضية الفريدة. توفر هذه الدراسة التجريبية خارطة طريق لتطبيق سير عمل البروتينات شبه الفردية للخلية لتحليل المقصورات الدقيقة الكلوية الأخرى ، على نطاق أوسع ، لكشف اضطرابات الوظيفة الخلوية الكلوية في الكلى الطبيعية وكذلك المسببات المختلفة الحادة والمزمنةمرض كلوي.

يمكن أن يحسن cistanche وظائف الكلى

مقدمة

يمكن أن تكشف التطورات الحديثة في التنميط الجزيئي ، وتحديداً التحليل النسخي على مستوى الخلية الواحدة ، عن مجموعات الخلايا النادرة داخل الأنسجة السريرية غير المتجانسة ، مما يساهم في فهمنا لبيولوجيا الكلى ، وعملياتها الجزيئية (1-7). هناك حاجة غير ملباة لتطوير طرق يمكن أن توفر معلومات بيولوجية شاملة على مستويات RNA و DNA وتسمح أيضًا بتحليل الأنسجة البروتينية أحادية الخلية.

يمكن للتقنيات البروتينية ، على عكس علم الجينوم ، أن توفر معلومات وظيفية عن الحالات الخلوية والشبكات التنظيمية (2). يتمثل التحدي التكنولوجي للبروتيوميات القائمة على التحليل الطيفي الشامل (MS) في تقييد مادة البداية. على عكس علم النسخ ، لا تسمح البروتينات بالتضخيم الجزيئي. أدى هذا الواقع إلى جهود جوهرية لتعزيز الحساسية التحليلية للبروتينات القائمة على MS ، بما في ذلك تصغير التكنولوجيا وكفاءات أعلى في مصدر التأين بالرش الكهربائي (8 ، 9) ، بحيث أصبحت الحساسية التحليلية الآن كافية للكشف عن البروتينات في حيوان ثديي واحد الخلايا. على الرغم من وجود حساسية تحليلية عالية ، إلا أن التطبيقات البروتينية لأحجام عينات صغيرة قد أدخلت تحديات إضافية ، مثل الامتزاز غير المحدد للبروتينات والببتيدات على أسطح أنابيب التفاعل ، وحركية الهضم غير الفعالة ، والحاجة إلى التنظيف ، وتحديات التوصيل. أبلغت مجموعتنا مؤخرًا عن طريقة البروتينات شبه أحادية الخلية (nscProteomics) في خلايا هيلا ، والتي توفر تقنية مبتكرة وحساسة للغاية للقياسات البروتينية للعينات التي تحتوي على كميات أقل من نانوجرام من البروتين من عدد صغير من الخلايا (10). تتطلب هذه الطريقة معدات معالجة عينات مخصصة للغاية ويصعب نقلها إلى مختبرات أبحاث أخرى في حالتها الحالية من التطور. معالجة الإنسانالكلىتتطلب الأنسجة من خلال خط الأنابيب هذا اهتمامًا وثيقًا بتطوير البروتوكول من أجل تحسين الحفاظ على الأنسجة والتقاط الخلايا.

في هذه الدراسة ، ركزنا على توفير خارطة طريق للقياس الناجح للاستجواب البروتيني للأجزاء الفرعية المختلفة منالكلى، على مستوى الخلية المفردة تقريبًا ، مع النواتج التالية: (1) تقييم الجمع الأمثل لأنسجة الكلى وتخزينها لـ nscProteomics ؛ (2) تحديد المعيار المرجعي المناسب لـ nscProteomics ؛ '3` تعظيم سمك أنسجة الكلى من أجل التشريح الدقيق لالتقاط الليزر (LCM) ؛ (4) تعظيم الاستفادة من معلمات LCM ؛ (v) وصف طريقة nscProteomics باستخدام طريقة POTS الدقيقة المؤتمتة بالكامل على أساس LC-MS (μPOTS ؛ المعالجة في وعاء واحد لعينات التتبع) (11) ؛ (6) تحليلات البيانات لـ nscProteomics.

