مرض تكيس الكلى

ali.ma@wecistanche.com

الجزء: عضيات الكلى المتولدة من خلايا أسلاف الكريات الحمر للمرضى المصابين بداء الكلى المتعدد الكيسات الصبغي الجسدي السائد

روبرتا فاسيوليو وفرناندو هنريكي لوجوديس وآخرون.

خلفية:الكلىتم الحصول على العضيات على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المحفزة المحفزة والمتوفرة تجاريًا (iPSCs) ؛ ومع ذلك ، فقد كان تحديًا كبيرًا لإنتاج نماذج عضوية كلوية بكفاءة من المرضى الذين يعانون من تعدد الكيسات الصبغي الجسدي السائدالكلىالمرض (ADPKD) الذي يلخص كل من التطور الجنيني وآليات تكوين المثانة.

انقر لمعرفة الآثار الجانبية والاستفادة من الكلى

الطريقة: أسلاف الكريات الحمر في الدم من اثنين من ADPKD (تعدد الكيسات الصبغي الجسدي السائدالكلىتم استخدام المرضى ومتبرع سليم واحد (HC) كعنصر تحكم مقارن لتطبيع العديد من الخطوات الفنية لإعادة برمجة EPs وتوليد العضويات. تم تفريقها إلى عضيات أنبوبية كلوية ثم تم تحفيزها بواسطة فورسكولين للحث على تكوين الأكياس.

النتائج: iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) المستمدة من EPs أظهرت جميع خصائص تعدد القدرات وتمكنت من التمايز إلى الطبقات الجرثومية الثلاث ، تم إنشاء عضويات أنبوبية ثلاثية الأبعاد من خلايا مفردة بعد 28 يومًا في ماتريجيل. HC و ADPKD (تكيس وراثي سائدالكلىالمرض) لم تشكل الكائنات العضوية الخراجات تلقائيًا ، ولكن عند تحفيز فورسكولين ، لوحظت هياكل تشبه الأكياس في ADPKD (تعدد الكيسات الجسدية السائدةالكلىالمرض) العضيات ولكن ليس في العضيات المشتقة من HC.

الخلاصة: أظهرت نتائج هذه الدراسة أنالكلىتم إنشاء الكائنات العضوية بنجاح من خلايا الدم EP لـ ADPKD (تعدد الكيسات الجسدية السائدةالكلىالمرض) ومتبرع تحكم سليم. يجب أن يساهم هذا النهج كأداة قوية للجنينالكلىنموذج التنمية ، القادر على تلخيص الآليات المرضية المبكرة جدًا التي ينطوي عليها تكوين الخلايا.

انقر هنا للمشاركةⅠ

مناقشة

في هذه الدراسة ، وصفنا بالتفصيل إجراءً لتوليد عضيات الكلى من خلايا جذعية متعددة القدرات (مستحثة محفزة) تم الحصول عليها من خلايا سلف الكريات الحمر في الدم لمرضى ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد وراثيًا). تمت إعادة برمجة العديد من أنواع الخلايا الجسدية بنجاح في خلايا iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) ، بما في ذلك خلايا الدم [Z]. هنا ، اخترنا استخدام أسلاف الكريات الحمر في الدم كنوع خلية البداية لعدد من الأسباب ، مثل سلامة الجينوم ، والذاكرة اللاجينية ، وإعادة البرمجة الفعالة [11 ، 17 ، 18]. كانت الكفاءة التي تم من خلالها تحويل أسلاف الكريات الحمر إلى iPSCs أفضل بمقدار أمرين من حيث الحجم (7 بالمائة -28 بالمائة) من كفاءة أنواع خلايا الدم المتمايزة (0. 0 2 بالمائة -0. 60 بالمائة) أو أرومات ليفية (0.74 بالمائة) [Z]. على الرغم من قلة وفرة هذه الخلايا في الدم المحيطي ، يمكن بسهولة عزلها وتوسيعها في المختبر لإنتاج عدد كافٍ لإعادة البرمجة. أحد أهم التحديات في إنشاء خلايا iPSCs المناسبة هو النمط الوراثي والتنوع الظاهري [6] ، ولكن هناك بعض الاستراتيجيات التقنية المقترحة للتحايل على هذا التباين أو تقليله. في التجارب الحالية ، استخدمنا نظام episomal غير متكامل لإعادة البرمجة لا يتطلب تكامل الجينوم من أجل التعبير عن جينات إعادة البرمجة [10] ، مما يسمح باستنباط أقل ويجعل خلايا أكثر استقرارًا وراثيًا [19 ، 20]. علاوة على ذلك ، تم اشتقاق جميع العينات من نفس المصدر ، مما يساعد على تقليل التباين اللاجيني [12] بافتراض أن تمايز خلية البداية قد يؤثر على كفاءة النتائج النهائية. تمت مقارنة تحليل علامات تعدد القدرات وقدرة iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) على التمايز إلى الطبقات الجرثومية الثلاث جنبًا إلى جنب ، وتمت مقارنتها أيضًا بخط الخلية الجنينية H9 ، والذي تم استخدامه كعنصر تحكم إيجابي. . أظهرت جميع هذه المقارنات عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مرضى ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات الوراثي السائد) وخلايا HCs وخلايا H9.

