يعزز Lactobacillus Plantarum GKM3 طول العمر والاحتفاظ بالذاكرة ويقلل من إجهاد أكسدة الدماغ في الفئران SAMP8 الجزء 1

خلاصة: (1) الخلفية: يؤثر التدهور المعرفي المرتبط بالعمر بشكل شائع على حياة كبار السن مع ظهور أعراض مرتبطة بضعف تدريجي في الذاكرة والتعلم. تم اقتراح أن البروبيوتيك يمكن أن تعدل الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر عبر محور الأمعاء والدماغ. (2) الطرق: للتحقيق في التأثير المضاد للشيخوخة لبروبيوتيك Lactobacillus plantarum GKM3 ، تم إجراء كل من اختبارات البقاء والتجارب المعرفية في نموذج الفئران SAMP8. تم تغذية SAMP8 البالغ من العمر ستة أشهر (ن {{1 0} في كل جنس) بروبيوتيك GKM3 بجرعة 5.1 × 109 و 1.0 × 109 كفو / كجم من وزن الجسم / يوم حتى وفاتهم الطبيعية. بعد ذلك ، تم فحص العمر الافتراضي. تم إعطاء SAMP8 البالغ من العمر ثلاثة أشهر (رقم=10 في كل جنس) GKM3 لمدة 14 أسبوعًا. ثم تم تسجيل اختبارات السلوك ومعاملات الأكسدة. (3) النتائج: أظهرت مجموعات GKM3 زيادة كبيرة في زمن الانتقال في اختبار التجنب السلبي ووقت التجنب الناجح في اختبار التجنب النشط. أظهر كل من TBARS و {26}} OHdG من أدمغة الفئران أيضًا انخفاضًا كبيرًا في المجموعات المعالجة بـ GKM3. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على تراكم أقل للبروتين النشواني في أدمغة الفئران SAMP8 مع مكمل GKM3. (4) الاستنتاجات: أشارت هذه النتائج إلى أن L. plantarum GKM3 أخرت عملية الشيخوخة ، وتخفيف الضعف الإدراكي المرتبط بالعمر ، وتقليل الإجهاد التأكسدي.

انقر فوق ملحق Cistanche Tubulosa

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】

الكلمات الدالة: فأر معرّض للشيخوخة معرّض للشيخوخة 8 (SAMP8) ؛ البروبيوتيك. 8- هيدروكسي -20 - deoxyguanosine (8- OHdG) ؛ المواد المتفاعلة لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) ؛ أميلويد- (أ) ؛ شيخوخة

1 المقدمة

لقد كانت مشكلة أن الضعف الإدراكي الذي يعاني منه السكان قد أصبح أكبر بعد نمو عدد الأفراد الأكبر سنًا في العقد الماضي [1]. وفقًا لتقرير منظمة الصحة العالمية (WHO) ، فإن عدد الأشخاص الذين يعانون من التدهور المعرفي ، والذي كان أكثر من 46.8 مليون في عام 2015 ، سيصل إلى أكثر من 74.7 مليون في عام 2030 ، وهو ما زاد بمقدار النصف تقريبًا في غضون خمسة عشر عامًا [2] . يُعتقد عمومًا أن الشيخوخة ، المعترف بها على أنها علاقة قوية بالضعف الإدراكي ، مرتبطة بالإجهاد التأكسدي ، الذي يشارك في تراكم الجذور الحرة ويعزز العديد من الاختلالات الفسيولوجية ، خاصة في الدماغ ، وهو عضو حساس للأكسجين ، مما يؤدي إلى تدهور أعراض مثل فقدان الذاكرة وتراجع القدرة على التعلم [3-5].

