بيروكسيد الدهون الليزوزومية ينظم مناعة الورم

يمكن أن يؤدي تثبيط الليزوزوم بواسطة مثبطات بروتين بالميتويل ثيوستيراز 1 (PPT1) مثل DC661 إلى موت الخلايا، لكن آلية ذلك ليست مفهومة تمامًا. لم تكن مسارات موت الخلايا المبرمجة (الالتهام الذاتي، وموت الخلايا المبرمج، ونخر الخلايا، والتليف الحديدي، والتحلل الحراري) مطلوبة لتحقيق التأثير السام للخلايا لـ DC661. تثبيط الكاثيبين، أو إزالة معدن ثقيل من الحديد أو الكالسيوم، لم ينقذ التسمم الخلوي الناتج عن DC661-. تثبيط PPT1 الناجم عن بيروكسيد الدهون الليزوزومي (LLP) ، مما أدى إلى نفاذية الغشاء الليزوزومي وموت الخلايا التي يمكن عكسها بواسطة مضادات الأكسدة N-acetylcysteine ​​​​(NAC) ولكن ليس عن طريق مضادات الأكسدة الأخرى لبيروكسيد الدهون. كان ناقل السيستين الليزوزومي MFSD12 مطلوبًا للنقل داخل الجسم من NAC وإنقاذ LLP. أنتج تثبيط PPT1 مناعة ذاتية للخلية مع تعبير سطحي عن الكالريتيكولين والذي لا يمكن عكسه إلا باستخدام NAC. قامت الخلايا المعالجة بالتيار المستمر 661- بتحضير الخلايا التائية الساذجة وتعزيز سمية الخلايا التائية. أدت الفئران المحصنة بالخلايا المعالجة بالـ DC661- إلى توليد مناعة تكيفية ورفض للورم في الأورام "الساخنة المناعية" ولكن ليس في الأورام "الباردة المناعية". توضح هذه النتائج أن LLP يؤدي إلى موت الخلايا الليزوزومية، وهو شكل مناعي فريد من نوعه لموت الخلايا، مما يشير إلى الطريق إلى مجموعات عقلانية من العلاج المناعي وتثبيط الليزوزومية التي يمكن اختبارها في التجارب السريرية.

فوائد cistanche tubulosa-Antitumor

مقدمة

مع النشاط المشجع في التجارب السريرية التي تتضمن مثبط الليزوزوم هيدروكسي كلوروكين (HCQ) (1)، وتحديد بروتين بالميتويل ثيوستيراز 1 (PPT1) كهدف جزيئي لمشتقات الكلوروكين (2)، وإطلاق مثبطات PPT1 الجديدة في المجال السريري. في التجارب (3، 4)، هناك حاجة إلى فهم الآلية التي من خلالها تحفز مثبطات الليزوزومية موت الخلايا وتأثير تثبيط الليزوزومية على مناعة الورم. تتضمن الآلية الأساسية لموت الخلايا الليزوزومية الموصوفة لـ HCQ نفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP)، وتسرب الكاثيبين، وتفعيل موت الخلايا المبرمج بوساطة كاسباس (5، 6). لقد أظهرنا سابقًا أن مثبط الليزوزوم DC661 يخترق الخلايا الموجودة في البيئة الدقيقة للورم الحمضي وينتقل إلى الليزوزوم بشكل أكثر كفاءة من HCQ (2، 7). ينتج DC661 موتًا قويًا للخلايا عبر العديد من خطوط الخلايا السرطانية (2). يربط DC661 ويمنع PPT1، ويزيل حمضية الليزوزوم، ويمنع الالتهام الذاتي. يحفز DC661 أيضًا LMP ويزيد من مستويات الكاسبيز المشقوق 3 (2، 7). في السنوات الأخيرة، تم تحديد آليات جديدة لموت الخلايا لها عواقب مناعية وتشمل تنخر الخلايا، وتليف الخلايا، والتهاب الحويصلات الحرارية (8). لقد ثبت أن الالتهام الذاتي المعتمد على الليزوزوم يؤدي إلى تحلل MHC من الدرجة الأولى (9)، بالإضافة إلى مكونات البروتيزوم المناعي (10)، مما يشير إلى أن تثبيط الالتهام الذاتي يمكن أن يعزز معالجة المستضد. ومع ذلك، فإن التأثيرات المناعية لتثبيط الليزوزومية وما تلاها من موت الخلايا لم يتم وصفها بشكل كامل. لمعالجة هذه الفجوة المعرفية، قمنا بدراسة تأثيرات DC661 على آليات موت الخلايا الأساسية لتحديد ما إذا كان موت الخلايا الليزوزومية هو شكل موت الخلايا أو مجرد مقدمة لإحدى الآليات الأخرى الراسخة. لقد وجدنا أن HCQ وDC661 أحدثا زيادة كبيرة في عدد صغير فقط من البروتينات في بروتين سرطان الجلد، وكان معظمها عبارة عن بروتينات مرتبطة بالالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج. مثبطات موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج، نخر الخلايا، التهاب الخلايا الفيروسية، والتهاب الحويصلات الهوائية) لم تخفف من التأثيرات السامة للخلايا بعد ضعف الليزوزومية بواسطة DC661. يعد بيروكسيد الدهون الليزوزومية (LLP) هو المحرك الرئيسي لموت الخلايا الناجم عن LMP المرتبط بتعبير الكالريتيكولين (CALR) على سطح الخلية. لا يمكن عكس هذا النوع من موت الخلايا إلا باستخدام مضادات الأكسدة N-acetylcysteine ​​(NAC). تم ضعف نشاط NAC عن طريق تثبيط مستورد السيستين الليزوزومي MFSD12. أثار LLP أنماطًا مناعية مناعية تشجع على قتل الخلايا التائية. توضح هذه النتائج أن موت الخلايا الليزوزومية هو شكل فريد من أشكال موت الخلايا المناعية.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