تم تطوير العديد من البروتوكولات للحث على التمايز بين iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) في عضويات الكلى [13 ، 21]. استنادًا إلى البروتوكولات التي وصفها Cruz et al. [6] ، حصلنا على هياكل ذات خصائص الأنابيب القريبة ، بما في ذلك التعبير عن NHE3 و AOP1. بالإضافة إلى ذلك ، أعربت العضويات عن NPHS2 ، مما يشير إلى وجود خلايا تشبه الخلايا البودوسية.

على العكس من ذلك ، لم يتم التعبير عن AQP2 في هذه العضيات الأنبوبية. تتوافق هذه النتيجة مع الدراسات السابقة التي تشير إلى العديد من القيود في تطوير الهياكل المشتقة من برعم الحالب (UB) في المختبر ، مع تطوير UB الذي يتطلب بروتوكولات محددة ، نظرًا لأن نافذة التوقيت لإضافة المحث المحدد محدودة للغاية [ 6 ، 22 ، 23].

في عملية توليد عضيات الكلى من iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) ، يتم إعادة تلخيص كل عملية التطور الجنيني الكلوي في المختبر ، والتي تتضمن في البداية تكوين الأجسام الشبه الكروية المجوفة من خلايا مفردة [14]. في الواقع ، وجدنا أن iPSCss غير المتمايزة (الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات) من كل من مرضى ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد) والسيطرة الصحية شكلت هياكل كروية تشبه الأديم الخارجي والتي كانت متشابهة شكليًا. على الرغم من عدم إجراء تسلسل الحمض النووي لجينات PKD1 و PKD2 في هذه الدراسة ، فإن النتائج الحالية تشير إلى أن نوع الطفرة التي يحملها المرضى لم يكن له أي تأثير على التشكل النموذجي للأديم الظاهر. لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم التعبير عن الجزيئات المحورية المشاركة في هذه المرحلة من التطور الجنيني بشكل صحيح.

وفقًا للبروتوكول الذي وضعه فريدمان وآخرون. [14] ، لاحظنا أن الأجسام الشبه الكروية قد تمايزت إلى عضيات أنبوبية بعد 26 يومًا من تحريض التمايز ، وكان التوقيت مشابهًا لكل من مرضى ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد وراثيًا) ومرضى HC (الشكل). ومع ذلك ، لاحظنا بعض التباين فيما يتعلق بالجدول الزمني للتعبير ومستويات علامات التمايز. من ناحية أخرى ، كانت مورفولوجيا الهياكل الأنبوبية متشابهة وقابلة للمقارنة بين عينات من مرضى ADPKD و HC. في المقابل ، باستخدام iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) الناشئة عن الخزعات الكلوية لمرضى ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات الوراثي السائد) ، وجدت مجموعة Cruz et al تباينًا أعلى في قدرة هذه الخلايا على تكوين أشباه عضويات [6]. بالإضافة إلى التنوع الهائل للطفرات المتأصلة في هذا المرض ، يمكن أيضًا تفسير هذه الاختلافات في كفاءة الحصول على العضيات من خلال أنواع الخلايا غير المتجانسة الموجودة في عينات الخزعة ، على عكس أسلاف الكريات الحمر ، والتي تشكل مجموعة خلايا أكثر تجانسًا. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من التباين والاختلاف في كفاءة استنساخ iPSC المختلفة لتكوين أشباه عضوية في الكلى ، فإن الحصول على الأخير من ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد) قد يشكل نموذجًا فريدًا لدراسة الأشكال المتعددة من المظاهر المظهرية من هذا المرض. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أنه إذا كان هناك تباين كبير في الطفرات في السكان المتضررين من ADPKD ، فإن iPSCs الخاصة بالمريض (الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات) ، متوافقة تمامًا مع المناعة ، يمكن استخدامها للعلاجات التجديدية الفردية في المستقبل ، بالإضافة إلى السماح بتطوير نموذج في المختبر للتحقق مما إذا كانت مظاهر النمط الظاهري المبكرة جدًا متنوعة أيضًا مثل العرض السريري.