بما أن الشيخوخة أمر لا مفر منه وأن أعراضه السلبية النسبية معقدة ، فإن الناس يتابعون علاجات لمكافحة الشيخوخة ، تتراوح من علاجات النظام الغذائي إلى أكثر من العلاجات الدوائية [6،7]. على سبيل المثال ، أظهر مستخلص جذر الجينسنغ (Panax quinquefolius) تحسنًا في الوظيفة الإدراكية وتم تمييزه على أنه المفضل لدى الكوريين [8]. مستخلص الجنكة ، مثال آخر ، كان محبوبًا من قبل اليابانيين لوظائفه في تعزيز الإدراك وتقليل الأكسدة [9]. على الرغم من أن العديد من التقارير قد أشارت إلى أن النظم الغذائية النباتية توفر تأثيرات مضادة للأكسدة وتؤخر عملية الشيخوخة ، إلا أن هناك تركيزًا أكثر إثارة للاهتمام على ميكروبيوتا الأمعاء أو حتى على مجموعة من البكتيريا المعينة في الأمعاء التي يمكن أن تستقلب هذه المواد الغذائية وتوفر تعديلًا متعددًا إيجابيًا. التأثيرات على المضيف ، بما في ذلك طول العمر [10-14]. يمكن أن تنتج بكتيريا الأمعاء أحماض دهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) مثل الأسيتات أو البروبيونات أو الزبدات من النظام الغذائي للفرد [15]. أظهر الأطفال الذين تناولوا التغذية المعوية النباتية مستويات SCFA أعلى من الأطفال العاديين في عينات البراز [16]. يمكن أن تلعب هذه SCFAs دورًا مهمًا في ظهارة الجهاز الهضمي البشري [17]. يمكن للأسيتات عبور الحاجز الدموي الدماغي ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا العصبية الوطائية [18]. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة الزبدات فيما يتعلق بتأثير قمع التهاب القولون في الأمعاء البشرية [19]. لذلك ، من المهم أي نوع من الجراثيم أو البكتيريا المعينة الموجودة في أمعاء الإنسان ، خاصة من حيث التأثير على صحة الجسم وطول العمر [20 ، 21].

يمكن أن تؤثر الجراثيم المعوية أيضًا على محور الأمعاء والدماغ وتؤخر عملية الشيخوخة ، وبالتالي تمنع تقدم الأمراض المرتبطة بالعمر مثل فقدان الذاكرة والخرف أو حتى مرض الزهايمر [22 ، 23]. على سبيل المثال ، يمكن إنتاج ناقل عصبي جاما أمينوبوتيريك (GABA) بواسطة سلالات بكتيرية معينة تم الإبلاغ عنها مع تكاثر الخلايا الجذعية الظهارية في الأمعاء وتحسين السلوك الشبيه بالاكتئاب لدى الفئران [24 ، 25]. مع البيانات الداعمة الحالية ، فإن إضافة البروبيوتيك كطريقة وقائية كان اتجاهًا لهذه الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر [26 ، 27].

Lactobacillus هو البروبيوتيك الأكثر شيوعًا والذي أظهر إمكانية عالية لتطوير غذاء وظيفي كما هو موجود في طعام الإنسان لفترة طويلة [28]. ومع ذلك ، فإن الأنواع البكتيرية الفردية لها أنشطة بيولوجية فريدة ، من سلالة إلى سلالة ، والتي تتطلب تأكيدًا تجريبيًا. في دراساتنا السابقة ، قمنا بعزل سلالة الكائنات الحية المجهرية Lactobacillus plantarum GKM3 من الأوراق المخللة (Brassica juncea) ، والمعروفة أيضًا باسم الخضروات طويلة العمر في مجتمع Hakka التايواني ، وأجرينا دراسات وظيفية حول تعزيز الجهاز الهضمي والمناعة في الجسم الحي [29-31] . لذلك ، توقعنا أن يخفف L. plantarum GKM3 من عملية الشيخوخة والضعف الإدراكي المرتبط بالعمر.