نتائج

يؤدي تثبيط الليزوزوم إلى حدوث تغييرات كبيرة في البروتين المرتبط بالبلعمة الذاتية وموت الخلايا المبرمج. لتحديد التأثيرات السامة للخلايا لمثبطات الليزوزوم، قمنا بتقييم مدى جدوى سرطان الجلد A375P، وسرطان القولون RKO، وخطوط خلايا سرطان البنكرياس MIA PaCa-2 المعالجة بمثبط H+-ATPase بافيلوميسين-A1 (1 00 نانومتر)؛ مثبطات PPT1 DC661 (3 ميكرومتر) أو HCQ (10 ميكرومتر أو 30 ميكرومتر)؛ بالميتات تقليد فلوريد السلفونيل السداسيسيل (HDSF ؛ 60 ميكرومتر) ؛ مثبطات الكاثيبين بيبستاتين A (PepA؛ 10 ميكروغرام/مل)، أو E64 (PepA؛ 10 ميكروغرام/مل)، أو PepA+E64؛ ومعطل الغشاء الليزوزومي Leu-Leu ميثيل استر هيدروبروميد (20 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تسبب البافيلوميسين-A1 وDC661 فقط في انخفاض كبير في قابلية الخلية للخلايا عبر خطوط الخلايا السرطانية (الشكل 1A والشكل التكميلي 1A؛ المواد التكميلية متاحة عبر الإنترنت مع هذه المقالة؛ https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1)، مع إنتاج DC661 انخفاض أكثر عمقا في بقاء الخلية من بافيلوميسين-A1. بناءً على هذه البيانات والخصائص الدوائية المشابهة للعقار لمشتقات الكلوروكين، ركزنا دراستنا على مشتقات الكلوروكين كأدوات لفهم موت الخلايا الليزوزومية. تم تطبيق تحليل بروتيني عالمي غير متحيز على خلايا سرطان الجلد A375P التي عولجت بـ DC661 (3 ميكرومتر) أو HCQ الأقل فعالية (10 ميكرومتر أو 30 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. من بين 4264 بروتينًا عالي الثقة، تمت زيادة 87 و55 بروتينًا بشكل ملحوظ باستخدام DC661 (3 ميكرومتر) وHCQ (30 ميكرومتر)، على التوالي؛ بالإضافة إلى ذلك، انخفض بشكل ملحوظ 14 و15 بروتينًا مع DC661 (3 ميكرومتر) وHCQ (30 ميكرومتر)، على التوالي (تغير الطية المطلق أكبر من 2؛ q <0.05) مع DC661 (3 ميكرومتر) أو HCQ (30 ميكرومتر)، على التوالي. ، بالمقارنة مع التحكم في السيارة. لم تظهر الجرعة الأقل من HCQ (10 ميكرومتر) أي تغيرات كبيرة في البروتين مقارنة بالتحكم في السيارة. ارتبطت أفضل 50 بروتينًا تم زيادتها بشكل ملحوظ بعد علاج DC661 بشكل أساسي بالالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج، ولوحظت تغييرات مماثلة بالنسبة للجرعة الأعلى من HCQ (الشكل 1 ب). ولهذه الأسباب، اخترنا أن نركز المزيد من الدراسات على DC661 الأكثر فعالية. من الأمثلة على بعض أكبر التغيرات البروتينية المرتبطة بالالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج: بروتين الربط الضريبي 1 (TAX1BP1؛ زيادة 15- أضعاف)؛ BCL 2- البروتين المتفاعل 3 (BNIP3؛ زيادة 6- أضعاف)؛ جار بروتين جين BRCA1 1 (NBR1؛ زيادة 12-أضعاف)؛ الجسيم العازل -1 (SQSTM1/p62؛ زيادة 5- أضعاف)؛ منشط المستقبل النووي 4 (NCOA4؛ زيادة 3- أضعاف)؛ و LC3B (MAP1LC3B؛ زيادة 3- أضعاف). تم اشتقاق البروتين الدهني B -100 (APOB؛ زيادة 66- أضعاف) من مصل العجل الجنيني ولم تتم دراسته بشكل أكبر. أكدت المناعية أن العلاج باستخدام DC661 أو تركيزات أعلى من HCQ أنتج زيادات ملحوظة في التعبير عن مستقبلات شحن الالتهام الذاتي NBR1 وTAX1BP1 وSQSTM1/p62 وNCOA4 بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت (الشكل التكميلي 1، B وC). قام CRISPR / Cas9 KO من PPT1 في خلايا A375P بنسخ تأثيرات DC661 على هذه البروتينات عند مقارنتها بنظيراتها من WT (الشكل التكميلي 1D). ومع ذلك، فإن التعبير عن مستقبلات شحنة الالتهام الذاتي والزيادات النسبية الناجمة عن علاج DC661 كانت متغيرة عبر سرطان القولون وسرطان البنكرياس وخطوط خلايا سرطان الجلد الأخرى التي يوضح فيها DC661 السمية الخلوية (الشكل التكميلي 1E). يشير هذا إلى أن مستقبلات شحن الالتهام الذاتي نفسها، على الرغم من زيادتها على مستوى البروتين، من غير المرجح أن تكون مسؤولة عن موت الخلايا بعد علاج DC661. لتأكيد ذلك، ركزنا على مستقبلات شحن الالتهام الذاتي TAX1BP1 وBNIP3 لأنها عرفت تأثيرات استباقية في الخلايا السرطانية (الشكل 1C). TAX1BP1 هو محول شحن الالتهام الذاتي (11) وينظم أيضًا موت الخلايا المبرمج الناجم عن مثبطات تخليق البروتين أو العوامل الضارة بالحمض النووي في الخلايا السرطانية (12). ضربة قاضية لـ TAX1BP1 بواسطة سيرنا (الشكل 1D) لم تؤثر على السمية الخلوية الناجمة عن DC 661- على المدى القصير (الشكل 1E) وفحوصات الجدوى طويلة المدى (الشكل 1F). أظهرت هذه النتائج أن TAX1BP1 لا يلعب دورًا أساسيًا في التسمم الخلوي بوساطة DC. BNIP3 هو بروتين مؤيد للاستماتة يضعف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا وينظم عملية التخفيف (13). لم تؤثر ضربة قاضية فعالة لـ BNIP3 (الشكل 1G) على السمية الخلوية الناجمة عن DC 661- (الأشكال 1 وH وI). أظهرت هذه النتائج أن التأثيرات السامة للخلايا لـ DC661 مستقلة عن تعبير BNIP3. بعد ذلك، قمنا بدراسة تأثيرات الخلايا المستنفدة لجينات الالتهام الذاتي الكنسي المطلوبة لإنتاج البلعمة الذاتية على فعالية DC661 عن طريق القضاء على unc-51 مثل الالتهام الذاتي الذي ينشط كيناز 1 (ULK1) والجين المرتبط بالبلعمة الذاتية 7 (ATG7). ضربة قاضية فعالة لـ ULK1 أو ATG7 (الشكل التكميلي 2، A و B) تمنع تدفق الالتهام الذاتي (الشكل التكميلي 2C) ولكنها لم تؤثر على السمية الخلوية الناتجة عن DC 661- (الشكل 1، J – M). أظهرت هذه النتائج أن غياب آلية الالتهام الذاتي الأساسية لا يلغي التأثيرات السامة للخلايا لـ DC661. يؤدي تثبيط الليزوزوم بواسطة DC661 إلى إحداث مسارات متعددة لموت الخلايا المبرمجة. وجهة النظر القانونية هي أن موت الخلايا الليزوزومية يرجع إلى موت الخلايا المبرمج (5). كشفت اللطخة المناعية أن علاج DC661 أدى إلى تنشيط كاسباس -3 و-7 و-9 وانقسام PARP -1، مما يؤكد أن DC661 ينشط موت الخلايا المبرمج (الشكل 2A). منع مثبط عموم كاسباس Z-VAD-FMK تنشيط كاسباس بواسطة DC661 لكنه لم يمنع تراكم LC3B و p62، مما يدل على أن تنشيط موت الخلايا المبرمج وحصار الالتهام الذاتي قابلان للفصل بعد تثبيط الليزوزومية (الشكل 2 ب). لم يؤدي منع موت الخلايا المبرمج باستخدام ZVAD-FMK إلى تعزيز أو الحد من السمية الخلوية لـ DC661، مما يشير إلى أن موت الخلايا المبرمج يمكن الاستغناء عنه لموت الخلايا الليزوزومية (الشكل 2 وC وD). كانت التأثيرات السامة للخلايا لـ DC661 متشابهة في خلايا نخاع العظم الأولية Bax / Bak double-KO غير القادرة على الخضوع لموت الخلايا المبرمج وخلايا WT (الشكل 2E). لم يؤثر حصار موت الخلايا المبرمج على السمية الخلوية التي يسببها DC في سرطان القولون وخلايا سرطان البنكرياس أيضًا (الشكل التكميلي 2، D–F). نظرًا لأننا وجدنا أن موت الخلايا المبرمج يمكن الاستغناء عنه في موت الخلايا الناجم عن DC661-، فقد قمنا بالتحقق مما إذا كان DC661 يحفز نخر الخلايا، وهو شكل آخر من أشكال موت الخلايا المبرمج الذي ينظمه بروتين كيناز الذي يتفاعل مع المستقبلات (RIPK) والبروتين الشبيه بمجال كيناز المختلط ( ملكل). تمت زيادة مستويات الأشكال المفسفرة والمنشطة من RIPK و MLKL بعد علاج DC661 من 0.1-1 ميكرومتر (الشكل 2F). عند 3 ميكرومتر DC661، كان هناك غياب لـ RIPK1 المفسفر ولكن MLKL المفسفر المستمر، مما يشير إلى أنه عند هذا التركيز العالي، يمكن الانخراط في أشكال إضافية من موت الخلايا. المعالجة المسبقة باستخدام مثبطات RIPK1 النكروستاتين-1 أو النكروستاتين-1 أو مثبط MLKL النيكروسلفوناميد منعت الفسفرة من RIPK1 بعد علاج DC661 (1 ميكرومتر) في خلايا سرطان الجلد (الشكل 2G) لكنها فشلت في إنقاذ DC{{192 }} السمية الخلوية المستحثة في خلايا سرطان الجلد (الشكل 2H) أو سرطان القولون أو خلايا سرطان البنكرياس (الشكل التكميلي 2G). تشير هذه النتائج إلى أن التنخر يتم تنشيطه ولكن يمكن الاستغناء عنه في موت الخلايا بوساطة التيار المستمر.

