RNA طويل غير مشفر KCNQ1OT1 ينظم بروتين Kinase CK2 عبر MiR -760 في الشيخوخة وتقييد السعرات الحرارية Ⅱ

3. مناقشة

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 نيوكليوتيدات) ، و miR.NAs الأصغر (21-25 نيوكليوتيدات) [1-3]. تم تحديد KCNO10T1 في البداية على أنه lncRNA ، والذي يعمل على إسكات العديد من الجينات داخل موضع kcng1 عن طريق إنشاء بنية عالية الترتيب من الكروماتين (4 61.الوظائف البيولوجية لـ KCNO1OT1تم الإبلاغ عنها بما في ذلك تلك المرتبطة بـتليف,نقص التروية الدماغية,تصلب الشرايين السكتة الدماغية, تكوين الورم, التمايز العظمي, التئام الكسر، وتضخم القلب(7-13). ومع ذلك ، فإن الآليات التفصيلية التي ينظم بها KCNO10T1 الشيخوخة الخلوية و CR لا تزال غير معروفة. لذلك ، حاولنا توضيح ما إذا كان KCNO10T1 متورطًا في الشيخوخة و CR. توضح هذه الدراسة أن ضربة قاضية KCNO10T1 تسببت في العديد من علامات الشيخوخة الخلوية ، بما في ذلك تحريض نشاط SA -- غال ، وتفعيل مسار 53-21 Cip1 / WAF1 ، وزيادة H3K9 ثلاثي الميثيل المطلوب لتشكيل SAHF وعامل SASP (L {{ 13}} و IL -6 و MMP3) في خلايا سرطان الإنسان HCT116 و MCF -7 (الشكلان 1 و 2 أ). لأن الإجهاد التأكسدي هو سبب مهم للشيخوخة (14،15 تم التحقيق في تأثير KCNO10T1 على توليد ROS. كما هو متوقع ، زاد KCNO1OT knockdown من ROS داخل الخلايا في خلايا HCT116 و MCF -7 (الشكل 2 ب). بالإضافة إلى ذلك ، مستوى KCNO10T1 تم تقليل mRNA في الخلايا المتشيخة التي يسببها LPS ، والتعبير خارج الرحم عن KCNQ10T1 قمع تعبير عامل SASP بوساطة LPS في هذه الخلايا السرطانية (الشكل 3 أ ، ب). علاوة على ذلك ، تسببت ضربة قاضية KCNO10T1 في نشاط SA-B-gal في الرئة الليفية البشرية IMR { {39}} من الخلايا ، وانخفض تعبير KCNO10T1 أثناء الشيخوخة التكرارية في خلايا IMR -90 (الشكل 6). بشكل إجمالي ، تشير هذه النتائج إلى أن KCNO10T1 يعمل بمثابةكاشف مضاد للشيخوخةومضادات الأكسدةفي الخلايا السرطانية البشرية تتشبث بالخلايا الليفية.

انقر هنا لمعرفة المزيد من مكملات Cistanche لمكافحة الشيخوخة

لقد تم إثبات سابقًا أن ضربة قاضية Ck2 تحفز علامات الشيخوخة مثل تلوين SA-gal [16] ، وتفعيل مسار p 53- p21Cip1 / WAF1 (جيل 171ROS [تشكيل 18SAHF (19 لتر ، وتعبير عامل SASP 20]. لذلك ، تم فحص العلاقة بين KCNO10T1 و CK2 وأظهرت هذه الدراسة أن الإفراط في التعبير عن CK2x ألغى علامات الشيخوخة الناتجة عن ضربة قاضية KCNO10T1 (الأشكال 1 و 2 و 6 ب) بالإضافة إلى ذلك ، أدت ضربة قاضية KCNO10T1 إلى خفض مستويات البروتين و mRNA من CK2x (الأشكال 1B و 2A و 4B) ) ، و KCNO10T1 (36 ، 181-37 ، 140) يحفز التعبير المفرط مستوى الرنا المرسال لـ CK2x (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن KCNQ1OT1 يعمل كمنظم إيجابي لـ CK2a في الخلايا. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن lncRNAs يمكنها الإسفنج miRNAs التي تمنع ال تعبير عن مرنا الهدف (1-3]. لأن الدراسات السابقة أظهرت أن miR -760 يتفاعل مع CK2a (21،22] و KCNO10T1 [27] ، وهي شبكة إشارات من KCNO10T1 و CK2x و miR {{ تم فحص 47}}. تُظهر هذه الدراسة أن العلاج الإضافي باستخدام محاكيات miR -760 قمعت KCNQ10T 1- بوساطة زيادة CK2x ، والعلاج الإضافي باستخدام مثبط miR -760 الذي تم كبحه KCNO10T1 بضربة قاضية CK2 بوساطة تقليل التنظيم (الشكل 4). باستمرار ، أدى العلاج باستخدام LPS ، الذي قلل من تعبير KCNO10T1 ، إلى زيادة مستوى miR -760 (الشكل 3C). ومن ثم ، تشير هذه الدراسات إلى أن كمية KCNQ1OT1 RNA يمكنها معايرة miR -760 وبالتالي تنظيم توفر miR -760 للارتباط بـ mRNA لـ CK2x. يمكن لـ KCNO1OT1 و CK2a الحديث المتبادل من خلال قدرة النص على التنافس على ربط miR -760.

