نظام Laccase-Mediator باستخدام وسيط طبيعي كعامل تبييض لإزالة لون الميلانين الجزء الأول

خلاصة: في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام laccase-mediator (LMS) باستخدام وسيط طبيعي كعامل مبيض لإزالة صبغة الميلانين. تم استخدام سبعة وسطاء طبيعيين لاستبدال الوسطاء التخليقيين والتغلب بنجاح على إمكانات الأكسدة المنخفضة من اللاكاز والوصول المحدود للميلانين إلى الموقع النشط من اللاكاز. تم تحسين نشاط إزالة لون الميلانين من اللاكزات من Trametes versicolor (lacT) و Myceliophthora thermophila (lacM) بشكل كبير باستخدام وسائط طبيعية بما في ذلك acetosyringone و syringaldehyde و acetovanillone ، والتي أظهرت سمية خلوية منخفضة. تلعب مجموعات الميثوكسي والكيتون من الوسطاء الطبيعيين دورًا مهمًا في إزالة لون الميلانين. تم تحسين ثوابت خصوصية lacT و lacM لإزالة صبغة الميلانين بمقدار 247 و 334 ، على التوالي ، عندما تم استخدام الأسيتوسرينغون كوسيط. يمكن أيضًا باستخدام LMS باستخدام الدانتيل والأسيتوزرينغون إزالة لون الميلانين الموجود في فيلم هيدروجيل السليلوز ، والذي يحاكي حالة الجلد. علاوة على ذلك ، يمكن لـ LMS إزالة لون ليس فقط نظائر الإيوميلانين الاصطناعية المحضرة بأكسدة التيروزين ولكن أيضًا الميلانين الطبيعي الذي تنتجه خلايا الورم الميلانيني.

وفقًا للدراسات ذات الصلة ،cistancheهو عشب شائع يعرف باسم "عشب معجزة يطيل الحياة". مكونه الرئيسي هوالسيستانوسيد، والتي لها تأثيرات مختلفة مثلمضادات الأكسدة, مضاد التهاب، وتعزيز وظيفة المناعة. الآلية بين cistanche وتفتيح البشرةيكمن في التأثير المضاد للأكسدة من cistancheجليكوسيدات. الميلانينفي جلد الإنسان ينتج عن أكسدة التيروزين المحفزالتيروزيناز، ويتطلب تفاعل الأكسدة مشاركة الأكسجين ، لذلك تصبح الجذور الخالية من الأكسجين في الجسم عاملاً مهمًا يؤثر على إنتاج الميلانين. يحتوي سيستانشالسيستانوسيد، وهو أحد مضادات الأكسدة ويمكن أن يقلل من توليد الجذور الحرة في الجسم ، وبالتاليتثبيط إنتاج الميلانين.

انقر على فوائد Rou Cong Rong للتبييض

لمزيد من المعلومات:

david.deng@wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501

1 المقدمة

Laccases (EC 1.10.3.2 ، benzenediol: dioxygen oxidoreductases) عبارة عن بروتينات متعددة النوى تعمل على تحفيز أكسدة مختلف المركبات الفينولية وغير الفينولية عبر آلية تفاعل محفز جذريًا عن طريق تقليل الأكسجين الجزيئي [1،2]. تم استخدام Laccases كمحفزات حيوية لعمليات التحلل البيولوجي ، مثل المعالجة الحيوية للأصباغ [3،4] ، الأدوية [5،6] ، مبيدات الأعشاب [7] ، وإزالة اللجنين [8-10]. كما تم استخدام Laccases لتحفيز بلمرة سلائف الصبغ والمركبات العضوية [11]. على وجه الخصوص ، فإن خصائصها الجذابة ، مثل خصوصية الركيزة المنخفضة ، واستخدام الأكسجين كمستقبل نهائي للإلكترون ، وتوليد الماء كمنتج ثانوي ، وعدم الطلب (أو عدم وجود إنتاج) من البيروكسيدات ، تجعلها مثيرة للاهتمام في التكنولوجيا الحيوية و المجالات البيئية [1،11،12].