الشكل 1. تثبيط الالتهام الذاتي الليزوزومي يؤدي إلى تغييرات كبيرة في موت الخلايا المبرمج وبروتينات الالتهام الذاتي. (أ)

تعد الليزوزومات أحد مواقع التخزين الرئيسية للحديد. يمكن أن يؤدي خلل استقلاب الحديد داخل الخلايا إلى جانب انخفاض القدرة الاختزالية إلى موت الخلايا غير المبرمج المعروف باسم التصلب الحديدي. السمة المميزة لمرض التصلب الحديدي هي تنظيم سينسيز البروستاجلاندين-إندوبروكسيد 2 (PTGS2)، ومتماثل منظم نقل الكاتيون 1 (CHAC1)، وسيستينيتاز السيستينيل-tRNA (CARS) (14). تم تنظيم كل علامات الإصابة بالحديد الحديدي الثلاثة هذه بشكل نسبي عن طريق علاج DC661 (الشكل 3A)، مما يشير إلى أن تثبيط الليزوزومية يحفز الإصابة بالحديد الحديدي. تسبب DC661 في حدوث تحول مضان في خلايا A375P المعالجة بـ C11-BODIPY، مما يشير إلى بيروكسيد الدهون، وهو سمة من سمات مرض التصلب الحديدي. تم عكس هذا التحول الناجم عن DC 661- بشكل كبير في وجود مثبطات الفيروسستاتين -1 أو روكستاتين الشفاه -1 التي يتم إعطاؤها بتركيز فعال (الشكل 3B والشكل التكميلي 3A)، مما يشير أيضًا إلى أن DC661 الفيروسية المستحثة. ومع ذلك، فإن تثبيط الحديدي لم ينقذ السمية الخلوية المرتبطة بـ DC661 (الشكل 3، C وD). العلاج الكيميائي للخلايا السرطانية باستخدام مخلب الحديد ديفيروكسامين (DFO) و DC661 لم ينقذ السمية الخلوية لـ DC661 (الشكل 3E). العلاج باستخدام الفيروسستاتين -1 أو الشفة روكستاتين -1 أو DFO لم ينقذ تثبيط DC661 للقدرة على البقاء على المدى القصير أو النمو طويل المدى في خلايا سرطان الجلد والقولون والبنكرياس (الشكل التكميلي 3، ب). -ه، والشكل التكميلي 4، أ-د). توضح هذه البيانات أن الخلايا الحديدية يتم تنشيطها ولكن يمكن الاستغناء عنها في موت الخلايا بوساطة DC661-. التهاب الحويصلات الهوائية هو شكل من أشكال موت الخلايا المبرمج المرتبط باستجابة التهابية تتضمن تنشيط الكاسبيزات التي تعالج الجاسترين (GSDM)، مما يسمح بتكوين المسام على غشاء البلازما وإطلاق الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر لاحقًا، مثل الحركة العالية مربع المجموعة 1 (HMGB1). أدى علاج DC661 في خطوط خلايا سرطان الجلد المتعددة (A375P، A375، WM35، وWM793) إلى تنشيط كاسباس البادئ -8 و-9 وكاسباس الجلاد -7، وهو نموذجي لالتهاب الحنجرة، وتم إنتاجه انقسام GSDME كامل الطول، يشبه في حده محفز التهاب الحويصلات الهوائية المعروف PLX4720 وPD0325901 (الشكل التكميلي 5A). أنتج DC661 إطلاقًا أقوى خارج الخلية لـ HMGB1 من محفز التهاب الحنجرة المعروف، وتثبيط BRAF، وMEK في 1% FBS (15)، مما يعكس النتيجة الوظيفية لتنشيط التهاب الحنجرة. بعد ذلك، قمنا باختبار ما إذا كان تثبيط التهاب الحويصلات الهوائية بواسطة GSDME KO من شأنه أن يخفف من التأثيرات السامة للخلايا لـ DC661. العلاج DC661 الناجم عن تراكم LC3II و SQSTM1 / p62 وتفعيل كاسباس، ولكن تم إلغاء إطلاق HMGB1 بالكامل تقريبًا في الخلايا البشرية GSDME-KO WM35، مما يدل على أن النتيجة الوظيفية لتثبيط التهاب الحنجرة قد تحققت (الشكل 3F). ومع ذلك، أنتج علاج DC661 سمية خلوية متساوية في YUMM1.7 WT، وناقلات فارغة (EV)، وخلايا Gsdme KO1 وKO2 في كل من ظروف FBS 10% و1% (الشكل 3G والشكل التكميلي 5B). إحدى النتائج الشائعة للأشكال المتعددة لموت الخلايا هي إطلاق LDH. أنتجت DC661 زيادة كبيرة في إطلاق LDH، وهذا لا يمكن عكسه عن طريق موت الخلايا المبرمج، أو نخر الخلايا، أو تثبيط الفيروس (الشكل التكميلي 5C). أظهرت هذه النتائج أن DC661 يستحث أنماطًا متعددة لموت الخلايا، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والتحلل الحراري بالإضافة إلى نخر الخلايا وتليف الخلايا، ولكن لا يلزم وجود أي من أنماط موت الخلايا هذه من أجل موت الخلايا الناجم عن DC661-. تثبيط الكاثيبسين أو إزالة معدن ثقيل من الكالسيوم لا يمنع موت الخلايا بسبب نفاذية الغشاء الليزوزومي. بعد أن أثبتنا أن تنشيط كاسباس (المطلوب لموت الخلايا المبرمج والتحلل الحراري) يمكن الاستغناء عنه في موت الخلايا الناجم عن DC 661-، افترضنا أن إطلاق الكاثيبين من الليزوزومات يمكن أن يسبب موت الخلايا المعتمدة على الكاسبيز. أدى التثبيط الكيميائي (DC661) أو الوراثي (PPT1 siRNA [siPPT1]) لـ PPT1 إلى إنتاج نفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP)، في حين أن HDSF، وهو مثبط لا رجعة فيه أقل قوة لـ PPT1 والذي ينضب بسرعة في زراعة الخلايا، لا يمكن أن يحفز LMP، كما تم قياسه. بواسطة galectin -3 - نقاط إيجابية (الشكل 4A). يؤدي LMP إلى إطلاق الكاثيبين ومحتويات الليزوزومات الأخرى في السيتوبلازم ويُعتقد أنه سمة قريبة رئيسية لموت الخلايا المعتمدة على الليزوزوم. ارتبط LMP الناجم عن DC661 مع زيادة كبيرة في نشاط الكاثيبين-L السيتوبلازمي، والذي تم حظره بشكل كبير باستخدام مثبط الأنزيم البروتيني السيستين E64 (الشكل 4B). أشارت التقارير السابقة إلى أن إطلاق الكاثيبين من الليزوزومات المكسورة يعزز تنشيط الكاسبيز، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج (16-18). لم يمنع تثبيط الكاثيبين الكامل انقسام كاسباس (الشكل 4C) ولم ينقذ السمية الخلوية الناجمة عن DC 661- في فحوصات الجدوى قصيرة المدى وطويلة المدى في سرطان الجلد (الشكل 4 و D و E) وسرطان القولون والبنكرياس. الخلايا السرطانية (الشكل التكميلي 6، أ-ج). تتعارض هذه النتائج مع النظرة التقليدية لموت الخلايا الليزوزومية على أنها مدفوعة بموت الخلايا بوساطة الكاثيبين. إلى جانب إطلاق الكاثيبين من الليزوزومات المتسربة، فقد تورط إطلاق الكالسيوم من الليزوزومات في الخلل الوظيفي الخلوي عندما يكون PPT1 ضعيفًا (19). أدى العلاج بـ DC661 إلى إطلاق كميات كبيرة من الكالسيوم، والذي تم إلغاؤه عن طريق المعالجة المسبقة لمخلب الكالسيوم الدائم للخلية (Ca2+)، BAPTA-AM. (الشكل 4و). والجدير بالذكر أن BAPTA-AM لم يمنع LMP الناجم عن DC661- (الشكل 4G) أو انقسام الكاسبيز (الشكل التكميلي 6 وD وE)، والأهم من ذلك، أنه لم ينقذ السمية الخلوية الناجمة عن DC661- ( الشكل 4 ح). وقد لوحظت هذه النتائج أيضًا في كل من خطوط الخلايا RKO وMIA PaCa-2، حيث لم تتم ملاحظة أي فروق ذات دلالة إحصائية في قيم IC50 مع BAPTA-AM وDC661 (الشكل التكميلي 6F)، مما يشير إلى أن موت الخلايا المرتبط بـ LMP هو لا تعتمد على الكالسيوم أو الكاثيبين.