2. المواد والأساليب

2.1. المواضيع

تم عزل L. plantarum GKM3 من الخردل الصيني (Brassica juncea) وحفظه في مركز Bioresource Collection and Research Center ، تايوان (BCRC) ، برقم المجموعة 91 0 787. أولاً ، تمت تربية GKM3 باستخدام مرق MRS (BD Co. ، Franklin Lakes ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في أنبوب الاختبار. باستخدام {{1 {15}}}. 0 تلقيح بنسبة 1 في المائة ، تم توسيع نطاق ثقافة البذور GKM3 في مخمر 5 0 لتر تحت تحكم درجة الحموضة 6. 0 في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع وسط مصمم (5 بالمائة جلوكوز ، 2 بالمائة مستخلص خميرة ، 0.05 بالمائة MgSO4 ، 0.1 بالمائة K2HPO4 ، و 0.1 بالمائة توين 80). بعد ذلك ، تم حصاد البكتيريا المخمرة بالطرد المركزي عند 3800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وغسلها بمحلول ملحي فوسفاتي مرتين ، وتم خلط الحبيبات مع 10 في المائة من الحليب للتجميد. تم تعديل جرعات مسحوق L. plantarum GKM3 المجفف بالتجميد في هذه الدراسة إلى 5.1 × 109 cfu / kg BW / يوم كجرعة عالية و 1.0 × 109 cfu / kg BW / يوم كجرعة منخفضة لنموذج الفأر بالتزقيم. .

تم إدخال الفئران المعرضة للشيخوخة P8 (SAMP8) في هذه الدراسة كنموذج حيواني متقدم في السن. تم تطبيق جميع الفئران SAMP8 والاحتفاظ بها في دورة مظلمة / فاتحة لمدة 12 ساعة تحت 25 ± 2 درجة مئوية ، 65 ± 5 بالمائة رطوبة نسبية مع الطعام والماء بالشهرة الإعلانية. تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية التالية من قبل لجنة إدارة الحيوان التابعة لقسم الغذاء والتغذية بجامعة بروفيدنس (مدينة تايشونج ، تايوان) برقم IACUC 20170629- A02.

2.2. اختبار البقاء على قيد الحياة

في اختبار البقاء على قيد الحياة ، تم تجميع فئران SAMP8 البالغة من العمر ستة أشهر مع 20 أنثى و 20 ذكرًا على النحو التالي: مجموعة التحكم ، ومجموعة GKM3 ذات الجرعات العالية ، ومجموعة GKM3 ذات الجرعات المنخفضة. تم توفير البروبيوتيك L. plantarum GKM3 يوميًا لفئران المعالجة حتى وصلت إلى وفاتها الطبيعية. تم تسجيل الفئران الحية / الميتة SAMP8 في كل مجموعة وتم حساب متوسط ​​العمر الافتراضي.

2.3 تصميم التجربة للضعف الإدراكي المرتبط بالعمر

تم إيواء فئران SAMP8 البالغة من العمر ثلاثة أشهر لتجربة ضعف الإدراك. تم تجميع كل من فئران SAMP8 من الذكور والإناث على النحو التالي (ن=10 في كل جنس): مجموعة التحكم ، ومجموعة الجرعات العالية من GKM3 ، ومجموعة الجرعات المنخفضة من GKM3. تم إعطاء الفئران في مجموعات العلاج عن طريق الفم L. plantarum GKM3 لمدة 14 أسبوعًا. تم إجراء نشاط الحركة في الأسبوع الحادي عشر من التجربة. تم إجراء اختبار التجنب السلبي واختبار التجنب النشط على التوالي في الأسبوع الثالث عشر والرابع عشر ، ثم تم التضحية بالفئران للتحليل الكيميائي الحيوي والفحص النسيجي.