تشارك أربعة أيونات نحاسية في الموقع النشط في النشاط التحفيزي لللاكيز. يؤكسد النحاس "الأزرق" (موقع T1) الركيزة ، وتتلقى الكتلة النحاسية ثلاثية النواة (T2 / T3) الإلكترونات من موقع T1 لتقليل الأكسجين الجزيئي [1،12،13]. على وجه الخصوص ، تعتبر إمكانات الأكسدة والاختزال في موقع T1 ، عاملًا رئيسيًا في تحديد القدرة التحفيزية لللكاسيس [14]. تمتلك اللاكيز إمكانات منخفضة نسبيًا للأكسدة والاختزال (0. 4 - 0. 8 فولت) مقارنةً بالبيروكسيدات المحللة للجنين (أكثر من 1 فولت) مثل بيروكسيداز المنغنيز وبيروكسيداز اللجنين. لا يمكن أن تؤكسد اللاكيز مباشرة الركائز غير الفينولية مع احتمال الأكسدة فوق 1.3 فولت [13 ، 14]. لذلك ، للتغلب على قيود laccase ، فإن أنظمة laccase-mediator (LMS) باستخدام مركبات جزيئية صغيرة ، مثل 2 ، 20 - azinobis (3- ethylbenzthiazoline -6- سلفونات) (ABTS) ، { {24}} تم اقتراح هيدروكسي بنزوتريازول (HOBt) ، وحمض فيوليوريك (VLA) ، و N-hydroxy phthalimide (HPI) ، و N-hydroxy acetanilide (NHA) ، و TEMPO ، والتي تعمل كوسيط الأكسدة والاختزال ، [15-17].

تسمح هذه الوسطاء بأكسدة المركبات الضخمة عبر طرق أكسدة مختلفة. يعمل نظام laccase-ABTS على أكسدة الركائز عن طريق توليد جذر ABTS كاتيوني عبر آلية نقل الإلكترون (ET). تنتج LMSs مع HOBt أو VLA أو HPI أو NHA جذور النيتروكسيل عبر آلية نقل ذرة الهيدروجين (HAT) [1،12،17]. علاوة على ذلك ، تتفاعل الوسطاء مثل TEMPO ونظائرها عبر المسارات الأيونية لتوليد أيونات أوكسو أمونيوم [1،12،18]. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الوسطاء إلى أكسدة مجموعة واسعة من المركبات في تطبيقات مختلفة ، مثل تحلل الصبغة [3،4] ، وتدهور الأدوية [5،6] ، وتدهور اللجنين [8-10]. ومع ذلك ، فإن تطبيقات الوسطاء الاصطناعية في المجالات الصناعية كانت محدودة بسبب السمية المحتملة والتكلفة العالية وتأثير تثبيط الإنزيم. في الآونة الأخيرة ، تمت دراسة الجزيئات الفينولية المشتقة من اللجنين كوسائط طبيعية (على سبيل المثال ، سيرينغالدهيد ، أسيتوسرينغون ، فانيلين ، أسيتوفانييلون ، ميثيل فانيليات ، حمض الفيروليك ، حمض سينابيك ، حمض الكوماريك ، إلخ) لتحل محل الوسطاء الاصطناعي [1،12] . مزايا الوسطاء الطبيعيين هي التكلفة المنخفضة والسمية المنخفضة لأنها مستمدة من مصادر طبيعية ومتجددة [19].