لأن CR يوفرتأثير مكافحة الشيخوخة(23] ، تم فحص كيفية تنظيم CR KCNQ1OT1 و miR -760. توضح هذه الدراسة أن حالة CR زادت من تعبير KCNO10T1 و CK2x وانخفضت مستوى miR -760 (الشكل 5 أ ، ب). علاوة على ذلك ، العلاج باستخدام miR -760 يحاكي انتفاخ CK2x بوساطة CR المكبوت (الشكل 5C). باستمرار ، أدت ضربة قاضية KCNO10T1 إلى زيادة مستويات miR -760 ، بينما أعاقت الظروف الإضافية miR بوساطة ضربة قاضية KCNQ10T1 {{19} } الاستقراء (الشكل 5 د). أخيرًا ، أنقذت حالة CR انخفاض التعبير عن KCNO1OT1 و CK2a ، بوساطة الشيخوخة التكرارية (الشكل 6C). إجمالاً ، كشفت هذه النتائج أن حالة CR قللت من تنظيم miR -760 عن طريق تنظيم KCNO10T1 ، أدى إلى انتفاخ CK2x في الخلايا البشرية. على الرغم من أن lncRNA SNHG6 يعمل كإسفنجة من miR -760 في خلايا CRC [25] ، فإن CR لم يغير تعبير SNHG6 في ظل الظروف التجريبية (البيانات غير معروضة). كيف ينظم CR KCNQ1OT1 أظهرت مجموعات أخرى سابقًا أن عوامل النسخ NFY و -catenin تنظم KCNO10T1 (28،29]. ومع ذلك ، لم يستطع CR تنظيم التعبير عن NF-Y و B-catenin على الأقل في ظل الظروف التجريبية (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، يلزم إجراء دراسات إضافية لتحديد منظم معين في المنبع لـ KCNO10T1 في ظروف CR.

في الختام ، بناءً على نتائج هذه الدراسة ، تم اقتراح نموذج لدور KCNQ1OT1 في الشيخوخة و CR. KCNQ1OT1 ينظم CK2 بإسفنجة miR -760. يشارك مسار KCNQ1OT1 – miR -760 - CK2 في الشيخوخة و CR. يتسبب علاج LPS وانقسام الخلايا في الخلايا الليفية في حدوث الشيخوخة عن طريق تقليل تنظيم KCNQ1OT1. يمنع CR الشيخوخة عن طريق تنشيط مسار KCNQ1OT1 – miR -760 - CK2 (الشكل 6 د). لذلك ، تقترح هذه الدراسة أن KCNQ1OT1 كهدف علاجي جديد في أمراض الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر ، بالإضافة إلى علاج بديل يحاكي تأثيرات CR.

4. المواد والطرق

4.1 مواد

4.2 ثقافة الخلية و CR

تم الحصول على خلايا IMR -90 من الخلايا الليفية ثنائية الصبغة البشرية من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بمستوى مضاعف لعدد السكان (PDL) يبلغ 24 خلية. سرطان الثدي البشري MCF {2}} خلايا ، تمت زراعة خلايا سرطان القولون HCT116 (ATCC) وخلايا IMR -90 في وسط Dulbecco المعدّل النسر الذي يحتوي على 10 بالمائة (حجم / حجم) مصل بقري جنيني و 1 بالمائة (ت / ت) بنسلين ستربتومايسين ، في جو رطب 95 بالمائة (حجم / حجم) هواء و 5 بالمائة (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تم حساب PDL لخلايا IMR -90 باستخدام الصيغة PD=log (Nf / Ni) / log2 ، حيث Nf هو رقم الخلية النهائي ، و Ni هو العدد الأولي للخلايا المصنفة. من أجل تجويع الخلايا (تقييد السعرات الحرارية) ، تم غسل الخلايا التي تحتوي على محلول ملحي مخزّن من الفوسفات مرتين وتم تربيتها في محلول ملح إيرل المتوازن (Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مع 5.5 ملي جلوكوز ، بدون أحماض أمينية ، لمدة سبع ساعات.