لتحقيق المهام المذكورة أعلاه ، قمنا بمعالجة 11 شخصًا فريدًاالكلىالخزعات والبروتوكولات والمنهجيات المطورة لجمع ومعالجة واستجواب التعبير البروتيني للإنسانالكلىعينات بواسطة μPOTS. عندما نقترن بـ LC-MS شديد الحساسية ، فإننا نعرض طريقة μPOTS مؤتمتة بالكامل تتيح إمكانية التكاثر وتوفر قياسات بروتينية كمية لحوالي 3 ، 000 بروتينات من 10 إلى 100 خلية كلى مقطوعة بالليزر (LCM) ، تم تحقيق مستوى التغطية فقط في السابق لآلاف الخلايا (12-17). ستساعد هذه الدراسة في التوصيف الجزيئي للتغاير الخلوي للأنسجة وعلم الأمراض في خزعات الكلى من المرضى الذين يعانون من أسباب مختلفة لأمراض الكلى الحادة والمزمنة. هذه التكنولوجيا الفريدة لديها القدرة على كشف عدم التجانس البروتيني وعلامات البروتين الفريدة في مختلفالكلىأنواع الأمراض الفرعية والهياكل الفرعية التي ترتبط بإحداث المرض ، والتشخيص ، وتصنيف المخاطر. تم تلخيص الدراسة في الشكل 1.

الشكل 1. تم تحسين سير العمل القريب من البروتينات أحادية الخلية (nscProteomics) لمعالجة الإنسانالكلىمناديل. يتضمن سير العمل تحديد الأمثلالكلىجمع الأنسجة وتخزينها ، وضوابط الجودة لالتقاط التشريح الدقيق بالليزر لإنشاء طريقة nscProteomics لخلايا الكلى.

الإجراءات التجريبية

تصميم الدراسة

التمثيل التخطيطي للدراسات البروتينية التي أجريت على 11 طبيعيًا بشريًا فريدًاالكلىهو مبين في الشكل 2 أ. تم إجراء ما مجموعه 28 تشغيلًا لقياس الطيف الكتلي (MS) للكتلة السائبة والليزر التشريح الدقيق (LCM) nsc البروتيوميات على الكبيبات المزدوجة (Glom) والأقسام الأنبوبية الملتفة القريبة (PT). مناديل من الأولينالكلىتم الحفاظ عليها على أنها FFPE وفي وسط مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). تمت معالجة مشاكل أنسجة الكلى من 9 كلى أخرى فقط في أكتوبر (الشكل 2 أ).

الشكل 2. (أ) ملخص لعينات الدراسة والمقايسات. (ب) مؤامرة مراقبة الجودة لاستنساخ العملية باستخدام أنسجة أكتوبر. تم رسم الاختلافات في العد الطيفي بين البروتينات لمدة 2 عمليات منفصلة باستخدام أنسجة OCT مقابل متوسط ​​عدد طيف البروتين لـ 1،257 بروتينًا. في الحبكة ، يمثل الخط الأزرق فرقًا متوسطًا ؛ الخطوط الحمراء والخضراء تصور 2 SD و 3 SD على التوالي. 97.96 في المائة من البروتينات تقع ضمن حد التكاثر المحسوب البالغ 13.52 مما يشير إلى درجة عالية من قابلية التكاثر. يُرى أيضًا أن التباين بين التشغيل للعملية التي تتضمن أنسجة OCT أقل من تلك الخاصة بالعملية التي تتضمن أنسجة FFPE (حد التكاثر المحسوب: 24.43). (ج) مقارنة توزيعات العد الطيفي لـ 374 بروتينًا شائعًا في OCT و FFPE. يُظهر عدد أكبر من البروتينات المأخوذة من أنسجة OCT عددًا طيفيًا عاليًا بينما يُلاحظ وجود نسبة أعلى من التعداد الطيفي المنخفض للبروتينات المأخوذة من أنسجة FFPE. (د) مقارنة توزيعات العد الطيفي لـ 76 بروتينًا فريدًا في FFPE و 244 بروتينًا فريدًا في OCT. يُلاحظ الغلبة الأعلى للبروتينات ذات العد الطيفي المنخفض في أنسجة OCT. قد يشير هذا إلى أن تقنية نسيج OCT أفضل للكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة في السيناريو الحالي. كان معامل الارتباط بين البروتينات التي تم تحديدها من الأنسجة المجمدة 2 أكتوبر 0. 96 (P <0.>