الشكل 2. DC661- يسبب موت الخلايا المبرمج ونخر الخلايا. (أ)

الشكل 3. التهاب الخلايا الفيروسية الناجم عن التيار المستمر 661-. (أ)

LLP يدفع LMP. بعد أن أثبتنا أن مثبطات مسارات موت الخلايا الرئيسية (موت الخلايا المبرمج، تنخر الخلايا، التهاب الخلايا الفيروسية، وتحلل الحويصلات الحرارية)، والكاثيبين (PepA وE64)، والمخلبات الأيونية (BAPTA-AM [Ca2+] وDFO [Fe{{3}) }]) لم يمنع موت الخلايا بواسطة DC661 وإيجاد دليل على بيروكسيد الدهون بواسطة C-11-BODIPY، أجرينا تحليلًا عالميًا للدهون بعد 2 و 4 ساعات من علاج DC661. تسبب DC661 في زيادة مبكرة ومستمرة 3- إلى 10- أضعاف في كل فئة من الليسوفوسفوليبيد (الشكل 5A). في المقابل، شوهدت تغييرات قليلة أو معدومة في فئات الفسفوليبيد، بما في ذلك فسفاتيديل كولين، فسفاتيديل إيثانولامين، فسفاتيديل سيرين، فسفاتيديلينوسيتول، فسفاتيديل الجلسرين، وحمض الفسفاتيديك (الشكل التكميلي 7A). يمكن إنشاء أنواع الليسوفوسفوليبيد بواسطة ROS، الذي يعمل على أكسدة سلسلة الأحماض الدهنية المشبعة التي يتم تقطيعها بعد ذلك بواسطة الفوسفوليباز (20). لتحديد ما إذا كانت مضادات الأكسدة يمكن أن تمنع تلف الدهون بوساطة ROS، قمنا بالتحقق من السمية الخلوية الناجمة عن DC 661- في وجود زبال ROS N-acetylcysteine ​​​​(NAC) (21، 22) ومثبطات بيروكسيد الدهون المفترضة Trolox (23 ) وفيتامين ج (حمض الأسكوربيك) (24، 25). على عكس أي من العوامل الأخرى التي تم اختبارها حتى الآن، أنقذ العلاج الكيميائي باستخدام NAC السمية الخلوية المرتبطة بـ DC 661- عبر خطوط خلايا متعددة (الشكل 5B والشكل التكميلي 7B). أظهرت فحوصات CFU طويلة المدى أن NAC، على عكس جميع مثبطات موت الخلايا، ومخلبات الأيونات، ومثبطات الكاثيبين التي تم اختبارها هنا، منعت التأثيرات السامة للخلايا لـ DC661 في خلايا A375P وRKO وMIA PaCa-2 وB16F10 وMC38 ( الشكل 5C والشكل التكميلي 7C). ومن المثير للاهتمام أن Trolox وفيتامين C لم ينقذا السمية الخلوية DC661 في سرطان الجلد البشري وسرطان القولون والمستقيم وخلايا سرطان البنكرياس وسرطان الجلد الفئران وخلايا سرطان القولون والمستقيم (الشكل 5D والشكل التكميلي 7، D – H). دفعنا هذا التفاوت إلى اختبار ما إذا كان NAC وTrolox وفيتامين C يؤثران على LMP. أظهرت نتائجنا أن NAC هو مضاد الأكسدة الوحيد الذي قلل بشكل كبير من LMP الناجم عن DC 661- (الشكل 5E). لقد افترضنا أن LLP يدفع إنتاج LMP بواسطة DC661، والذي قد يتم إرجاعه بواسطة NAC ولكن ليس بواسطة Trolox وفيتامين C. لدراسة عملية LLP استخدمنا مسبار الفلورسنت FOAM-LPO (26)، والذي يتحول على وجه التحديد إلى الليزوزوم وينتج تحول طيفي من 586 إلى 512 نانومتر (أحمر إلى أخضر) عند تعرضه لبيروكسيدات الدهون. لقد وجدنا أن DC661 المستحث LLP مقارنة مع التحكم (الشكل 5F). قام NAC بخفض بيروكسيد الدهون في الجسيمات الحالة لخلايا سرطان الجلد المعالجة بالتيار المستمر، في حين فشل ترولوكس وفيتامين C في تقليل LLP (الشكل 5F). لم يكن لـ NAC وTrolox وفيتامين C بمفردهم أي تأثير كبير على بيروكسيد الدهون. ضربة قاضية لـ PPT1 (الشكل التكميلي 8A)، أو العلاج بتركيزات عالية من HCQ (الشكل التكميلي 8B) تسبب أيضًا في LMP الذي يمكن عكسه بواسطة NAC، في حين أن التثبيط الكيميائي لـ ULK1 لم يحفز LMP (الشكل التكميلي 8C). الأهم من ذلك أن ضربة قاضية siPPT1 تضمنت أيضًا LLP الذي يمكن عكسه باستخدام NAC (الشكل التكميلي 8D) وأظهرت هذه النتائج أن تثبيط PPT1 يحفز LLP الذي يمكن إنقاذه بواسطة NAC ومن المحتمل أن يكون سبب LMP الناجم عن تثبيط PPT 1- . علاوة على ذلك، تشير هذه النتائج إلى أن LLP أمر بالغ الأهمية لموت الخلايا الليزوزومية.