الميلانين عبارة عن مجموعة من الأصباغ الطبيعية التي تنتجها عملية تكوين الميلانين من خلال البلمرة المؤكسدة للتيروزين بواسطة الخلايا الصباغية. يمكن تصنيف الميلانين الطبيعي إلى خمس فئات من الميلانين ، والفيوميلانين ، وجميع الميلانين ، والفيوميلانين ، والميلانين العصبي [20]. في الآونة الأخيرة ، تمت دراسة العديد من التطبيقات الطبية والكهروكيميائية باستخدام سلائف الميلانين أو الميلانين [20 ، 21]. يتم تحديد لون جلد الإنسان في الغالب من خلال وجود الميلانين. في صناعة مستحضرات التجميل ، تم اقتراح إزالة صبغة الميلانين باستخدام الإنزيمات لتطوير عوامل تبييض البشرة. تمت دراسة العديد من البيروكسيدات لإزالة صبغة الميلانين. وو وآخرون. أظهر أن الميلانين الاصطناعي يمكن إزالته مباشرة عن طريق اللجنين بيروكسيديز من P. chrysosporium [22]. أبلغت مجموعات Keneko و Mohorˇcic أيضًا عن إزالة اللون الإنزيمي للميلانين بواسطة بيروكسيداز المنغنيز المعزول من الفطريات (Sporotrichum pruinose و Phlebia radiata) [23،24]. كيم وآخرون. ذكرت أن خلائط الإنزيم الخام المحتوية على بيروكسيداز المنغنيز ، اللجنين بيروكسيديز ، واللاكيز أظهرت نشاطًا في إزالة صبغة الميلانين [25]. عندما تقوم البيروكسيدات بإزالة لون الميلانين ، فإنها تتطلب بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) كعامل مساعد يمكن أن يسبب تهيج الجلد. وبالتالي ، لتقليل استخدام H2O2 ، تم إدخال الجلوكوز أوكسيديز أو اللاكاز في نظام تركيبة الإنزيم [26 ، 27]. يمكن أن يزيل اللاكيز لون الميلانين دون استخدام بيروكسيد الهيدروجين. أفاد Khammuang و Sarnthima أن اللاكاز من Lentinus polycarpous Lév أظهر نشاط إزالة لون الميلانين باستخدام ABTS ، الفانيلين ، وحمض الفانيليك كوسيط [28].

2. المواد والأساليب

2.1. مواد

2.2. إزالة صبغة الميلانين بواسطة LMS

تم تحضير محلول الميلانين المشبع (1.4 مجم / مل) بإذابة 3 مجم من الميلانين الصناعي في 1.3 مل من 1 0 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم. تم طرد المحلول عند 85 0 0 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لإزالة الميلانين غير المحلول ، وتم تخفيف المادة الطافية باستخدام 0. 1 مولار محلول فوسفات حامض الستريك (الرقم الهيدروجيني 3 ، 4 ، 5 ، 5.5 ، 6 ، 7) ويستخدم كحل ركيزة لـ LMS. كان تركيز الميلانين في محلول الركيزة 63 ميكروغرام / مل وتم تأكيده بالطيف الضوئي عند 475 نانومتر. تم خلط 0 .8 مل من محلول ركيزة الميلانين مع 0. 1 مل محلول وسيط (0-1 مم) في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل. بدأ تفاعل إزالة لون الميلانين بإضافة 0.1 مل من محلول اللاكاز (15.8 ميكروغرام (0.6 وحدة) أو 19.2 ميكروغرام (1.8 وحدة) من lacM) إلى خليط من الميلانين والوسيط عند 25 درجة مئوية في حمام مائي مهتز عند 120 دورة في الدقيقة. . بعد التفاعل ، تم طرد خليط التفاعل ، وتم قياس امتصاص المادة الطافية عند 475 نانومتر. تم حساب محصول إزالة اللون (النسبة المئوية) باستخدام المعادلة التالية:

إزالة اللون (النسبة المئوية) {{0}} (أ 0 - أت) / A0 × 100، (1)

2.3 دراسة حركية لإزالة صبغة الميلانين بواسطة LMS

2.4 السمية الخلوية للوسطاء الطبيعيين

تم استخدام خط خلايا سرطان الجلد B16F10 (بنك كوريا سيل لاين ، سيول ، كوريا) لتحديد السمية الخلوية للوسطاء الطبيعيين لـ LMS. تم إجراء اختبار أحمر محايد (NR) لقياس السمية الخلوية للوسطاء [29]. يقيس NR جدوى الليزوزومات الخلية الحية. تم توزيع خلايا الميلانوما بتركيز 3 × 104 خلية في كل بئر من 96- صفيحة البئر. بعد 24 ساعة من الزراعة ، تمت معالجة الخلايا بوسائط طبيعية (1 ، 2 ، 5 ، 10 ، 22 ، و 46 ملي مولار). بعد زراعة إضافية لمدة يومين ، عولجت الخلايا بمحلول NR 50 ميكروغرام / مل مذاب في DMEM وحضنت لمدة 3 ساعات. بعد إزالة المادة الطافية من خلال الشفط ، تم استخدام محلول امتصاص NR (1٪ حمض أسيتيك جليدي ، 49٪ إيثانول ، و 50٪ ماء مقطر) لاستخراج اللون. بعد عملية الاستخراج ، تم قياس التغير في الامتصاصية عند 540 نانومتر.

