اللاميفودين يحسن التدهور المعرفي في فئران SAMP8: الدمج في التقييم الدوائي في Vivo وصيدلة الشبكة

خلاصة

مثبطات النسخ العكسي مثل لاميفودين (3TC) تلعب دورًا مهمًا فيمكافحة الشيخوخة، ولكن آثارها علىالأمراض التنكسية العصبية التي تسببها الشيخوخةليست واضحة ، خاصة فيما يتعلق بوظائفالجهاز العصبي مثل الإدراك. في هذه الدراسة ، قمنا بإعطاء 3TC إلى الفئران المعرضة للشيخوخة 8 (SAMP8) عن طريق التروية المعدية (100 مجم / كجم) لمدة 4 أسابيع. أظهرت نتائجنا أن 3TC حسنت بشكل ملحوظحالة الشيخوخة من الفئران SAMP8، وخاصة انخفاض القدرة المعرفية التي تم تقييمها بواسطة اختبار Morris Water maze. لمزيد من التحقيق في الآليات الجزيئية لـتحسين حالة الشيخوخةمن الفئران SAMP8 بواسطة 3TC ، تم استخدام طرق تلطيخ الأنسجة qPCR لدراسة أنسجة المخ (مثل الحصين والقشرة) من الفئران ، بينما تم تطبيق تحليل علم الأدوية للشبكة للتحقيق في الأهداف المحتملة لـ 3TC. أظهرت النتائج أن مستويات الرنا المرسال للجينات مرتبطة بالعنصر المتناثر الطويل -1 ، واستجابة الانترفيرون من النوع الأول ، والنمط الظاهري للإفراز المرتبط بالشيخوخة ، ومرض الزهايمرفي الحصين وقشرة الفئران SAMP8 بسببشيخوخة، ولكن تم عكس هذا الاتجاه جزئيًا بواسطة 3TC. أظهرت نتائج الدراسات النسيجية أن 3TC قللت من موت الخلايا العصبية الحُصَينية ، بينما أشارت نتائج التحليل الصيدلاني للشبكة إلى أن 3TC قد تمارس تأثيرها من خلال مسارات متعددة ، بما في ذلك إشارات الاستروجين و PI3K / Akt ومسارات إشارات تفاعل مستقبلات الارتباط العصبية النشطة ، والتي تحققنا منها من خلال التجارب المخبرية. تقدم هذه النتائج دليلاً على الإمكانات العلاجية لـ 3TC في علاج الأمراض التنكسية العصبية.

الكلمات الدالةشيخوخةالقدرة المعرفية لاميفودين lعنصر ong interspersed -1, الأمراض العصبية

تأثير الأعشاب الصينية علىمثبطات النسخ العكسي على مكافحة الشيخوخة

1|مقدمة

حتى الآن ، الشيخوخة والأمراض العصبية التنكسية ، مثلمرض الزهايمر (AD) أو مرض باركنسونالمرتبطة بالشيخوخة ، تتزايد باستمرار بسبب التغيرات الديموغرافية العالمية. 1،2 يمثل التدهور المعرفي عائقًا خطيرًا أمام تحقيق حياة طويلة وصحية. على مدى عقود ، كانت هناك جهود كبيرة مكرسة للبحث عن الأدوية التي يمكن استخدامها لعلاج التنكس المعرفي مع تقدم العمر .3 في السنوات الأخيرة ، اكتسب العنصر الطويل المتناثر -1 (L1) اهتمامًا متزايدًا باعتباره رواية محتملة الهدف لدراسة الشيخوخة. 4 ينتمي L1 إلى أكثر عائلة من الينقولات الطرفيّة المتكرّرة غير الطويلة مع حوالي 500 ، 000 نسخة ، والتي تشكّل 17 بالمائة من الجينوم البشري. يشتمل جين L1 على أوبرا بإطاري قراءة مفتوحين (ORF1 و ORF2) ، وكلاهما مطلوب من أجل التحويل الرجعي. لاميفودين (2 '-3' - deoxy -3 '- thiocytidine، 3TC) .8