2.4 نشاط الحركة

تم وضع كل فأر في وسط قفص مكوك (25 سم × 25 سم × 25 سم ، Coulbourn Instruments Model E 61-21 ، ليهاي ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تسجيل تحركاتهم بواسطة محلل مسار فيديو مراقب النشاط لمدة 10 دقائق. تم تحليل متوسط ​​وقت حركة الماوس كل 5 دقائق (ثانية / 5 دقائق). تم إجراء هذا الموكب في ظل ظروف الإضاءة الخافتة والصامتة.

2.5 اختبار التجنب السلبي

تم تقسيم قفص مكوك (35 سم × 17 سم × 2 0 سم ، Coulbourn Instruments Model E 10-15 ، Lehigh ، PA) إلى غرفة مظلمة ومضيئة. كان هناك باب مقصلة (7.5 سم × 6.5 سم ، Coulbourn Instruments Model E 10-15 GD ، Lehigh ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بين الغرفتين. في اختبار التدريب لاختبار التجنب السلبي ، تم وضع فأرة في غرفة الإضاءة لمدة دقيقة للتكيف ثم تم فتح باب المقصلة. سيتلقى الفأر 0 .5 µ صدمة كهربائية لمدة 0.5 ثانية عندما يدخل الغرفة المظلمة. كانت الصدمة تحدث باستمرار ثلاث مرات كل خمس ثوان. تم استبدال الماوس في نفس العملية في 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد جلسة التدريب لاختبار الذاكرة ، باستثناء أنه لم يتم توجيه أي صدمة. تم قياس متوسط ​​أوقات بقاء الفئران في غرفة الإضاءة. تم تحديد وقت قطع علوي يبلغ 180 ثانية.

2.6. اختبار التجنب النشط

في اختبار التدريب لاختبار التجنب النشط ، سيتلقى الفأر 1 0 حافزًا مشروطًا (CS) بناءً على الضوء والصوت ، ثم 5 ثوانٍ من صدمة كهربائية 0.3 مللي أمبير (التحفيز غير المشروط ، UCS) إذا كان بقي الفأر في نفس الغرفة ، بينما لم يكن هناك استقبال للصدمات إذا انتقل الماوس إلى الغرفة الأخرى. تم تدريب كل فأر لمدة 5 دورات CS و UCS. تم اختبار الفأر تحت نفس العملية (نظام CS / UCS) بفواصل زمنية تتراوح بين 15 و 20 دقيقة أربع مرات في اليوم واختبارها باستمرار لمدة أربعة أيام. تم قياس متوسط ​​وقت التجنب كتأثير على ذاكرة التعلم.

2.7. تحليل الإجهاد التأكسدي

لاكتشاف 8- هيدروكسي -20 - deoxyguanosine (8- OHdG) من الحمض النووي للميتوكوندريا في الدماغ ، تم استخراج 30 ملغ من أنسجة المخ بواسطة نظام Miniprep لاستخراج الحمض النووي الجيني للدم والأنسجة (Viogene Biotek Corp. ، تايبيه ، تايوان) و 8- OHdG Check ELISA Kit (Nikken SEIL Co. Ltd. لتحليل المواد المتفاعلة لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) ، تم طحن 25 مجم من أنسجة المخ باستخدام عازلة 250 ميكرولتر RIPA وطردها عند 16 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية. في المجموع ، تم جمع 100 ميكرولتر من المادة الطافية وإضافتها باستخدام 100 ميكرولتر من محلول SDS و 4 مل من كاشف اللون ، ثم غليها لمدة ساعة قبل معالجة التبريد. تم الطرد المركزي للعينات المعالجة عند 16 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق وتم وضعها لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. تم قياس محتوى TBARS (بروتين ملي مولار / غرام) من كل عينة 150 ميكرولتر عند امتصاص 535 نانومتر مع المنحنى القياسي.