2.5 تحضير وإزالة اللون من فيلم الميلانين / السليلوز هيدروجيل

لقياس نشاط إزالة اللون من LMS لفيلم الميلانين / السليلوز ، تم قطع فيلم الهيدروجيل المحضر إلى ورقة 1 × 2 سم. تم غمر فيلم الهيدروجيل في 4 مل من محلول فوسفات حامض الستريك 1 مولار 0 (درجة الحموضة 5.5) ؛ بعد ذلك ، 0. تمت إضافة 5 مل من 1 ملي أسيتوسرينغون و 0. 5 مل من محلول الدانتيل (2.5 وحدة) إلى المخزن المؤقت. تم إجراء تفاعل إزالة اللون في حمام مائي مع الرج عند 120 م و 25 ْم لمدة 3 ساعات. بعد التفاعل ، تم غسل الفيلم بالماء المقطر وربطه بالجانب الداخلي من الكوفيت لقياس التغير في الأطياف في نطاق 400-800 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV / Vis. تم إجراء تفاعلات التحكم بدون lacM أو الوسطاء أيضًا في نفس الظروف. لم يتم الكشف عن إطلاق الميلانين من الفيلم أو تغير لون طبقة الميلانين / السليلوز تحت ظروف التفاعل. علاوة على ذلك ، تم أيضًا تسجيل التغيير في معلمات اللون (قيم L * و a * و b *) لفيلم الميلانين / السليلوز بعد تفاعل إزالة اللون بواسطة LMS باستخدام مقياس الألوان (KONICA MI NOLTA ، طوكيو ، اليابان). تم الحصول على قيم ∆L (فرق الإضاءة المتري) و E (فرق اللون الكلي) و YI (مؤشر الصفرة) و WI (مؤشر البياض) باستخدام المعادلات التالية [30–32]:

2.6. تحضير الميلانين الطبيعي

تم الحصول على الميلانين الطبيعي من خلايا سرطان الجلد B16F10. عولجت الخلايا بهرمون تحفيز الخلايا الصباغية ألفا لإنتاج الميلانين. بعد 4 أيام من الحضانة ، تم التقاط الخلايا باستخدام التربسين- EDTA وصوتها لمدة 10 دقائق. تم الحصول على المادة الطافية بالطرد المركزي عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ثم تعديلها إلى الرقم الهيدروجيني 1.5 باستخدام 6 مولار حمض الهيدروكلوريك. تم غلي المحلول عند 100 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لتحليل أجزاء البروتين المتبقية. تم غسل المحلول المحتوي على الميلانين الطبيعي بالأسيتون ، متبوعًا بالكلوروفورم والإيثانول ، ثم غسله بماء منزوع الأيونات للتخلص من المخلفات ، مثل الخلايا ومكونات الوسائط وكسور البروتين [33 ، 34]. تم إجراء جميع عمليات الغسيل أكثر من مرتين. أخيرًا ، تم الحصول على الميلانين الطبيعي عن طريق التجفيف بالتجميد واستخدامه كركيزة لـ LMS.