يمكن لـ L1 النشط تخليق cDNA خارج الكروماتين ثم إعادة إدخاله في الجينوم المحفز بواسطة ORF1p ، مما يؤدي في النهاية إلى تغيير التعبير عن الجينات الأخرى وينتج عنه أمراض مرتبطة بعدم الاستقرار الجيني. من اللوائح ، مثل تعديل الوراثة اللاجينية وتنظيم عامل الحد من المضيف. الآليات العصبية الأساسية لـ L1 غير واضحة. وقد أظهرت الدراسات أن العوامل (على سبيل المثال ، TREX1 و RB1 و FOXA1) المتعلقة بآلية مراقبة L1 غير فعالة في شيخوخة الخلية ، مما يؤدي إلى تنشيط L1. TREX1 عبارة عن مادة خارجية 3 بوصات تعمل على تحطيم الحمض النووي الغازي الأجنبي وقد ارتبط فقدانه بتراكم L1 cDNA السيتوبلازمي. وقد ثبت أن RB1 يرتبط بالعناصر المتكررة ، بما في ذلك عناصر L1 ، ويعزز تغاير لونها. منظم في الخلايا الشائخة 13 وربطها بالمنطقة الوسطى من L 1 5 'UTR. ينشط L1 المنشط أيضًا استجابة مضاد للفيروسات من النوع الأول (IFN-I) ، مما يؤدي إلى الالتهاب من خلال (كدنا) النسخ العكسي ويحافظ على النمط الظاهري للإفراز المرتبط بالشيخوخة (SASP). لذلك ، كعامل مهم في الالتهاب العقيم الناتج عن الشيخوخة ، يعتبر L1 هدفًا مهمًا لعلاج الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. في الفئران المسنة المعالجة بـ 3TC ، يتحسن تراكم العوامل الالتهابية عن طريق تثبيط النسخ خارج الخلوي لـ L1 في الأنسجة العضلية والأنسجة الأخرى .16 حتى الآن ، فإن دراسات تأثيرات مثبطات النسخ العكسي على وظائف الجهاز العصبي قليلة. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على آلاف المتغيرات من cDNA الجينومي (gencDNA) في أدمغة المرضى المتوفين المصابين بمرض الزهايمر ، نتيجة لإعادة إدخال متغيرات RNA المميزة في الجينوم. تشمل العوامل المسببة لتوليد gencDNAs النسخ وتدمير الحمض النووي والنسخ العكسي والشيخوخة.

أظهرت الدراسات أن عملية تكوين الحمض النووي للجنين يتم حظرها باستخدام مثبطات النسخ العكسي للنيوكليوزيد في خطوط خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) مع أنشطة النسخ العكسي الداخلية .19 علاوة على ذلك ، مرضى الإيدز الذين تزيد أعمارهم عن 65 عامًا والذين يتناولون مثبطات النسخ العكسي نادراً ما يتم تطويره لفترة طويلة .20 لذلك ، فإننا نتوقع أن 3TC ، كمثبط للنسخة العكسية ، قد يكون دواءً محتملاً لعلاج الضعف الإدراكي والأمراض التنكسية العصبية التي تسببها الشيخوخة. تبين أن الفئران المعرضة للشيخوخة 8 (SAMP8) ، كنموذج لدراسة شيخوخة الإنسان والأمراض المرتبطة بالعمر ، تظهر العديد من السمات المعروفة بحدوثها في المراحل المبكرة من الأمراض التنكسية العصبية ، مثل زيادة الإجهاد التأكسدي والتهاب الأعصاب والإدراك. 21 في هذه الدراسة ، لذلك ، تم اختيار SAMP8 الفئران كنموذج حيواني مثالي للأمراض التنكسية العصبية التي تسببها الشيخوخة. ركزنا على التأثيرات المعرفية لـ 3TC على فئران الشيخوخة المبكرة والمسارات الجزيئية المرتبطة بالشيخوخة ، مما قدم دليلًا على دور مثبطات النسخ العكسي في علاج الأمراض التنكسية العصبية بسبب الشيخوخة. طبقنا أيضًا طريقة علم الصيدلة الشبكية للتنبؤ بأهداف 3TC ، وإنشاء شبكات وتحليل الوظائف والمسارات البيولوجية المتعلقة بـ 3TC.