2.8 قياسات اميلويد الدماغ- بروتين

تم تلوين بروتين أميلويد (أ) من قسم أنسجة المخ بطريقة الكيمياء الهيستولوجية المناعية. تم تحليل النسبة المئوية للتراكم A بواسطة نظام الصور (Leica ، Q500 ، Wetzlar ، ألمانيا) باستخدام مجهر تحت مجال 40 ×. استند الحساب إلى النسبة المئوية لمنطقة التراكم A في كل الدماغ: (منطقة ترسب أميلويد / منطقة الدماغ بالكامل) × 100 بالمائة.

2.9 علم الانسجة

تم استئصال الأدمغة وتثبيتها بنسبة 10 بالمائة من الفورمالين. تمت معالجة نسيج الحصين من خلال عملية التجفيف والتنظيف والتسلل والتضمين للتقطيع. بعد ذلك ، تم فحص أنسجة منطقة الحُصين بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E).

2.10. إحصائية

تم استخدام البراز الإحصائي SPSS 19. 0 في هذه الدراسة. يتم التعبير عن جميع البيانات على أنها ± SEM ويتم تقييمها بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة الوسائل بين المجموعات المختلفة. تم أخذ اختلاف كبير في الاعتبار عندما كانت القيمة الاحتمالية أقل من 0. 05 من خلال اختبارات النطاق المتعددة في Duncan. في اختبار البقاء على قيد الحياة ، تم تطبيق اختبار Kaplan-Meier للتحليل وأجري اختبار تسجيل الترتيب للتحقق من الاختلافات بين المجموعات.

3. النتائج

3.1. تأثير L. plantarum GKM3 على اختبار البقاء على قيد الحياة SAMP8

في تجربة البقاء على قيد الحياة ، لوحظ العمر الافتراضي لفئران SAMP8 حتى وفاتها الطبيعية واستغرق الأمر 21 شهرًا لإكمال جميع السجلات الفردية. كان متوسط ​​عمر فئران SAMP8 غير المعالجة 11.9 0 ± {{1 0}. 18 شهرًا وبالنسبة للإناث كان 11.2 0 ± 0. 21 شهور. في مجموعات التغذية بروبيوتيك GKM3 ، امتد متوسط ​​عمر الذكور إلى 12. 0 5 ± 0.15 شهرًا و 13.50 ± 0.14 شهرًا في الجرعات المنخفضة والعالية من علاجات GKM3 ، على التوالي. يمكن أيضًا ملاحظة التأثير المعتمد على الجرعة لبروبيوتيك GKM3 على إطالة عمر الإناث مع 12.15 ± 0.21 شهرًا في مجموعة الجرعة المنخفضة ومع 14.30 ± 0.17 شهرًا في العلاج بجرعة عالية (البيانات غير معروضة).

لتلخيص متوسط ​​العمر المتوقع ، تم تقدير معدل البقاء على قيد الحياة. مع معدل بقاء 5 0 في المائة ، كانت الجرعة المنخفضة من GKM3 في مجموعة الذكور 12.67 شهرًا والجرعة العالية لمجموعة الذكور GKM3 كانت 13.33 شهرًا ، بينما قدمت مجموعة التحكم للذكور فقط 12.50 شهرًا (الشكل 1 أ). على غرار الملاحظة في إناث الفئران SAMP8 ، تم عرض 12. 00 شهرًا و 15.50 شهرًا مع معدل بقاء بنسبة 50 بالمائة في مجموعات تم تغذيتها بروبيوتيك GKM3 بجرعة 1.0 × 109 CFU / كجم من وزن الجسم / يوم و 5.1 × 109 CFU / كجم من وزن الجسم / يوم ، على التوالي ؛ ومع ذلك ، لوحظ 10.50 شهرا مع معدل البقاء على قيد الحياة 50 في المئة في المجموعة الضابطة الإناث (الشكل 1 ب). قدمت الفئران الإناث SAMP8 متوسط ​​العمر المتوقع أقصر من الذكور كأساس في هذه التجربة. بشكل مثير للاهتمام ، تأثير L. plantarum GKM3 من حيث العمر كان له تأثير أكبر على الإناث. يقترح أن L. plantarum GKM3 يمكن أن يزيد من طول العمر في فئران SAMP8 من كلا الجنسين ، خاصة في الأنواع الأنثوية.