نبات السيستانش الصيني – مضاد للأورام

استيراد السيستين إلى الليزوزومات بواسطة MFSD12 يخفف من موت الخلايا الليزوزومية. من بين مثبطات بيروكسيد الدهون الثلاثة، منع NAC فقط LLP. أظهر تقرير حديث أن مجال فصيلة الميسر الرئيسي الذي يحتوي على 12 (MFSD12) هو عنصر أساسي في مستورد السيستين للليزوسومات والميلانوزومات (27). لقد فكرنا في أن NAC، أو مستقلبه السيستين، يتم نقله إلى الليزوزوم من خلال MFSD12، حيث يتأكسد السيستين إلى ثاني كبريتيده، السيستين. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بمقارنة قدرة NAC على إنقاذ السمية الخلوية DC661 في خلايا siNT وsiMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. أظهرت نتائجنا أن NAC أنقذ DC 661- LMP المستحث في خلايا siNT لكنه لم ينقذ LMP في خلايا siMFSD12 (الشكل 6A). قام NAC بتخفيض LLP لخلايا siNT-A375P DC 661- المعالجة ولكن ليس خلايا siMFSD12. زادت خلايا siMFSD12 التي عولجت بـ DMSO أو NAC من LLP القاعدي (الشكل 6B) مقارنة بخلايا siNT. بينما أنقذ NAC السمية الخلوية DC661 في خلايا siNT، تم إلغاء قدرة NAC على إنقاذ السمية الخلوية DC661 بالكامل في خلايا siMSFD12 (الشكل 6C). أظهر هذا أن ضربة قاضية MFSD12 تمنع التأثيرات الوقائية للخلايا لـ NAC ضد DC661. يتم نزع أسيتيل NAC بواسطة الأسيليز في العصارة الخلوية (28). لتحديد ما إذا كان علاج NAC ينتج تراكمًا للسيستين أو السيستين داخل الليزوزومات، استخدمنا تقنية الترسيب المناعي الليزوزومي (Lyso-IP) (29) لتنقية الليزوزومات من خلايا DMSO وخلايا A375P المعالجة بـ NAC (الشكل 6D والشكل التكميلي 9A) وأجرينا الأيضات المستهدفة لتحديد كمية NAC والأيضات ذات الصلة. كما هو متوقع ، تم اكتشاف NAC في محلول الخلية الكاملة المعالج بـ NAC والكسور غير المرتبطة المرتبطة بها. تمت زيادة مستويات L- سيستين بشكل كبير داخل الليزوزومات المعالجة بـ NAC. كان L-cystine قابلاً للاكتشاف فقط داخل الليزوزومات المعالجة بـ NAC. ومن المثير للدهشة أننا لم نجد زيادة كبيرة في الجلوتاثيون (المخفض) في المجموعات المعالجة بـ NAC (الشكل 6E)؛ كان هذا مفاجئًا لأنه من الشائع أن علاج NAC يؤدي إلى زيادة إنتاج الجلوتاثيون، مما يصحح توازن الأكسدة والاختزال. تشير هذه النتائج إلى أن السيستين المستورد إلى الليزوزومات من خلال مستورد MFSD12 أمر بالغ الأهمية لإنقاذ LLP وLMP وموت الخلايا الليزوزومية. LLP مناعي. تم تحديد بعض أشكال موت الخلايا المنظم الناجم عن DC661 (داء الحويصلات الحرارية، تنخر الخلايا، داء الخلايا الحديدية) على أنها مناعية. في السابق، تم وصف موت الخلايا المناعية لأدوية العلاج الكيميائي بناءً على السمات المميزة، والتي تشمل عرض الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر، بما في ذلك التعبير عن سطح الخلية لـ CALR وإطلاق بروتين HMGB1 وأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) (30). يعمل CALR كإشارة "أكلني" عند تعرضه لأسطح الخلايا أثناء إجهاد الخلية. يعمل الإطلاق خارج الخلية لـ HMGB1 وATP كإشارة "ابحث عني" التي تتعرف عليها الخلايا البلعمية. قمنا بمقارنة نموذجين: خلايا B16F10، التي تكون في نماذج الورم المسانجي خالية تمامًا تقريبًا من الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم، وخلايا MC38، التي تحتوي في نماذج الورم المسانجي على خلايا ليمفاوية متسللة للورم. أولاً، أثبتنا أن علاج DC661 أو siPpt1 يحفز بشكل كبير تعبير CALR السطحي الذي يمكن إلغاؤه بالكامل باستخدام معالجة NAC في خلايا MC38 (الأشكال 7 وA وB). وقد لوحظت نتائج مماثلة في خلايا B16F10 (الشكل 7C). فشلت مثبطات مسارات موت الخلايا الرئيسية (موت الخلايا المبرمج، نخر الخلايا، التهاب الخلايا الفيروسية، والتهاب الحنجرة) في منع التعبير السطحي لـ CALR (الشكل 7D). لتحديد ما إذا كان موت الخلايا المناعية الناجم عن DC661 يرجع إلى تنظيم MHC من الدرجة الأولى، تمت معالجة الخلايا B16F10 وMC38 باستخدام DC661 (3 ميكرومتر) أو DMSO لمدة 24 ساعة. لقد وجدنا أن العلاج DC661 لم يزيد من التعبير عن MHC من الدرجة الأولى وانتفاخ البروتينات المناعية (الشكل 7E والشكل التكميلي 9، B وC).

الشكل 4. تثبيط الكاثيبسين أو إزالة معدن ثقيل من الكالسيوم لا يمنع موت الخلايا الناجم عن DC661-. (أ)

لفهم آثار تثبيط الالتهام الذاتي على تحضير الخلايا التائية، أجرينا تجربة تحضيرية وزراعة في المختبر باستخدام الخلايا الطحالية C57BL6/J كما هو موصوف سابقًا (31). من أجل التحضير، قمنا بتعريض الخلايا الطحالية إلى خلايا DC 661- أو خلايا B16F10 أو MC38 المعالجة بـ DMSO. بعد ذلك، تم استزراع هذه الطحال معبي مع خلايا B16F10 أو MC38 الحية، وتم قياس السمية الخلوية (الشكل 8A). أنتجت الخلايا الطحالية المجهزة بخلايا B16F10 المعالجة بالتيار المستمر زيادة ملحوظة في الإنترفيرون مقارنة مع الخلايا الطحالية المعرضة لخلايا B16F10 المعالجة بـ DMSO. تمت زيادة القتل بوساطة الخلايا التائية المجهزة للخلايا B16F10 المتكاثرة بشكل ملحوظ في الخلايا الطحالية المجهزة بالتيار المستمر 661- عند مقارنتها مع الخلايا الطحالية المجهزة بـ DMSO (الشكل 8، B وC). أنتجت خلايا MC38 التي عولجت بـ DC661 المزيد من السمية الخلوية للخلايا التائية IFN والمجهزة بالمقارنة مع الخلايا B16F10 (الشكل 8 وD وE). كان العلاج الكيميائي NAC مع DC661 قادرًا على إلغاء إطلاق IFN تمامًا من الخلايا الطحالية والسمية الخلوية للخلايا التائية (الشكل 8 وF وG). ضربة قاضية للكالريتيكولين بواسطة siCalr في خلايا MC38 (الشكل التكميلي 9D) ألغت فعالية فتيلة علاج DC661 وخفضت بشكل كبير السمية الخلوية للخلايا التائية (الشكل 8 و H و I). مجتمعة، تدعم هذه البيانات الدور الميكانيكي لتنظيم CALR المرتبط بـ LLP في تعزيز مناعة الخلايا التائية المضادة للأورام. بعد ذلك، قمنا بتوسيع هذه النتائج في المختبر إلى دراسة التطعيم ضد الأورام في الجسم الحي في نماذج الفئران ذات الكفاءة المناعية والعوز المناعي. بالنسبة لهذا الاختبار، تم حقن خلايا B16F10 أو MC38 المذابة بالتجميد أو DC 661- في المختبر على الجانب الأيسر لحماية الفئران ذات الكفاءة المناعية C57BL/6 أو NOD/SCID ضد إعادة التحدي مع الخلايا السرطانية الحية من نفس النوع المحقون بعد 7 أيام في الجهة اليمنى (الشكل 9A). فشلت خلايا B16F10 المعالجة بـ DC 661- في منع رفض الورم على الرغم من فحوصات المختبر، مما يشير إلى أن DC661 تسبب في موت الخلايا المناعية (الشكل 9B والشكل التكميلي 9E). في المقابل، فإن تلقيح أحد الجانبين بخلايا MC38 المعالجة بالتيار المستمر عزز الرفض الكامل لخلايا MC38 الحية المزروعة على الجانب المقابل (الشكل 9C والشكل التكميلي 9F). لتحديد ما إذا كانت المناعة التكيفية حاسمة بالنسبة لتأثير اللقاح DC661 على أورام MC38، كررنا التجربة على فئران NOD/SCID. ومن المثير للدهشة أننا وجدنا أن خلايا MC38 المعالجة بالتيار المستمر لم تسبب رفضًا لأورام إعادة التحدي في فئران NOD/SCID التي تعاني من عوز المناعة (الشكل 9D والشكل التكميلي 9G)، مما يشير إلى أن المناعة التكيفية كانت مطلوبة لتأثير اللقاح الملحوظ. لاختبار قوة هذه النتيجة، اخترنا خطًا آخر معروفًا لخلايا سرطان الفئران المناعية، CT26، وقمنا بإجراء تجربة التطعيم على النحو الوارد أعلاه. كما هو متوقع، فإن زرع خلايا CT26 المعالجة DC 661- في أحد جوانب الفأرة أنتج تأثيرًا يشبه اللقاح ومنع نمو خلايا CT26 الحية المزروعة على الجانب الآخر (الشكل 9E والشكل التكميلي 9H). تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن LLP الناجم عن DC 661- أمر بالغ الأهمية لموت الخلايا المناعية بوساطة LMP، والذي يتم عكسه عن طريق استيراد السيستين إلى الليزوزوم بواسطة ناقل الليزوزوم MFSD12 (الشكل 9F).