2|القسم التجريبي 2.1 |

الحيوانات 44- تم استخدام الفئران SAMP8 الذكور البالغة من العمر أسبوعًا والفئران R1 (SAMR1) ذات الشيخوخة العادية المتسارعة للشيخوخة والتي قدمتها جامعة Tianjin للطب الصيني التقليدي بعد فترة تأقلم مدتها 1- أسبوع. تمت الموافقة على بروتوكول التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى مقاطعة شاندونغ وتم إجراؤه بناءً على دليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. تم حفظ الفئران في أقفاص معقمة وتم إعطاؤهم طعامًا وماء معقمًا. تم تسجيل أوزان جسم الفئران كل يوم. ويرد مخطط تدفق التجارب التي أجريت في هذه الدراسة في الشكل 1A. عند الانتهاء من التجارب ، تم التخلص من الفئران عن طريق استنشاق ثنائي إيثيل إيثر.

2.2|تحضير وعلاج 3TC

تم تحضير الأدوية حديثًا في يوم كل تجربة. تم إذابة 3TC التي تم شراؤها من MCE (شنغهاي ، الصين) في DMSO إلى تركيز نهائي قدره 2 مليمول / لتر. تم بعد ذلك تخفيف محلول المخزون إلى تركيز العامل باستخدام مياه الشرب مع التركيز النهائي لـ DMSO أقل من 0. 1 بالمائة. تم إنشاء ثلاث مجموعات من الفئران: مجموعة تحكم عولجت بمحلول السيارة (مياه الشرب) ، ومجموعة اختبار عولجت بـ 3TC ، ومجموعة SAMR1 التي تلقت مركبة تستخدم كمجموعة تحكم أخرى للشيخوخة. تلقت مجموعة الاختبار عن طريق الفم 3TC بجرعة 100 مجم / كجم يوميًا. تم تغذية جميع الفئران بالإدارة داخل المعدة لمدة 4 أسابيع (الشكل 1 ب).

الشكل 1 التصميم التجريبي وتأثيرات 3TC على تحسين فقدان الوزن النسبي بسبب علامات الشيخوخة والشيخوخة. (أ) مخطط انسيابي للتجارب الدوائية لدراسة تأثير 3TC على القدرة المعرفية لفئران SAMP8. (ب) عرض تخطيطي لجدول التجربة الحيوانية. (ج) سير العمل المفاهيمي للتنبؤ بالتفاعلات المستهدفة للدواء باستخدام Pharmmapper الذي يوضح ، من اليسار إلى اليمين ، التركيب الجزيئي لـ 3TC ، والرسم التخطيطي الهيكلي ثلاثي الأبعاد لـ 3TC ونموذج الصيدلة المتوقع مع ارتباط 3TC بمستقبلات هرمون الاستروجين مع أعلى مستوى طبيعي عشرات تناسب. (د) نمط نمو وزن الجسم في كل مجموعة من الفئران. (هـ) التغييرات في درجات الدرجات قبل وبعد معالجة 3TC. SAMR1 بالإضافة إلى السيارة: 44- فئران SAMR1 عمرها أسبوع تمت معالجتها لمدة 4 أسابيع. SAMP8 بالإضافة إلى السيارة: 44- فئران SAMP8 عمرها أسبوع تم علاجها لمدة 4 أسابيع. SAMP8 بالإضافة إلى 3TC: 44- تم علاج الفئران SAMP8 القديمة 3TC لمدة 4 أسابيع. اختبار الطالب t: * p <0. 0 5، ** p <0. 01 و *** p <0.001. ns: لا دلالة إحصائية. تمثل العلامات النجمية السوداء مقارنة مع مجموعة المركبات SAMR1 plus. تمثل العلامات النجمية الحمراء مقارنة مع مجموعة المركبات SAMP8 plus. يمثل الخط الأزرق مجموعة SAMP8 plus 3TC في عمر 44 و 48 أسبوعًا.