الحصول على عينة نسيج الكلى

بشرأنسجة الكلىتم جمعها من إجمالي 11 عملية استئصال كلية جزئية تم تحديدها ، تم الحصول عليها من جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو (UCSF) وجامعة ميشيغان (UM) ، مع IRB المعتمدة ، كجزء من دراسة جدوى تقنية رائدة في NIH Kidney Precision Medicine مشروع (KPMP). فقط المنطقة الصحية منالكلىكما هو محدد من قبل أخصائي علم الأمراض تم استخدامه لهذا الغرض. تم إخفاء هوية العينات مع التحذير الوحيد هو أن الأنسجة تم جمعها من البالغين. لتقييم بروتوكول جمع العينات الأمثل لهذه التقنية ، في البداية ، تم تقسيم ما يقرب من 1 0 0 ملغ من الأنسجة من كليتين بالتساوي وإما تم تحضيرهما كأقسام نسيجية مضمنة بالفورمالين (FFPE) أو تم تجميدها في مجمع Tissue-Plus ™ OCT (Fisher Scientific). تم قطع مقطع واحد بسماكة 5 ميكرومتر وثلاثة أقسام متتالية بسماكة 10 ميكرون من كل كتلة OCT مع مشراح مبرد وتثبيته على شرائح غشاء بولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) 1.0 (زايس) من أجل الكبيبات والنبيبات الدانيةتشريح. كان القسم بسمك 5 ميكرون ملطخًا بـ H&E لتصور الهياكل النسيجية الرئيسية. تركت المقاطع المتبقية بسمك 10 ميكرون غير ملوثة. تم تخزين جميع الشرائح عند -80 درجة حتى التشريح.

علاج لعلاج ضعف الكلى

تقييم تأثير شحن الأنسجة ومعالجتها على المخرجات البروتينية

لتقييم تأثير التأخير على التحليل البروتيني للأنسجة المجمدة OCT ،الكلىtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 ح السفر بعيدا ، ومعالجتها في المركز الثاني ، والعكس بالعكس. تم إجراء البروتينات السائبة على 2 فريدة من نوعهاالكلى(الكلى رقم 3 ، رقم 4) ، تم شراؤها في جامعة ميشيغان ، وشحنها إلى موقعين مختلفين (جامعة ولاية أوهايو و UCSF) لتحليل MS ، باستخدام نفس البروتوكول ومعلمات MS في كلا الموقعين. ثم تمت مقارنة نتائج تشغيل MS بين الموقعين.

استخراج البروتين والترسيب

تم إجراء هذا على كل من طرق OCT و FFPE الإعدادية للأنسجة لاختيار الطريقة المثلى لبروتينات الأنسجة. تم تقسيم أنسجة OCT إلى أقسام بسمك 10 ميكرومتر باستخدام cryomicrotome. لتحديد الحد الأدنى من الأنسجة اللازمة لاستخراج البروتين لمرض التصلب العصبي المتعدد ، تم قطع ثلاثة تجعيد الشعر (قسم يوضع في أنبوب إيبندورف بدلاً من نشره على الشريحة) ، و 5 تجعيد من الأنسجة المجمدة ، وتم إذابتها ، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة تحتوي على حبة من الفولاذ المقاوم للصدأ 5 مم (Qiagen) ، تتعرض لمخزن تحلل خلايا الثدييات (بما في ذلك محلول Benzonase® Nuclease و Protease Inhibitor Solution ؛ Qiagen) ، ومتجانس في TissueLyser LT (Qiagen) عند 50 دورة / ثانية لمدة 3 دقائق. تم تحديد كمية تركيز البروتين (مقايسة برادفورد ؛ الحرارية العلمية) وتخزينها عند 20 درجة حتى الاستخدام. الأنسجة المخزنة ل<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

الهضم التربسين

تم تعريض ما يقرب من 15 0 ميكروغرام من البروتين الكلي (حوالي 15 بالمائة من المدخلات المتاحة) لعوامل الاختزال (200 ملي مولار DTT و 100 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك) وكواشف ألكلة (200 ملي مولار أيودواسيتاميد و 100 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك) ثم تم تخفيفه بالماء الخالي من RNAse / DNAse لتقليل تركيز اليوريا إلى 0.6 M. تمت إضافة أربعة ميكروغرام من التربسين الخنازير (Sigma) وهضم العينة عند 37 درجة. تم تحديد كمية تركيز البروتين (مقايسة برادفورد ؛ ThermoScientific) واستخدم 10 ميكروغرام من البروتين لمرض التصلب العصبي المتعدد.