لم تكن العضويات غير المحفزة المشتقة من HC أو ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد) لا تشكل الأكياس بشكل تلقائي. لم يكن التشكل النموذجي للكيسات والتعبير عن علامات تكون المثانة قابلاً للاكتشاف في أي عينة ، حتى أنه تم تمديد التمايز العضوي في المزرعة حتى إكمال 35 يومًا. لقد ثبت أن تكاثر الخلايا وحده لا ينتج الخراجات [24]. علاوة على ذلك ، هناك حاجة لحدث ثالث مستقل (يُعرف بالضربة الثالثة) لتسريع تكوين الكيس ونموه في الجسم الحي [23]. على العكس من ذلك ، حدث تكوين الكيس الناجم عن فورسكولين في العضيات من مرضى ADPKD ولكن ليس في مرضى HC. من الجدير بالذكر ، على الرغم من وجودها ، لوحظت الخراجات بنسبة منخفضة في عينات ADPKD حتى في وجود فورسكولين ، كما لوحظ أيضًا بواسطة Freedman et al. [14] في العضيات المتكونة من نموذج CRISPR / Cas9 لمرض ADPKD. يمكن طرح بعض الفرضيات لشرح التردد المنخفض للكيسات الموجودة في النموذج الحالي. 1) أظهرت الكائنات العضوية المستزرعة في بيئة تعليق ثلاثية الأبعاد كفاءة أعلى بكثير في تكوين المثانة بالمقارنة مع العضيات الملتصقة [6] ، مما يشير إلى أن البيئة المكروية متورطة بشكل مباشر في تكوين المثانة. الأجزاء البعيدة من النيفرون [23]. على الرغم من أن جميع أجزاء النيفرون يمكن أن تنشأ خراجات بما في ذلك الأنابيب القريبة [25] ، يبدو أن تلك المشتقة من قنوات التجميع تبدو أكبر وبأعداد أكبر من تلك الموجودة في الأجزاء الأخرى [26] ، 3) أخيرًا ، تم إثبات مؤخرًا أن أصل الخراجات قد يكون مرتبطًا بوجود طفرات PKD1 متعددة تحدد شدة المرض وأن تكوين الكيس في قنوات التجميع كان مرتبطًا بشدة المرض [27 ، 28].

في الختام ، أوضحت النتائج الحالية أنه من الممكن إنتاج أشباه عضويات ذات هياكل ثلاثية الأبعاد مماثلة لبنية سلف الكلى باستخدام iPSCs (الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات) المعاد برمجتها من أسلاف الكريات الحمر التي تم عزلها بسهولة من ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد وراثيًا) المرضى وأن هذه العضيات قادرة على تكوين أكياس تحت تحفيز فورسكولين. تكشف هذه المنهجية الواعدة عن طريقة لزيادة فهم الخطوات الوراثية والنمطية والفسيولوجية المبكرة جدًا في تكوين الكيس في وضع ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد وراثيًا).

مراجع

1. Chebib FT، Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis، 67: 792-810، 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26530876

2. WatnickTJ ، و Torres VE ، و Gandolph MA ، و Qian F ، و Onuchic LF ، و Klinger KW ، وآخرون: تدعم الطفرة الجسدية في تكيسات الكبد الفردية نموذجًا ثنائي الإصابة لتكوين المثانة في مرض الكلى المتعدد الكيسات الجسدي السائد. الخلية المولية ، 2: {{ 3}} ، 1998 https: //doi.orq/10.1016/s 1097-2765 (00) ​​80135-5 PMID: 9734362

3. Pei Y و WatnickT و He N و WangK و Liang Y و Parfrey P وآخرون: تدعم طفرات PKD2 الجسدية في تكيسات الكلى والكبد الفردية نموذجًا "ثنائي الضربة" لتكوين المثانة في مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد من النوع 2. Soc Nephrol، 10؛ 1524-1529. 1999 https: //doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID: 10405208