مناقشة

يبدو أن تثبيط الليزوزوم هو نهج علاجي واعد في الدراسات قبل السريرية، وقد أنتجت التجارب السريرية لـ HCQ نتائج مشجعة ولكن مختلطة (1، 32). PPT1 هو الهدف الجزيئي لـ HCQ، ومثبطات PPT1 الأكثر فعالية، مثل DC661 (2) وGNS561 (3)، تحفز موت الخلايا بوساطة LMP في المختبر. لم يتم توضيح الآلية الدقيقة لموت الخلايا الليزوزومية ودورها في مناعة الورم بشكل كامل. يتم تعزيز المناعة المضادة للأورام عندما يتم دمج تثبيط الالتهام الذاتي مع العلاج المناعي (9، 10، 31). تشمل الآليات المقترحة للمناعة الذاتية للخلية بعد تثبيط الالتهام الذاتي الفئة الأولى من التوافق النسيجي الكبير (MHC) وتنظيم البروتينات المناعية، وكلاهما يدعم تحسين معالجة المستضد وعرضه. بالإضافة إلى ذلك، أدى فقدان بروتينات الالتهام الذاتي أو تثبيط الالتهام الذاتي بواسطة الكلوروكين إلى زيادة استجابة الخلايا التائية CD8+ عن طريق زيادة مستويات سطح MHC من الدرجة الأولى في الخلايا الجذعية (33). لقد أظهرنا سابقًا أن تثبيط PPT1 النظامي يمكن أن يعيد استقطاب البلاعم من النمط الظاهري M2 إلى M1. يمكن لمثبطات PPT1 أن تعزز مستويات STING، مما يؤدي إلى إطلاق IFN وزيادة القتل بوساطة الخلايا التائية في نماذج سرطان الجلد (31). هنا، أثبتنا أن LLP نفسه ينتج شكلاً مناعيًا جوهريًا للخلايا السرطانية لموت الخلايا. لقد وجدنا أن تثبيط الليزوزوم أدى إلى تغيرات قليلة جدًا في البروتين في الخلايا السرطانية، وشملت البروتينات الأكثر ارتفاعًا بشكل ملحوظ مستقبلات شحن الالتهام الذاتي ومنظمات موت الخلايا المبرمج. أظهر نهجنا الذي يستهدف بعض هذه الجينات عبر الوظائف أن البروتينات التي يسببها الدواء لم تكن على الأرجح هي المنظمين الرئيسيين لموت الخلايا. التثبيط الوراثي لـ ULK1 أو ATG7 أيضًا لم ينقذ السمية الخلوية DC661. لقد أثبتنا أن تثبيط الليزوزوم ينشط أشكالًا متعددة من موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج، ونخر الخلايا، والتليف الحديدي، والتحلل الحراري، ولكن كل واحدة منها كانت قابلة للاستغناء عن السمية الخلوية الناجمة عن المخدرات. تجدر الإشارة إلى أن آليات موت الخلايا المبرمجة يمكن أن تتداخل وأن الاستهداف المشترك لآليات موت الخلايا المتعددة يمكن أن يوفر الحماية الخلوية ضد موت الخلايا بعد نفاذية الغشاء الليزوزومي. لقد استبعد عملنا الآليات المعتمدة على الكاثيبين والكالسيوم لموت الخلايا الليزوزومية وسلط الضوء على أهمية LLP كمحدد حاسم لموت الخلايا. لقد وجدنا دليلاً على LLP الذي كان قابلاً للعكس بواسطة مضادات الأكسدة التي تم نقلها إلى الليزوزوم، NAC وكان حاسمًا لنفاذية الغشاء الليزوزومي والسمية الخلوية. كان NAC هو العامل الوحيد القادر على تخفيف أو عكس موت الخلايا الناجم عن التيار المستمر 661-، وكانت هذه القدرة تعتمد على وجود ناقل السيستين الليزوزومي MFSD12. من المحتمل أن يكون الافتقار إلى اختراق الليزوزوم هو سبب عدم قدرة مثبطات بيروكسيد الدهون المفترضة الأخرى، مثل ترولوكس وفيتامين C، على منع السمية الخلوية لـ DC661. يتم تحويل NAC إلى السيستين، الذي يتم استيراده إلى الليزوزومات ويتأكسد إلى شكل ثاني كبريتيد، السيستين. يتم تصدير السيستين إلى العصارة الخلوية عن طريق ناقل ليسوسومي آخر، وهو داء السيستين، حيث يتم اختزاله إلى السيستين الذي يعيد تعبئة مصادر المغذيات الداخلية، ويعيد تنشيط هدف مجمع الرابامايسين 1، ويعزز الالتهام الذاتي (34). يمكن أن تكون دورة الأكسدة والاختزال من السيستين إلى السيستين (الليزوزومات) والعودة إلى السيستين (السيتوسول) آلية إنقاذ محتملة لـ NAC ضد السمية الخلوية DC661 أو الإصابة الليزوزومية الأكثر عمومية عبر سياقات مرضية أخرى حيث أثبت NAC أنه مفيد علاجيًا (35) . لم يعكس NAC فقط LLP و LMP الناجم عن DC 661- ولكن أيضًا تعبير سطحي عن علامة موت الخلايا المناعية كالريتيكولين. كان التعبير عن سطح الخلية لبروتين CALR مطلوبًا من أجل السمية الخلوية المعززة بوساطة الخلايا التائية الناجمة عن الخلايا الطحالية المجهزة بالتيار المستمر 661-، مما يدل على أن تثبيط الليزوزوم ينتج شكلاً محددًا من المناعة الذاتية للخلية.

في حين أظهرت الدراسات السابقة أن تثبيط الليزوزوم يمكن أن يعزز النشاط المضاد للأورام لتثبيط نقاط التفتيش المناعية في أورام الخاصرة المثبتة (9، 31)، فإن دراستنا هي الأولى على حد علمنا التي تثبت تأثيرًا شبيهًا باللقاح لأورام MC38 ولكن ليس أورام B16 في الخلايا السرطانية المعالجة بـ DC661 قبل الزرع. يوضح هذا أن موت الخلايا الليزوزومية يمكن أن يحفز توليد المناعة داخل الخلية، ولكن هذه التغييرات في حد ذاتها ليست كافية على الأرجح لعكس البيئة الدقيقة للورم "الباردة المناعية" إلى بيئة دقيقة للورم "ساخنة مناعية". أظهرت دراساتنا السابقة في نماذج البيئة المكروية للورم "الباردة المناعية" B16 وBRafCA PtenloxP Tyr: نماذج الفأر المعدلة وراثيًا CreERT2 (31) أن تثبيط الليزوزوم الجهازي أنتج تأثيرات على البلاعم المرتبطة بالورم والخلايا الكابتة المشتقة من الخلايا النخاعية والتي كانت كافية لتعزيز فعالية العلاج المناعي. قد يكون الأمر أن المناعة الذاتية للخلية تلعب أيضًا دورًا في أورام البرد المناعية التي تصبح أكثر استجابة للـ ICD بعد تثبيط الليزوزومية. إن التأثير الشبيه باللقاح لتثبيط الليزوزوم الذي لوحظ في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة قد يترجم أو لا يترجم إلى العيادة، ولكنه يمكن أن يفسر سبب كون بعض المرضى الذين عولجوا بالدابرافينيب والترامتينيب وHCQ في سرطان الجلد المتحول الذي تم علاجه سابقًا بـ BRAF يتمتعون بمثل هذا التأثير العميق والمتين. الرد على هذا النظام (32). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لفهم كيف يؤدي تثبيط PPT1 إلى إنتاج ROS الليزوزومي وبيروكسيد الدهون. إن التنظيم المعتمد على PPT1- لـ V-ATPase والتحمض الليزوزومي ليس تفسيرًا كافيًا لأن البافيلوميسين يثبط تحمض الليزوزومي ولكنه لا ينتج LMP (البيانات غير معروضة). تشير الآثار المترتبة على هذه النتائج إلى أن مثبطات الليزوزومية التي تعزز المناعة الذاتية للخلايا السرطانية يمكن دمجها بشكل عقلاني مع العلاجات التي تعزز تنشيط الخلايا التائية، أو التسلل إلى البيئة الدقيقة للورم، مما قد يؤدي إلى تأثيرات تآزرية.