MS for Bulk Proteomics لتقييم الطريقة المثلى لمعالجة أنسجة الكلى

تم تحمض خليط الببتيد التجريبي بحمض الفورميك ، وتنظيفه باستخدام أعمدة C18 Monospin ، وتحليله على Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). تم إجراء MS / MS باستخدام تفكك مصيدة الكربون عالي الطاقة (HCD). تم تحليل أطياف الكتلة باستخدام Byonic v2.14.27 (مقاييس البروتين) مما يسمح بتحمل كتلة 12 جزء في المليون. تم السماح بالتعديلات المتغيرة اللاحقة للترجمة ، بما في ذلك الأكسدة والمثيلة والكرباميل والفسفرة. اقتصرت البروتينات على أولئك الذين يسجلون نتائج أفضل من معدل الاكتشاف الخاطئ 1٪ (FDR). تم إجراء مقارنات بين وفرة البروتين وبيانات مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد الطريقة المثلى لالكلىجمع الأنسجة بين FFPE و OCT.

الالتقاط الدقيق بالليزر

تم وضع أقسام سميكة غير ملوثة 5 و 10 و 20 ميكرومتر مثبتة على شرائح PET على مرحلة نظام تسليخ مجهري بالليزر Zeiss PALM MicroBeam (زايس) لاختبار سمك القطع الأمثل. الكبيبي والنبيبات الدانيةتم اختيار المناطق باستخدام أداة مرفوعة وأجريت التشريح في الهدف 10x. تم التقاط أقسام بمساحة 4580 ميكرومتر 2 وسمك 10 ميكرومتر ، والتي تمثل حوالي 40 خلية كبيبية بناءً على الصيغة المنشورة مسبقًا لتقدير الخلايا الكبيبية في شخص بالغ سليمالكلى(18). بالنسبة إلىأنبوبي الدانيمن الخلايا ، التقطنا ما يقرب من 2900 ميكرومتر 2 منأنبوبي الدانيالخلايا ، والتي تمثل 36 خلية تقريبًا. تم تقطيع المقاطع المقطوعة إلى غطاء لاصق غير شفاف 200 ميكرولتر (زايس) (LPC Energy ، 66 ؛ LPC Focus ، 79) وتخزينها عند درجة -80 درجة.

البروتينات شبه البروتينية أحادية الخلية (nscProteomics)

لإذابة البروتينات التي تم جمعها في أغطية الالتقاط باستخدام LCM ، تمت إضافة قطرة 1 0 ميكرولتر بنسبة 0.1 بالمائة DDM 50 ملي مولار تريس pH 8 مباشرة إلى الغطاء. تم تحضين العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة في خلاط حراري إيبندورف ثيرموتوب لتقليل التبخر ، متبوعًا بالطرد المركزي عند 2 ، 000 × جم لمدة دقيقة واحدة لنقل المحلول إلى القارورة. تم تقليل البروتينات بـ 5 ملي ديثيوثريتول وحضنت عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. تم إجراء الألكلة عند 10 ملي مولار من أيودواسيتاميد مع حضانة 45 دقيقة في الظلام عند 25 درجة. بعد ذلك ، تمت إضافة قسامة 10 نانوغرام من Ls-C متبوعة بحضانة لمدة 3 ساعات عند 25 درجة. ثم تمت إضافة قسامة 10 نانوغرام من التربسين متبوعة بالهضم طوال الليل عند 25 درجة. تم خلط الببتيدات المهضومة بقسامة 15 ميكرولتر من 18 ميكرولتر ماء.