4.3 استخراج الحمض النووي الريبي والكمي في الوقت الحقيقي PCR ميرنا

4.4 تعداء الحمض النووي وتداخل الحمض النووي الريبي

4.5 SA- مقايسة النشاط -gal

تم غسل الخلايا الموجودة في الثقافات شبه المتكدسة بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات المثلج (PBS) ، وتثبيته بنسبة 3 في المائة (ت / ت) فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 1 0 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ، ثم تم تحضينها باستخدام تلطيخ. محلول يحتوي على 1 مجم / مل 5- برومو -4- كلورو -3- indolyl -D galactoside ، 40 ملي مولار حامض الستريك-فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) ، 5 ملي مولار فيري سيانيد البوتاسيوم ، 5 ملي مولار فيروسيانيد البوتاسيوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2 ملي MgCl لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم حساب الخلايا المصبوغة باللون الأزرق في عشرة حقول على الأقل بتكبير 400 × وتم التعبير عنها كنسبة مئوية من الخلايا الإيجابية.

4.6 قياس مستويات ROS داخل الخلايا

تم استخدام مسبار flfluorescent الحساس للأكسدة CM-H2DCFDA لتقييم مستويات ROS. عولجت الخلايا بـ 5 ميكرومتر CM-H2DCFDA لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام ،ينفصل عن طريق التربسين ، ثم يغسل ببرنامج تلفزيوني. تم ردع شدة الإسفارتم التعدين باستخدام فارز الخلايا Coulter Elite ESP (Beckman Coulter Inc. ، بريا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). التم تعيين بوابات الانتثار الأمامية والجانبية لاستبعاد أي خلايا ميتة من التحليل ؛ على الأقل10 ، تم الحصول على 000 من الأحداث داخل البوابة لكل عينة.

4.7 النسخ العكسي (RT) -PCR

4.8 مناعي

4.9 تحليل احصائي

تم إجراء تحليل أحادي الاتجاه لاختبار التباين للبيانات باستخدام برنامج حزمة SPSS (آي بي إم ، أرمونك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تعتبر النتائج ذات دلالة إذا كانت القيمة الاحتمالية<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 

المواد التكميلية: يمكن تنزيل المعلومات الداعمة التالية على:

مساهمات المؤلف: Y.-SB تصور وصمم التجارب ، وأجرى YL التجارب ، وكتب Y.-SB الورقة. قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل: تم دعم هذا البحث من خلال برنامج أبحاث العلوم الأساسية ، من خلال مؤسسة الأبحاث الوطنية الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (NRF -2019 R1A2C1005219).

بيان مجلس المراجعة المؤسسية: لا ينطبق.

بيان الموافقة المستنيرة: لا ينطبق.

بيان توفر البيانات: لا ينطبق.

تضارب المصالح: يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

مراجع

1. Ulitsky، I .؛ Bartel ، DP lincRNAs: الجينوم والتطور والآليات. الخلية 2013، 154 ، 26-46. [CrossRef] [PubMed]

2. Esteller، M. الحمض النووي الريبي غير المشفر في الأمراض البشرية. نات. القس جينيه. 2011 ، 12 ، 861 - 874. [CrossRef] [PubMed]

3. كوين ، ي. Chang ، HY ميزات فريدة من نوعها للتكوين الحيوي الطويل غير المشفر للحمض النووي الريبي ووظيفته. نات. القس جينيه. 2016 ، 17 ، 47-62. [CrossRef] [PubMed]

4. مانشيني - ديناردو ، د. ستيل ، SJ ؛ ليفورس ، جي إم ؛ إنجرام ، رس ؛ Tilghman ، SM مطلوب استطالة نسخة Kcnq1ot1 للطبع الجينومي للجينات المجاورة. تطوير الجينات. 2006 ، 20 ، 1268-1282. [CrossRef] [PubMed]