3.2 وزن الجسم ، وتناول الطعام ، وتناول الماء في الفئران SAMP8

في التجربة على الضعف الإدراكي المرتبط بالعمر ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في استهلاك الطاقة وتغير الوزن بين جميع الفئران SAMP8 من مجموعات العلاج المختلفة قبل التضحية (الجدول 1). هذا يعني أن بروبيوتيك GKM3 لم يؤثر على هذه المعلمات الأيضية في نموذج الفأر المسن.

3.3 تأثير L. plantarum GKM3 على الاحتفاظ بالذاكرة وتحسين التعلم

أظهر اختبار نشاط الحركة أنه لا يوجد فرق كبير بين جميع الفئران SAMP8 في أول 5- فاصل زمني ، بغض النظر عن الجنس (الجدول 2). على الرغم من حدوث انخفاض في الفترة الزمنية الثانية 5- دقيقة ، عند مقارنتها بالفاصل الزمني 5- دقيقة الأول ، لم يكن هناك تغيير كبير بين المجموعات المعالجة وغير المعالجة.

تم إجراء اختبارات التجنب السلبي على مجموعات من الذكور والإناث من الفئران SAMP8 (الشكل 2). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين جميع المجموعات أثناء الاختبار التجريبي (p> 0. 0 5). تم زيادة زمن انتقال ذكور الفئران SAMP8 التي تتغذى على بروبيوتيك GKM3 بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم في اليوم الأول (p <0. 0 5) (الشكل 2 أ). تم أيضًا زيادة وقت فئران SAMP8 المقيمة في غرفة الإضاءة في اليوم الأول من علاج GKM3 ، مع قيمة p أقل من 0.05 في مجموعة الجرعات المنخفضة وقيمة p أقل من 0.01 في المجموعة العالية. - مجموعة الجرعات بالمقارنة مع المجموعة الضابطة. ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بعد اليوم الثاني من اختبار التجنب السلبي. أشار الكمون الأطول الذي تم إجراؤه في مجموعة التغذية GKM3 ، في كل من الفئران الذكور والإناث SAMP8 ، إلى أن بروبيوتيك GKM3 يمكن أن يساهم في الاحتفاظ بالذاكرة المرتبطة بالعمر وتحسين التعلم.

في إجراء تفادي نشط ، طُلب من الفئران اتخاذ أي إجراء لتجنب التحفيز الضار. في اليوم التجريبي لاختبار التجنب النشط ، أظهر كل من الفئران الذكور والإناث SAMP8 التي تم تغذيتها بـ GKM3 ميلًا لتحقيق نجاح أعلى في التجنب (الشكل 3) ولكن لم تصل إلى الفرق الإحصائي (p> 0. {{ 9}} 5) بالمقارنة مع مجموعة التحكم. ومع ذلك ، أظهرت النتيجة في اليومين الأول والثاني من اختبار التجنب النشط أن الوقت الناجح قد زاد بشكل كبير في مجموعات الذكور مع تغذية GKM3 بالمقارنة مع الفئران الذكور غير المعالجة SAMP8 (الشكل 3 أ) (p <0.05). كما لوحظت نتيجة مماثلة في المجموعات النسائية (الشكل 3 ب). مهتم ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية (ص=0. 157) في نتيجة اليوم الرابع بين مجموعة السيطرة ومجموعة الكائنات الحية المجهرية. هذا يعني أن الفئران الضابطة احتاجت إلى تدريب لمدة أربعة أيام لتعويض وجود الفئران التي تتغذى على البروبيوتيك. يُقترح أن إضافة البروبيوتيك GKM3 إلى النظام الغذائي يمكن أن يساعد في إدراك المضيف الذي يؤثر على السلوك المناسب في كلا الجنسين.

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】