3. النتائج والمناقشة

3.1. تأثير الوسطاء على إزالة لون الميلانين بواسطة LMS

تم التحقيق في تأثير الوسطاء المختلفين على تفاعل إزالة لون الميلانين بواسطة LMS باستخدام اثنين من laccases من T. versicolor (lacT) و M. thermophila (lacM) (الشكل 1).عندما تم استخدام lacT بدون وسيط لإزالة صبغة الميلانين ، كان ناتج إزالة اللون 1 بالمائة فقط بعد 5 ساعات من التفاعل. عندما تم استخدام HOBt كوسيط لـ lacT ، تم تحسين محصول إزالة اللون قليلاً إلى 2 بالمائة بعد 5 ساعات من التفاعل. عزز استخدام الوسطاء التركيبيين المختلفين ، مثل HOBt و ABTS و VLA و TEMPO ، في الأكسدة المحفزة باللكاز للمركبات الفينولية أو غير الفينولية بشكل كبير معدلات التفاعل [10،15]. عندما يكون وصول المركبات المستهدفة إلى الموقع النشط من اللاكاز محدودًا بسبب عوائقها الفراغية ، يمكن للجذور الوسيطة المتكونة من اللاكاز أكسدة المركبات المستهدفة بكفاءة عن طريق نقل الإلكترون أو آلية نقل ذرة الهيدروجين [12]. HOBt هو أحد الوسطاء التخليقيين الأكثر استخدامًا في LMS نظرًا لإمكانية الأكسدة العالية (1.1 فولت) [6]. ومع ذلك ، فإن HOBt ليس مكونًا تجميليًا جيدًا بسبب تسمم الخلايا المحتمل وقدرته على تعطيل اللاكاز. وهكذا ، اخترنا سبعة وسطاء طبيعيين ، أسيتوسرينغون ، سيرينغالدهيد ، حمض ب-كوماريك ، فانيلين ، حمض الفانيليك ، كحول فانيليل ، وأسيتوفانييلون ، لتفاعل إزالة لون الميلانين بواسطة LMS. ومن المثير للاهتمام أن جميع الوسطاء الطبيعيين يعملون كوسطاء أكثر كفاءة من HOBt لإزالة لون الميلانين بسبب النقص. عندما تم استخدام الأسيتوسرينغون ، سيرينغالدهيد ، وحمض الكوماريك ، كانت عوائد إزالة اللون 28 بالمائة و 22 بالمائة و 18 بالمائة على التوالي بعد 5 ساعات من التفاعل. توضح هذه النتائج فائدة الوسطاء الطبيعيين لتفاعل إزالة لون الميلانين بواسطة LMS. يتأكسد الوسطاء في LMS إلى الجذور الوسيطة بواسطة اللاكاز ، وتحفز الجذور الوسيطة أكسدة الميلانين وإزالة لونه. عندما تم استخدام النقص بدون وسيط لإزالة لون الميلانين خلال وقت رد فعل كافٍ ، والذي يمكن أن يصل إلى حالة التوازن ، كان مردود إزالة اللون 7 بالمائة بعد 24 ساعة من التفاعل. تعمل الوسائط الطبيعية ، باستثناء حمض الفانيليك ، كوسيطات أكثر كفاءة من HOBt لإزالة لون الميلانين بواسطة lacT بعد 24 ساعة من التفاعل. كان ناتج إزالة اللون بعد تفاعل 24 ساعة باستخدام حمض الفانيليك كوسيط أقل من ذلك بعد 5 ساعات من التفاعل. قد يكون هذا بسبب الاستقرار المنخفض للشكل الجذري المؤكسد لحمض الفانيليك. عندما تم استخدام الأسيتوسرينغون ، سيرينغالدهيد ، وأسيتوفانييلون ، كانت عوائد إزالة اللون 34 في المائة ، و 30 في المائة ، و 31 في المائة ، على التوالي ، بعد تفاعل مدته 24 ساعة. كان حمض p-Coumaric أكثر كفاءة في تعزيز معدل التفاعل الأولي من acetovanillone ، بينما تسبب acetovanillone في زيادة إنتاجية إزالة اللون في حالة التوازن مقارنة بحمض p-coumaric.