منصة LC-MS للعينات فائقة الصغر

تم فصل عينات الببتيد (25 ميكرولتر) باستخدام عمود 60 سم ، بقطر داخلي 50 ميكرومتر وباعث متكامل (هدف جديد). تم تعبئة الأعمدة في المنزل بوسائط Waters BEH بقطر 1.7 ميكرون. تم إنتاج تدرج لوني 100- دقيقة باستخدام مضخة نانو Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). تم ربط هذا النظام بمطياف الكتلة QExactive Plus (علمي حراري). تم جمع أطياف الكتلة من 300 إلى 1800 م / ض ، باستخدام أفضل 12 طريقة اكتساب تعتمد على البيانات. تم جمع أطياف MS1 بدقة جماعية 35K و MS2 مع 17.5K. تم استخدام 100 مللي ثانية كحد أقصى من تكنولوجيا المعلومات لزيادة التعريفات من الأيونات منخفضة الوفرة.

استخراج البيانات البروتينية

تمت معالجة جميع الملفات الأولية باستخدام MaxQuant (الإصدار 1.5.3.30) لاكتشاف الميزات والبحث في قاعدة البيانات وتقدير كمية البروتين / الببتيد (19) الإعدادات التالية الموضحة سابقًا (10). تم البحث عن أطياف الكتلة الترادفية في قاعدة البيانات البشرية UniProtKB / Swiss-Prot (تم تنزيلها في 29 ديسمبر 2018 وتحتوي على 20417 مدخلات تمت مراجعتها). تم إيداع بيانات بروتينات MS الخاصة بـ nscProteomics في اتحاد ProteomeXchange Consortium عبر مستودع شريك PRIDE (20) مع معرف مجموعة البيانات PXD015058 و 10.6019 / PXD015058.

تحليل البيانات

تم الحصول على بيانات MS من عمليات التشغيل التي أجريت في PNNL (nscProteomics) وجامعة ستانفورد (البروتينات السائبة). للبروتينات السائبة. تم استخدام الأساليب الإحصائية التالية لاختيار الأمثلالكلىطريقة جمع الأنسجة ، إما مجمدة في OCT أو معالجتها على أنها FFPE ، وفقًا لتقييم البروتينات السائبة للأنسجة الكمية ، (1) تم حساب عائد البروتين / ملغ من أنسجة الإدخال المكافئة ؛ (2) تم اختبار قابلية استنساخ MS على إخراج MS من أقسام FFPE و OCT من كل كليتين ، أعدهما نفس الفرد باستخدام نفس البروتوكول ، وتم تحليله على نفس أداة MS باستخدام بروتوكول محدد ، على بعد بضعة أيام (21). تم استخدام حد استنساخ (22) لتوفير حد تقريبي لاختلافات القياس بين عمليات التشغيل المتتالية لعملية واحدة بالإضافة إلى تقدير الدقة للمقارنة بين العمليات. تم حساب معامل الارتباط الذي يوفر درجة التوافق بين الأشواط المتتالية (باستخدام نفس النسيج) ؛ (3) تم حساب وفرة البروتين وتوزيع حجم شظايا الببتيد لتقييم الاختلافات الناشئة عن تدهور البروتين ، والربط المتشابك بسبب الفورمالين ، وما إلى ذلك.الكلىالمرجع و (5) حساب التحيز. يستخدم التحليل الكمي الصارم وتحديد البروتينات الفريدة البيانات فقط مع البروتينات ذات التعداد الطيفي أكبر من أو يساوي 5 (23). تم استخدام اختبار فيشر الدقيق لتقييم إثراء البروتينات الشائعة والفريدة المعينة بين كليتين بشريتين طبيعيتين (# 1 و # 2). بناءً على التحليل أعلاه (انظر النتائج) ، تم اختيار الأنسجة المجمدة OCT كطريقة جمع لجميع التحليلات اللاحقة.

كانت الخطوة التالية من تركيز تحليل البيانات هي تحديد مجموعات البروتين المخصبة أو الخاصة بها أو المحددة لها ~ 10-100 خلية تم الحصول عليها من كل من خليتين محددتين.الكلىالمقصورات الفرعية — مناطق Glom و PT ، تم الحصول عليها من نفس الأجزاءالكلى، بكميات كبيرة و LCM مجمدة لشهر أكتوبرأنسجة الكلى(ن=9 ؛ الكلى # 3-11) وتديرها nscProteomics.