5. باندي ، ر. موندال ، تي. محمد ف. إنروث ، إس. ريدروب ، إل. كوموروفسكي ، ياء ؛ ناغانو ، تي. مانشيني ديناردو ، د. Kanduri ، C. Kcnq1ot1 يتوسط الحمض النووي الريبي غير المشفر المضاد للترميز إسكات النسخ الخاص بالنسب من خلال تنظيم مستوى الكروماتين. مول. الخلية 2008 ، 32 ، 232-246. [CrossRef]

6. Kanduri، C. Kcnq1ot1: كروماتين تنظيمي RNA. سيمين. خلية. ديف. بيول. 2011 ، 22 ، 343–350. [CrossRef]

7 - يانغ ف. تشين ، واي. Lv ، J. ؛ وانغ ، واي. تشي ، ح. تشين ، العاشر ؛ جيانغ ، واي. لي ، أ. الشمس ، العاشر ؛ يو ، إي. وآخرون. يخفف إسكات الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر Kcnq1ot1 من التهاب الحموضة والتليف في اعتلال عضلة القلب السكري. ديس موت الخلية. 2018 ، 9 ، 1000. [CrossRef]

8. Yu، S. يو ، م. هو العاشر. ون ، إل. بو ، ض. يعزز Feng، J. KCNQ1OT1 الالتهام الذاتي من خلال تنظيم مسار miR -200 a / FOXO3 / ATG7 في السكتة الدماغية الدماغية. شيخوخة الخلية 2019 ، 18 ، e12940. [CrossRef]

9. Yu، XH؛ دنغ ، ويسكونسن ؛ تشين ، جي. شو ، XD ؛ ليو ، XX ؛ تشين ، إل. شي ، ميغاواط ؛ ليو ، QX ؛ تاو ، م. Ren، K. LncRNA kcnq1ot1 يعزز تراكم الدهون ويسرع تصلب الشرايين عن طريق العمل كرنا عبر محور miR -452-3 p / HDAC3 / ABCA1. ديس موت الخلية. 2020 ، 11 ، 1043. [CrossRef]

10. كاغل ، ب. تشي ، س. نيتور ، إس. كومار ، د. KCNQ1OT1: رنا طويل المنشأ غير مشفر. الجزيئات الحيوية 2021 ،

11، 1602. [CrossRef] 11. Wang، JL؛ وي ، إكس. وانغ ، AG ؛ باي ، واي. ينظم Wu، XJ KCNQ1OT1 التمايز العظمي لـ hBMSC بواسطة محور miR -320 a / Smad5. يورو. القس ميد. فارماكول. علوم. 2020 ، 24 ، 2843-2854. [PubMed]

12. تشين ، إل. شيونغ ، واي. يان ، سي ؛ تشو ، دبليو. إندو ، واي. شيويه ، ح. هو ، واي. هو ، إل. لينغ ، إكس. ليو ، ياء ؛ وآخرون. يسرع LncRNA KCNQ1OT1 التئام الكسر من خلال تعديل محور miR -701-3 p / FGFR3. FASEB J. 2020 ، 34 ، 5208-5222. [CrossRef] [PubMed]

13. تشين ، واي. تشانغ ، زي. تشو ، د. تشاو ، دبليو. ضربة قاضية لـ KCNQ1OT1 تخفف من تضخم القلب من خلال تعديل محور miR -2054 / AKT3. J. ثوراك. ديس. 2020 ، 12 ، 4771-4780. [CrossRef] [PubMed]

14. تشايلدز ، BG ؛ دوريك ، م. بيكر ، دي جي ؛ van Deursen، JM الشيخوخة الخلوية في أمراض الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر: من الآليات إلى العلاج. نات. ميد. 2015 ، 21 ، 1424-1435. [CrossRef]

15. ماكهيو ، د. جيل ، ج. الشيخوخة والشيخوخة: الأسباب والعواقب والسبل العلاجية. J. خلية بيول. 2018 ، 217 ، 65-77. [CrossRef]

16. Ryu، SW؛ وو ، ج. كيم ، YH ؛ لي ، يس ؛ بارك ، جي دبليو ؛ Bae ، YS يرتبط تقليل تنظيم بروتين كيناز CKII بالشيخوخة الخلوية. FEBS ليت. 2006 ، 580 ، 988-994. [CrossRef]

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950