2.3|نظام درجات الدرجات

تم تقييم درجة الشيخوخة في الفئران باستخدام نظام درجات الدرجات الموصوف سابقًا .22 تحتوي كل فئة من الدرجات على خمسة مستويات ، تتراوح من 0 إلى 4 مع أعلى درجة للدرجة تشير إلى أعلى درجة لشيخوخة الحيوان . تم تقييم الدرجات لكل فئة بشكل منفصل من قبل أربعة من المجربين ذوي الخبرة الذين أعموا عن ظروف العلاج (الجدول التكميلي S1).

.2.4|اختبار متاهة موريس المائية

تم إجراء دراسات متاهة موريس المائية وفقًا لبروتوكول موريس ، بما في ذلك تجربة ملاحة توجيهية وتجارب مسبار .23 كانت المتاهة المائية عبارة عن بركة دائرية (قطرها 120 سم مزودة بمنصة قطرها 10 سم) ومليئة بالماء عند 25 ± 1 درجة. تم تدريب الفئران على العثور على المنصة تحت سطح الماء في غضون دقيقة واحدة. إذا لم يعثر الماوس على النظام الأساسي خلال 60 ثانية ، فقد تم توجيهه إلى النظام الأساسي وسُمح له بالبقاء هناك لمدة 20 ثانية. تم تدريب كل من الفئران خمس مرات في اليوم مع فصل كل منها عن بعضها البعض لمدة 15 دقيقة. في كل تجربة ، كان وضع البداية مختلفًا بترتيب شبه عشوائي. في اليوم السادس من الاختبار ، تمت إزالة المنصة ودخل الحيوان إلى متاهة الماء من نقطة مقابل ربع المتاهة حيث كانت المنصة أثناء التدريب وسمح باستكشاف المتاهة لمدة 60 ثانية. تم تسجيل مسار السباحة ومقدار الوقت الذي قضته الفئران في البحث عن المتاهة بواسطة كاميرا الفيديو وتحليلها باستخدام برنامج EthoVision XT (برنامج Noldus). تتكون كل مجموعة من ثمانية حيوانات على الأقل.

2.5|استخراج الحمض النووي الريبي والكمي PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الحصين والقشرة للفئران بعد العلاجات باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم نسخ كل عينة من الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام) بشكل عكسي لتوليد (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي لـ (كدنا) (تاكارا) ثم تضخيم PCR باستخدام TaKaRa Taq Kit (Takara). تم وصف مجموعات التمهيدي في الجدول التكميلي S2.

2.6|تحضير الأنسجة

تم تخدير الحيوانات باستخدام ثنائي إيثيل إيثر ، وتم جمع أدمغتها بعد نضح عبر القلب بمحلول ملحي معزول بالفوسفات (PBS) ومحلول بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة. تمت إزالة أنسجة المخ وتثبيتها في بارافورمالدهيد لأكثر من يومين. تم دمج الأدمغة الثابتة في البارافين مع أنسجة الحصين مقطوعة بسمك 5 ميكرومتر.

2.7|تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E)

تم تحليل مورفولوجيا الدماغ باستخدام طرق تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E). تم إزالة الشمع من أجزاء البارافين في أنسجة الحصين وتجفيفها بتدرج كحول لسلسلة من التركيزات. تم إجراء تلطيخ HE باستخدام مجموعة تلطيخ H & E (Solarbio) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد غمرها في الإيثانول والزيلين ، تم تركيب المقاطع بالراتنج وتم ملاحظتها تحت المجهر الضوئي (أوليمبوس).