4. Piontek K، Menezes LF، Garcia-Gonzalez MA، Huso DL، Germino GG: يحدد مفتاح التطور الحرج حركية تكوين كيس الكلى بعد فقدان Pkd1.Nat Med، 13: 1490-1495، 2007 https: / l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA و Contrino L و Zhou X و Bonventre JV و Sun Y و Humphreys BD وآخرون: إصابة الكلى هي الضربة الثالثة التي تعزز التطور السريع لمرض الكلى المتعدد الكيسات عند البالغين. هوم مول جينيت ، 18: 2523-2531 ، 2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. كروز إن إم. Song X، Czerniecki SM، Gulieva RE، Churchill AJ، Kim YK، et al: يكشف تكوين المثانة العضوي عن دور حاسم للبيئة المكروية في مرض الكلى المتعدد الكيسات البشري. نات ماتر ، 16: 1112-1119 ، 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID: 28967916

7. تاكاهاشي ك ، أوكيتا ك ، ناكاجاوا إم ، ياماناكا إس: تحريض الخلايا الجذعية متعددة القدرات من مزارع الأرومة الليفية. نات بروتوك ، 2: 3081-3089 ، 2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID: 18079707

8. Freedman BS، Lam AQ، SundsbakJL، Latino R، Su X، Koon SJ، et al: انخفاض البوليسيستين الهدبي -2 في الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات من مرضى الكلى المتعدد الكيسات مع طفرات PKD1. J Am Soc Nephrol، 24: 1571-1586، 2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID: 24009235

9. Chen HY، Tan HK، Loh YH: اشتقاق خلايا جذعية مستحثة خالية من الجينات من قطرة دم واحدة بيول خلية جذعية أولية بالكور ، 38: 4A.9. 1-4 A.9.10،2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 بميد: 27532818

10. YuJ، Hu K، Smuga-Otto K، Tian S، Stewart R، Slukvin Il، et al: الخلايا الجذعية المستحثة بشريًا والخالية من المتواليات المتجهية والمتحورة. العلوم ، 324: 797-801 ، 2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 بميد: 19325077

11. EminliS ، Foudi A ، Stadtfeld M ، Maherali N ، Ahfeldt T ، Mostoslavsky G ، et al: تحدد مرحلة التمايز إمكانات الخلايا المكونة للدم لإعادة البرمجة إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات. نات جينيت ، 41: 968-976 ، 2009 https: //doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK ، Mali P ، Huang X ، Ye Z ، Dowey SN ، Resar LM ، وآخرون: اشتقاق فعال لخلايا iPS البشرية عن طريق بلازميد غير متكامل من خلايا الدم مع توقيعات فريدة للتعبير الجيني والجيني. Cel / Res، 21: 518-529 ، 2011 https: //doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID: 21243013

13. Schutgens F ، Verhaar MC ، Rookmaaker MB: عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات: تقنية في المختبر تشبه في الجسم الحي. Eur J Pharmacol، 790: 12-20، 2016 https: /ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 بميد: 27375081

14. Freedman BS، Brooks CR، Lam AQ، Fu H، Morizane R، Agrawal V، et al: نمذجة أمراض الكلى باستخدام أشباه عضويات الكلى المتحولة CRISPR المستمدة من الأجسام الشبه الكروية البشرية متعددة القدرات. نات كومون ، 6: 8715 ، 2015 https: //doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. دوبوي أ باترسون ميلادي. Magistroni R. Dicks E، et al؛ معايير موحدة للتشخيص بالموجات فوق الصوتية لـ ADPKD (مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد). JAm Soc Nephrol، 20: 205-212، 2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID: 18945943

16. Watanabe K و Ueno M و Kamiya D و Nishiyama A و Matsumura M و Wataya T وآخرون: يسمح مثبط ROCK ببقاء الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المنفصلة. Nat Biotechnol، 25: 681-686، 2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K، Jaenisch R: إعادة البرمجة النووية وتعدد القدرات.طبيعة، 441: 1061-1067 ، 2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N، Ahfeldt T، Rigamonti A، UtikalJ، Cowan C، Hochedlinger K: نظام عالي الكفاءة لتوليد ودراسة الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان. سل / الخلية الجذعية. 3: 340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420