تم اعتماد {0} خطوة ترشيح شبه متحفظ للتعامل مع مشكلات البيانات المفقودة / غير المكتملة ، وتم استخدام اختبار G (24) لتحديد ما إذا كانت البيانات مفقودة في عشوائي (MAR) أو مفقود ليس في العشوائية (MNAR). تم إجراء تقييم موثوقية البيانات الإضافية عن طريق الاختيار الصارم للبروتينات التي لوحظت في أكبر من أو يساوي 50 في المائة من جميع العينات. تم استخدام اختبار T لتحديد البروتينات المخصبة بشكل كبير في glomming أو PT وتم تطبيق تصحيح الاختبار المتعدد (Benjamini-Hochberg FDR) مع عتبة أهمية قدرها 0.1. لأغراض التحليل ، تم الحصول على بيانات الكثافة النسبية MS (تم تحويل السجل 2) من Glom و PT والكسور السائبة منالكلىتم اعتبار أنه تم إقرانه. حددنا البروتينات المخصبة في Glom (بمستويات منخفضة في PT / بكميات كبيرة) ، وفريدة من نوعها لـ Glom (غائبة في PT) وكذلك البروتينات المخصبة في PT (بمستويات منخفضة في Glom / بكميات كبيرة) وفريدة من نوعها لـ PT (غائبة في Glom) . تم إجراء تحليل الإثراء فقط على البيانات دون فقدان القيم في كل مجموعة لزيادة الثقة. تم استخدام الارتباط بين قيم الوفرة للبروتينات الشائعة لتقييم درجة التوافق بين بروتينات الحيز الفرعي المخصب بين عمليات التشغيل المنفصلة لنفس التجربة. لقد أجرينا أيضًا تحققًا متقاطعًا من البروتينات المخصبة بشكل كبير في كل حجرة عن طريق تحليل هذه المقارنات من مجموعات عينات فريدة بين تشغيلين مختلفين ، التشغيل 1 والتشغيل 2. تم إجراء التحقق البيولوجي لمجموعات البروتينات الفرعية المخصبة (Glom و PT) بواسطة الاستفسار عما إذا كان بالإمكان ترجمة البروتينات المخصبة المعروفة في المقصورة الفرعية إلى مناطقها المحددة في البيانات العامة من أطلس البروتين البشري (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche لأعراض الفشل الكلوي

Cross-Omics مقارنة / تكامل البيانات

لتقييم توافق تعبير البروتين على مستوى الحمض النووي الريبي ، تم استخدام البيانات التي تم إنشاؤها من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA Seq) التي تم إجراؤها على 10 عمليات استئصال كلية أصلية ، 9 منها كانت متداخلة معالكلىالمستخدمة في nscProteomics. لهذا الغرض ، تم استخدام منصة 10x Genomics Chromium مع كيمياء v3 باستخدام الطريقة المُحسّنة في مختبر Sarwal كموقع استجواب الأنسجة (TIS) لاتحاد KPMP (مخطوطة توضح بالتفصيل الطريقة والنتائج قيد الإعداد). لهذا التحليل عبر omics ، استخدمنا بيانات النسخ من 45411الكلىتم حل الخلايا في تسعة أنواع رئيسية من الخلايا: خلايا بودوسيت ، وخلايا ميسانجيل ، وبطانة كبيبية ، وسدى / خلالي ، وخلايا مناعية ،النبيبات الدانية، الطرف الصاعد السميك لحلقة هنلي ، والنبيبات البعيدة / المتصلة ، وقناة التجميع. تم تحليل البيانات أحادية الخلية باستخدام الإصدار 2.3.4 من حزمة Seurat R. المزيد من التحليل المتعمق لهذه البيانات قيد التطوير (26).

من: "التنميط شبه البروتينات أحادية الخلية منأنبوبي الدانيوالكبيبةالإنسان العاديالكلىبقلم تارا ك. سيجديل 1 ، بول دي بيهوفسكي 2 ، سودشنا روي 1 ، جوليان ليبرتو 1 ، جوشوا آر هانسن 2 ، آدم سي سوينسين 2 ، روي جاو 3 ، ينج زو 3 ، بريانكا راشمي 1 ، أندرو شرودر 1 ، إيزابيلا دام 1 ، سواستيكا سور 1 ، جينغوي لو 4 Yang4 و Wei-Jun Qian2 * و Minnie M. Sarwal1 * لـالكلىاتحاد مشروع الطب الدقيق (KPMP)

--- مقدمة مقالة البحث الأصلي. ميد. ، 17 سبتمبر 2020 |