2.8|تلطيخ نيسل

تم استخدام طريقة تلطيخ Nissl (Biyuntian) للكشف عن إصابة الخلايا العصبية في أقسام أنسجة الحصين. تم تحضين المقاطع بصبغة نيسل لمدة 30 دقيقة وغسلها بنسبة 95 بالمائة من الإيثانول. تم عد الخلايا المصبوغة وتصويرها تحت المجهر الضوئي (أوليمبوس). تم حساب الخلايا في ثلاثة حقول غير متداخلة تم اختيارها عشوائيًا في كل شريحة من أنسجة الحصين مع مؤشر البقاء المحدد على أنه عدد الخلايا العصبية الباقية / إجمالي عدد الخلايا العصبية.

2.9|تلطيخ TUNEL

تم تحضين أقسام من أنسجة الحصين بمحلول بروتيناز K لمدة 15 دقيقة متبوعًا بحضانة بخليط تفاعل TUNEL (Beyotime). بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تركيب المقاطع بمحلول تصاعد يحتوي على الصبغة النووية DAPI ولوحظ باستخدام مجهر مضان تقليدي أو مجهر مضان ليزر متحد البؤر.

2.10|بناء قاعدة بيانات الهدف 3TC

تم إنشاء قاعدة البيانات المستهدفة لـ 3TC بناءً على قاعدتي بيانات. أولاً ، تم تحديد الأهداف المحتملة لـ 3TC باستخدام خريطة الجينات الدوائية العكسية بناءً على قاعدة بيانات Pharmmapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). تم تحويل جميع المكونات الكيميائية إلى تنسيق ".mol2" بواسطة Chembiodraw وتحميلها إلى قاعدة بيانات Pharmmapper (الشكل 1C). الجزيئات التي لها نقاط ملائمة طبيعية أكبر من 4. تم تحديد 0 كأهداف محتملة لـ 3TC. ثانيًا ، تم استخدام قاعدة بيانات ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port _ card / CHEMBL141 /) للاستعلام عن الأنشطة البيولوجية للأهداف أو المركبات. تم تحديد البروتينات التي تم التحقق منها على أنها مشتقة من الإنسان العاقل كأهداف محتملة لـ 3TC.

2.11|الهدف تحليل تفاعل البروتين وبناء الشبكة

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0. تم ​​تحديد 4 في الإعداد المصمم بعد إزالة التكرارات.

للتحقيق الشامل في الآليات الجزيئية لـ 3TC ، تم إنشاء شبكات PPI باستخدام الإصدار 3.6 من برنامج Cytoscape. 0 (http://www.cytoscape.org/). تم إجراء تحليل درجة للعقد باستخدام Centiscape 2.2 (http: // apps.cytoscape.org/apps/centiscape) لفحص جينات المحور في الشبكات بقيمة مركزية القرب وقيمة مركزية بين قيمة وقيمة مركزية درجة معيَّنة على {{6 }}. 2 و 450 و 50 على التوالي.

2.12|إثراء وفرز مسارات الإشارات لـ 3TC

تم إجراء تحليل إثراء علم الجينات (GO) بالعمليات البيولوجية والمكونات الخلوية والوظائف الجزيئية للأهداف المحتملة من أجل شرح الوظيفة البيولوجية استنادًا إلى قاعدة بيانات DAVID للمعلومات الحيوية (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). تم شرح مسارات التمثيل الغذائي لـ KEGG بناءً على قواعد بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) باستخدام خادم التعليقات التوضيحية التلقائي KEGG عبر الإنترنت (//www.genome.jp/ kegg /)