كان تأثير الوسيط على تفاعل إزالة اللون بواسطة LMS باستخدام lacM مشابهًا جدًا للتأثير الذي تم الحصول عليه بواسطة LMS باستخدام lacT. عندما تم استخدام الدانتيل بدون وسيط لإزالة صبغة الميلانين ، كان ناتج إزالة اللون 2 بالمائة فقط بعد 5 ساعات من التفاعل. HOBt كوسيط لـ lacM لم يعزز محصول إزالة اللون خلال تفاعل 5 ساعات. جميع الوسطاء الطبيعيين ، باستثناء حمض الكوماريك والفانيلين ، كانوا بمثابة وسطاء فعالين في إزالة لون الميلانين بواسطة lacM. عندما تم استخدام أسيتوسيرنغون وسيرينغالدهيد ، كانت عائدات إزالة اللون 25 في المائة و 22 في المائة ، على التوالي ، بعد 5 ساعات من التفاعل. تم استخدام حمض p-Coumaric و vanillin كوسيطين فعالين لكل منهما ، لكنهما لم يتمكنوا من تحسين معدل إزالة اللون بكفاءة في LMS باستخدام الدانتيل. قد يكون هذا بسبب خصوصية الركيزة السفلية لـ lacM لحمض p-coumaric and vanillin. كانت نتائج إزالة اللون بعد 24 ساعة من تفاعل lacM مع حمض p-coumaric و vanillin مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بواسطة lacT. يشير هذا إلى أن الأشكال المؤكسدة لحمض الكوماريك والفانيلين يمكن أن تزيل لون الميلانين بكفاءة ، على الرغم من أن معدل الأكسدة بواسطة lacM كان أقل بكثير من معدل التأكسد بواسطة lacT. عندما تم استخدام lacM بدون وسيط لإزالة لون الميلانين خلال وقت رد فعل كافٍ ، كان ناتج إزالة اللون 5 بالمائة بعد 24 ساعة من التفاعل. تعمل الوسائط الطبيعية ، باستثناء حمض الفانيليك ، أيضًا كوسيطات أكثر كفاءة من HOBt لإزالة لون الميلانين بواسطة lacM بعد 24 ساعة من التفاعل. عندما تم استخدام الأسيتوسرينغون ، سيرينغالدهيد ، وأسيتوفانيون كوسيط لـ lacM ، كانت عوائد إزالة اللون 34 بالمائة ، 28 بالمائة ، 31 بالمائة على التوالي ، بعد 24 ساعة من التفاعل. عندما تم استخدام حمض الفانيليك كوسيط لكل من lacT و lacM ، أظهر أقل إنتاجية لإزالة اللون. قد يكون هذا بسبب الاستقرار المنخفض للشكل الجذري المؤكسد لحمض الفانيليك. ذكر Khammuang و Sarnthima أنه يمكن استخدام الفانيلين وحمض الفانيليك كوسيطين لإزالة لون الميلانين باستخدام اللاكاز من Lentinus polycarpous [28]. ومع ذلك ، فقد أظهروا نشاطًا أقل بكثير في إزالة اللون للميلانين من الأسيتوسيرنغون عندما تم استخدامهم كوسيطات في lacT والدانتيل.

تشير هذه النتائج إلى أن الوسطاء الطبيعيين أكثر كفاءة في إزالة لون الميلانين بواسطة LMS مقارنة بـ HOBt. تم اعتبار HOBt وسيطًا اصطناعيًا فعالًا لللكاز بسبب إمكاناته العالية للأكسدة والدور التحفيزي لمجموعة N OH في HOBt [5]. تعتمد كفاءة الوسطاء في أكسدة ركائز الهدف اعتمادًا كبيرًا على القدرة على تكوين جذور مستقرة بالإضافة إلى العائق الفاصل الناجم عن بدائل الألكيل الضخمة بدلاً من إمكانات الأكسدة والاختزال للوسطاء [19 ، 35]. تم تحديد الاستقرار المنخفض للوسيط المؤكسد لـ HOBt من خلال قياس الفولتميتر الدوري [6]. لذلك ، قد يكون ناتج إزالة اللون المنخفض بواسطة LMS باستخدام HOBt ناتجًا عن انخفاض ثبات HOBt تحت ظروف تفاعل laccase. على الرغم من أن إمكانات الأكسدة والاختزال لـ syringaldehyde كانت أقل من HOBt ، أظهر syringaldehyde ثباتًا أعلى نسبيًا من HOBt [6].