الشكل 5. N-أسيتيل السيستين يمنع DC 661- موت الخلايا الناجم. (أ)

طُرق

زراعة الخلايا. Human A375P (CRL-3224)، RKO (CRL-2577)، DLD-1 (CCL- 221)، MIA PaCa-2 (CRL-1420 ) ، A549 (CRM-CCL -185)، والماوس B16F1 0 (CRL -6475) تم شراء خطوط الخلايا من ATCC. تم الحصول على خطوط Human A375 (CRL -1619، ATCC)، وWM35، وWM793، والماوس YUMM1.7 (WT، وGsdme EV، وGsdme KO1 وKO2) داخليًا. تم توفير خلايا Mouse MC38 وCT26 بواسطة آندي مين، جامعة بنسلفانيا. تم الحصول على خلايا نخاع العظم الأولية FL5.12 و IL -3 - المعتمدة على Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) من كاثرين إي ويلين، جامعة بنسلفانيا. تم توفير خط الخلايا Panc -1 (CRL -1469، ATCC) البشري بواسطة Ben Z. Stanger، جامعة بنسلفانيا. تم الحصول على خط خلايا الماوس YUMMER 1.7 من Xiaowei (George) Xu، جامعة بنسلفانيا. تم اختبار جميع خطوط الخلايا بحثًا عن الميكوبلازما مرتين سنويًا من قبل المرافق الأساسية بجامعة بنسلفانيا وتم التحقق من صحتها باستخدام بصمات الأصابع المتكررة القصيرة من قبل معهد ويستار لعلم الجينوم. تمت زراعة خطوط الخلايا A375P و RKO و DLD -1 و A549 و CT26 و FL5.12 و Bax / Bak DKO في RPMI 1640 (Invitrogen، 11875)؛ تمت زراعة خطوط الخلايا A375 و MIA PaCa -2 و Panc -1 و B16F10 و MC38 في DMEM (Invitrogen، 11995)؛ وYUMMER1.7 وYUMM1.7 WT وGsdme EV وGsdme KO1 وKO2) تمت زراعة الخلايا (15) في DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). تم استكمال وسائط الثقافة بـ 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (12306C، MilliporeSigma) و1 × محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي (Gibco، 15140-122). تم الحفاظ على خطوط الخلايا FL5.12 وBax/Bak DKO في وسائط RPMI كاملة مكملة بـ 50 ميكرومتر - مركابتويثانول (تقنيات الحياة، 21985-023)، 10 ملم HEPES (H3537، MilliporeSigma)، و 0.35 نانوغرام / مل و 3.5 نانوغرام /mL IL-3، على التوالي. تمت المحافظة على خطوط الخلايا YUMMER1.7 و YUMM1.7 (WT و Gsdme EV و Gsdme KO) في وسائط كاملة مكملة بـ 1 × MEM NEAA (Gibco، 11140-050). تم استزراع خلايا WM35 وWM793 في وسائط MCDB 153 (MilliporeSigma، M7403)، التي تحتوي على 10٪ FBS في 1 × Leibovitz L -15 وسط (Corning، 10-045-CV)، 7.5٪ وزن / حجم بيكربونات الصوديوم ( كورنينج، 25-035-CI)، 1 × محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (Gibco، 15140-122)، و5 ميكروغرام/مل من الأنسولين (MilliporeSigma، I0516). نمت الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة وبوجود 5% ثاني أكسيد الكربون. المواد الكيميائية والكواشف. وشملت المواد الكيميائية التي تم شراؤها كبريتات HCQ (Spectrum Chemicals, 747-36-4) وDC661 (Seleckchem, S8808). تم استخدام Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) لصبغ الخلايا بحثًا عن الكالسيوم وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم توفير قائمة بالأجسام المضادة والمثبطات في الجدول التكميلي 1 والجدول الإضافي 2.

الشكل 6. تقوم NAC بعكس LLP بطريقة تعتمد على MFSD12-. (أ-ج)

استخراج البروتين وهضمه للتحليل اللوني السائل – تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي للبروتينات. {{0}}.7 × 106 تم استزراع خلايا سرطان الجلد A375P في أطباق استزراع 60 مم. تمت معالجة الخلايا باستخدام DMSO (التحكم)، DC661 (3 ميكرومتر)، HCQ (1 0 ميكرومتر)، أو HCQ (3 {{7 0}} ميكرومتر) لمدة 24 ساعة عند حوالي 5 {{ 112}}% التقاء. تم تحلل كريات الخلايا المجمدة بـ 5 0 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4، 1٪ ​​SDS، 15 0 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EDTA، 0.15 ملي مولتر PMSF، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين، و1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين. تم تحليل المحللات الموضحة (10 ميكروغرام لكل منهما) بمقدار 0.5 سم في هلام مكرر متبوعًا بالتثبيت والتلطيخ باستخدام Coomassie الغروية. تم استئصال كل حارة هلامية بحجم 0.5 سم، وإزالتها، وتخفيضها باستخدام فوسفين تريس (2- كربوكسي إيثيل) ، وألكيل باستخدام اليود أسيتاميد ، وهضمها باستخدام التربسين كما هو موضح سابقًا (36). تم تحليل الملخصات (1 ميكروغرام) بواسطة التحليل اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) على مطياف الكتلة Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) بما يتماشى مع nanoAQUITY UPLC (المياه). تم إجراء الفصل التحليلي على عمود 1.7 ميكرومتر × 250 مم من الببتيد BEH C18 (ووترز، 186003546) باستخدام تدرج دقيق 245- مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء (المرحلة المتنقلة A) والأسيتونيتريل (المرحلة المتنقلة B) على النحو التالي : 5%–30% B خلال 225 دقيقة، 30%–80% B خلال 5 دقائق، 15-الثبات لمدة دقيقة عند 80% B، والعودة إلى الأوضاع الأولية. تم الحصول على أطياف MS الكاملة بدقة 70،000، مع نطاق مسح يبلغ 400-2،000 م/ض، وهدف تحكم تلقائي في الكسب يبلغ 3 × 106 أيونات، وأقصى وقت للحقن يبلغ 50 مللي ثانية. تم الحصول على أطياف MS2 المعتمدة على البيانات لأفضل 20 أيونًا وفرة بدقة 17500، مع عرض عزل قدره 1.5 م/ض، وهدف التحكم التلقائي في الكسب 5 × 10 أيونات، والحد الأقصى لوقت الحقن 50 مللي ثانية. تم ضبط تطابق الببتيد على المفضل، وتم رفض الأيونات غير المخصصة والمشحونة بشكل فردي (37). تم تحليل بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد الخام باستخدام MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) مع قاعدة بيانات التسلسل البشري Uniprot (تم الوصول إليها في 10 أكتوبر 2019) وقاعدة بيانات الملوثات الشائعة، بما في ذلك التربسين والكيراتين والبروتينات البقرية. والميكوبلازما (38). تم استخدام خصوصية الببتيد التريبتي بحد أقصى 2 انقسامات ضائعة، وتعديل ثابت على السيستين (كارباميدوميثيليشن)، وأكسدة الميثيونين المتغير أو أستلة الطرف N في البحث (39). تم استخدام قطع 1% فرانكلين روزفلت للببتيدات والبروتينات. تم تمكين المباراة بين أشواط؛ تم قياس كمية البروتينات باستخدام الكميات الخالية من الملصقات (40). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام بيرسيوس 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41، 42). كان مطلوبًا تحديد البروتينات بواسطة ما لا يقل عن 3 ببتيدات فريدة ولها 3 قيم صالحة (كمية غير صفرية) داخل مجموعة العينة، وتمت تصفية الملوثات والبروتينات العكسية من مجموعة البيانات. تم احتساب القيم المفقودة من التوزيع الطبيعي. تم إجراء مقارنات زوجية بين الحالات على مستوى البروتين باستخدام 2-اختبار t للطالب مع FDR القائم على التقليب مع s0=0.1 و250 عشوائية. تم تعريف التغييرات المهمة على أنها FDR أقل من 5٪ وتغيير الطية المطلق أكبر من 1.5 أو 2.0، كما هو محدد. ليسو-IP. تم إصابة خلايا A375P بفيروس pLJC5-Tmem192-3xHA وتم اختيارها باستخدام 1 ملغم/مل من بوروميسين (MilliporeSigma, P4512). تمت معالجة ما يقرب من 3 × 106 من خلايا A375P ذات علامات HA إما باستخدام 10 مم NAC أو التحكم في المركبات المائية لمدة 24 ساعة في ظروف الاستزراع الموصوفة مسبقًا. بعد العلاج، تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وحصادها في 0.5 مل من KPBS البارد، وتجانسها بلطف باستخدام 20 ضربة في الخالط Dounce 2 مل. تم حجز حوالي 2.5% من المتجانس لتحليل محلول الخلية الكاملة، وتم طرد الباقي عند 3,000 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات لإزالة حطام غشاء الخلية. تم بعد ذلك نقل المادة الطافية المتجانسة إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل واحتضانها بـ 50 ميكرولتر من الخرز المضاد لـ HA (بيرس، 88836) أو الخرز المضاد لـ DDK / Flag (OriGene، TA150042) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات. تم بعد ذلك ترسيب العينات عن طريق وضع الأنابيب على DynaMag (Thermo Fisher Scientific، 12321D) وهزها بلطف لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تم حجز الطاف لتحليل الكسر غير المنضم. تم غسل IP 3 مرات باستخدام KPBS الذي يحتوي على 8 ملي مولار CaCl. تم استخراج Lyso-IP في 80٪ MeOH لتحليل التمثيل الغذائي. استخراج الدهون وتحليلها باستخدام LC-MS/MS للدهون العالمية. تم زرع خلايا الميلانوما A375P في أطباق بحجم 60 ملم بمعدل 0.7 × 106 خلية لكل طبق. عندما كانت الخلايا عند التقاء حوالي 50٪، تمت معالجتها باستخدام DMSO (التحكم)، DC661 (3 ميكرومتر)، أو HCQ (30 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS، وكشطها في الميثانول المثلج، ونقلها إلى أنابيب زجاجية لاستخراج الدهون باستخدام الكلوروفورم / الميثانول / 0.88٪ NaCl (2: 1: 1) التي تحتوي على معيار الدهون الداخلي EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). تم تدوير العينات ثم حمام مائي صوتي لمدة 5 دقائق على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 500 جم لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة، تم نقل الطور السفلي إلى أنبوب زجاجي آخر. تم إعادة استخراج المرحلة العليا باستخدام مرحلة سفلية اصطناعية. بعد صوتنة والطرد المركزي، تم الجمع بين المرحلة السفلى مع أول مجموعة المرحلة السفلى. تم تجفيف العينات تحت النيتروجين، وتم إعادة تعليقها في 10% كلوروفورم/90% ميثانول، وتم نقلها إلى قوارير زجاجية LTQ. تم تحليل عينات الدهون باستخدام مطياف الكتلة Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X ونظام Vanquish Horizon UHPLC. استخدم الفصل التحليلي عمود Accucore C30 (2.1 مم × 150 مم، Thermo Fisher Scientific) مع 50:50 أسيتونيتريل / ماء و88:10: 2 إيزوبروبانول / أسيتونيتريل / ماء، يحتوي كل منها على 5 ملي مولار من فورمات الأمونيوم وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪. تم الحصول على بيانات LC-MS/MS بشكل منفصل في الأقطاب الإيجابية والسلبية مع معلمات الأداة التالية: MS1 scan 120,000 الدقة; MS2 المعتمد على البيانات في أفضل 20 أيونًا وفرة بدقة 15000؛ عرض العزلة 0.4 م/ض؛ وطاقة تصادم طبيعية متدرجة تبلغ 20:30:40 (43).