2.13|ربط 3TC بالأهداف المتوقعة

تم الحصول على ملفات بنية SDF للمركب 3TC بواسطة موقع Pubchem على الويب (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). تم تحويل ملف SDF إلى ملف PDB بواسطة برنامج OpenBabel2.3.2 ، وتم الحصول على بروتينات المستقبل ADRB2 (PDBID: 3KJ6) و AKT1 (PDBID: 4EKL) و EGFR (PDBID: 6S9C) من قاعدة بيانات بنك بيانات البروتين (www.wwpdb .org). تم استخدام برنامج PYMOL2.3.4 لإزالة الماء والروابط من بروتينات المستقبلات. تم إجراء دراسة الإرساء باستخدام AutoDock Vina (1.1.2) ، وهو برنامج لرسو السفن الجزيئي مفتوح المصدر تم تطويره بواسطة Scripps. تم استخدام برنامج الأدوات لتعديل بروتينات المستقبل الأربعة ، وتم استخدام أمر Grid Box ضمن برنامج الشبكة لفتح أداة خيار الشبكة لتحليل كل بروتين مستقبِل. تم ضبط التباعد الشبكي على 1 ، وتم تعيين مركز الجيب كمركز لموقع التجليد.

2.14|زراعة الخلايا وعلاجها

تم شراء خطوط الخلايا العصبية للحصين في الماوس HT22 من شركة Shanghai Cell Biotechnology Company. تمت زراعة خلايا HT22 في DMEM مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS). تم زرع الخلايا في 6- أطباق جيدة قبل يوم واحد من العلاجات التجريبية. تم تحفيز شيخوخة الخلايا عن طريق الفورمالديهايد (FA) ، الذي تم شراؤه من Sigma-Aldrich ، كما هو موصوف سابقًا. تم تقسيم 24 خلية HT22 إلى ثلاث مجموعات ، بما في ذلك مجموعة FA المعالجة بـ 30 ميكرولتر / لتر FA لمدة 24 ساعة ، FA / 3TC عولجت المجموعة بكل من 30 ميكرو مول / لتر FA و 50 ميكرو مول / لتر 3TC ، ومجموعة التحكم المزروعة بدون FA أو 3TC.

2.15|التألق المناعي والفحص المجهري

تمت إزالة الوسط ، وتم إصلاح الخلايا باستخدام محلول بارافورمالدهيد بنسبة 2 في المائة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم إجراء تجربة التألق المناعي على النحو الموصوف سابقًا .25 تضمنت الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة الجسم المضاد لـ LINE -1 ORF1p (1: 1000 ؛ Sigma-Aldrich) مع الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 594 (1: 1000 ؛ Invitrogen) . تم تحضين الخلايا باستخدام DAPI (تخفيف 1: 500 ؛ Thermo Fisher Scientific) لمدة دقيقة واحدة لتسمية النوى. بعد إضافة عامل تصاعد التبريد المضاد للفلورة ، لوحظت الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر (نيكون). 2.16|تحليل لطخة غربية

تم قياس تعبيرات EGFR و p-AKT1 (Active Akt1: phosphorylated at S473) و ADRB2 عن طريق تحليل اللطخة الغربية. تم جمع البروتين الكلي من الخلايا بعد معالجات مختلفة. تم إجراء لطخة غربية كما هو موصوف سابقًا .26 تضمنت الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة جسمًا مضادًا لـ EGFR (1: 500 ؛ Sigma-Aldrich) ، وهو جسم مضاد لـ pAKT1 (1: 1 000 ؛ Sigma-Aldrich) والجسم المضاد لـ ADRB2 (1: 200 ؛ Sigma-Aldrich) مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب (1: 1،000 ؛ Invitrogen). بعد الغسيل ، تم تطوير البقع باستخدام نظام الكشف عن النشاف الغربي ECL (أميرشام ، أيليسبري ، المملكة المتحدة).

2.17|تحليل البيانات والإحصاء

تم تكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل واعتبرت صالحة مع التجارب التي أظهرت نتائج مماثلة. تم تقديم النتائج على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري (SD). تم تحديد الاختلاف الكبير عن طريق اختبار الطالب t مع p <0. 05.

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950