كما هو مبين في الشكل 2 ، فإن الوسطاء الطبيعيين المستخدمة في هذا العمل لها بدائل مختلفة (على سبيل المثال ، هيدروكسيل ، ميثوكسي ، كربوكسيل ، كيتون ، أو ألدهيد) في مواضع مختلفة على حلقة البنزين [12 ، 19]. أظهر الوسطاء الذين لديهم مجموعتان من الميثوكسي (أسيتوسيرنغون وسيرينغالدهيد) معدلات إزالة لون أعلى من تلك التي تحتوي على مجموعة ميثوكسي واحدة. كان معدل إزالة اللون الذي تم الحصول عليه بواسطة حمض الكوماريك مع عدم وجود مجموعة ميثوكسي يعتمد على نوع اللاكاز. أظهر حمض الكوماريك p مع lacT معدل إزالة اللون أعلى من تلك التي تحتوي على مجموعة ميثوكسي واحدة ، بينما أظهر حمض p-coumaric مع lacM أقل معدل إزالة اللون في تفاعل 5 ساعات. فيلات وآخرون كما أظهرت نتائج مماثلة لإزالة لون الأحبار الفلكسوغرافية بواسطة اللاكازات الفطرية بالوسائط الطبيعية [36]. تم أكسدة الوسطاء الطبيعيين الفينوليين (أسيتوسيرنغون ، حقنة ميثيل ، وسيرينغالدهيد) مع بدائلين ميثوكسي في الحلقة بواسطة اللاكاز أسرع من حمض الكوماريك مع عدم وجود مجموعة ميثوكسي. يشير هذا إلى أن مجموعات الميثوكسي تلعب دورًا أكثر أهمية كمانحين للإلكترون من الرابطة المزدوجة للسلسلة الجانبية لحمض الكوماريك p. عند مقارنة الوسطاء بمجموعة ميثوكسي واحدة ، زاد محصول إزالة اللون بالترتيب التالي: أسيتوفانيلون> فانيلين> كحول فانيلي> حمض الفانيليك. أظهر Acetovanillone ، الذي يحتوي على مجموعة كيتون ، معدل إزالة لون أعلى وإنتاجية أعلى من الوسطاء مع مجموعات الألدهيد والهيدروكسيل والكربوكسيل. أظهر Acetosyringone مع مجموعة الكيتون أيضًا معدل إزالة اللون والمحصول أعلى من syringaldehyde مع مجموعة الألدهيد.

في التجارب التالية ، تم اختيار أسيتوسيرنغون وسيرينغالدهيد وأسيتوفانييلون ، والتي أظهرت قدرة عالية على إزالة لون الميلانين ، كوسيط لـ LMS لإزالة لون الميلانين. تم التحقيق في تأثير الوسيط على تفاعل إزالة اللون بواسطة LMS بمرور الوقت (الشكل S1). أدى تفاعل إزالة اللون باستخدام lacT مع acetosyringone و syringaldehyde و acetovanillone إلى إنتاج 21 بالمائة و 18 بالمائة و 1 بالمائة لإزالة اللون بعد ساعة واحدة من التفاعل ، على التوالي. أدى تفاعل إزالة اللون باستخدام lacM مع acetosyringone و syringaldehyde إلى إنتاج 19 بالمائة و 18 بالمائة لإزالة اللون بعد ساعة واحدة من التفاعل ، على التوالي. أظهر كلا اللاكسين ملامح تفاعل متشابهة عند استخدام نفس الوسيط. عزز Acetosyringone و syringaldehyde بشكل كبير معدل إزالة اللون أثناء التفاعل الأولي. تظهر هذه النتائج أن الأسيتوسرينغون والسيرينغالدهيد المحتويان على مجموعات ثنائي ميثوكسي كانا أكثر كفاءة في تعزيز المعدل الأولي لإزالة اللون بواسطة LMS من الأسيتوفانيلون المحتوي على مجموعة ميثوكسي واحدة. فيلات وآخرون ذكرت أيضًا أن مجموعات الميثوكسي في الهياكل الحلقية للوسطاء تعمل كمسرعات لأكسدة الركائز [36]. من ناحية أخرى ، كان ناتج إزالة اللون بعد 24 ساعة من تفاعل الأسيتوفانيون مشابهًا لمنتج سيرينغالدهيد ، على الرغم من أن الأسيتوفانيلون عزز معدل التفاعل بشكل معتدل.

لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501