الشكل 7. N-أسيتيل السيستين يمنع DC 661- التعبير السطحي للكالريتيكولين الناجم. (إعلان)

تم التعرف على الدهون وقياس كميتها باستخدام LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). تمت تصفية أنواع الدهون التي تم تحديدها بواسطة المقارنات المتوقعة ودرجة التعريف على أساس الفئة. تمت تسوية مناطق الذروة وفقًا لمعايير EquiSPLASH للفئات المدعومة وتم تطبيعها بشكل أكبر بناءً على المساحة الإجمالية لكل عينة لتصحيح التباين في رقم الخلية. تم إجراء التحليل الإحصائي على البيانات المحولة بالسجل باستخدام Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41، 42). استخلاص وتحليل المستقلبات باستخدام LC-MS/MS للميتابالون. تم استخلاص المستقلبات القطبية من خلايا كاملة، وأجزاء Lyso-IP غير المرتبطة، وعينات Lyso-IP المرتبطة باستخدام 80% ميثانول وتم تخزينها عند -8{{30}} درجة قبل التحليل اللوني السائل – تحليل قياس الطيف الكتلي (LC-MS). تم تحليل المقتطفات بواسطة LC-MS باستخدام مطياف الكتلة Thermo Scientific Q-Exactive HF-X مع مسبار HESI II بما يتماشى مع نظام Thermo Vanquish Horizon UHPLC. تم إجراء فصل LC باستخدام عمود ZIC-HILIC (2.1 مم × 150 مم، حجم جسيم 5 ميكرومتر، EMD Millipore) مع عمود حماية ZIC-HILIC (2.1 مم × 20 مم، EMD Millipore) مثبت عند 45 درجة بمعدل تدفق 0.2 مل/دقيقة. تم إجراء التحليل اللوني في ظل ظروف حمضية لتقليل تفاعل مجموعات الثيول. كان الطور المتحرك A عبارة عن ماء، بينما كان الطور B عبارة عن أسيتونيتريل، وكلاهما يحتوي على 0.1% من حمض الفورميك. كان التدرج LC 85% B لمدة دقيقتين، و85% B إلى 20% B خلال 15 دقيقة، و20% B إلى 85% B خلال 0.1 دقيقة، و85% B لمدة 8.9 دقيقة. تم تثبيت جهاز أخذ العينات التلقائي عند درجة حرارة 4، وتم حقن 4 ميكرولتر من كل عينة لكل تحليل. تم استخدام معلمات MS التالية: معدل تدفق الغاز غمد، 40 AU؛ معدل تدفق الغاز المساعد، 10 AU؛ معدل تدفق الغاز الاجتياح، 2 الاتحاد الأفريقي؛ درجة حرارة سخان الغاز المساعد، 350 درجة؛ جهد الرش، 3.75 كيلو فولت للوضع الإيجابي و3.5 كيلو فولت للوضع السلبي؛ درجة حرارة الشعرية، 375 درجة؛ ومستوى الترددات اللاسلكية 40%. تم تحليل جميع العينات بواسطة MS كامل مع تبديل القطبية. تم الحصول على عمليات فحص MS كاملة من 65 إلى 975 m/z بدقة 120000 مع هدف التحكم التلقائي في الكسب وهو 1 × 106 أيونات والحد الأقصى لوقت الحقن 100 مللي ثانية. تم تحليل البيانات الأولية باستخدام TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). تم تحديد المستقلبات المستهدفة من خلال الكتلة الدقيقة ووقت الاحتفاظ بها في قطبيتها المفضلة بناءً على المعايير التحليلية. استخدم اكتشاف الذروة خوارزمية ICIS مع تجانس 1. تم إجراء القياس الكمي النسبي باستخدام منطقة ذروة متكاملة، وتم تصحيح هذه القيم إلى المبلغ الإجمالي لكل عينة (يتم تعريفها على أنها إجمالي منطقة الذروة). تحرير PPT1-CRISPR/Cas9. تم تحضير الخلايا غير المستهدفة وخلايا KO A375P PPT 1- كما هو موضح سابقًا (44). كان pSpCas9 (BB) -2 A-Puro (PX459) هدية من Feng Zhang (Addgene plasmid، 48139). تم تلدين دليل RNA oligos (IDT) وفسفورته ثم ربطه في بلازميد BbsI المهضوم ومنزوع الفسفرة pX459 باتباع بروتوكولات مختبر Zhang، المتوفرة من خلال Addgene. تم تحويل البلازميدات المرتبطة إلى خلايا Stbl3 (Invitrogen). أكد تسلسل الاستعدادات البلازميدية وجود تسلسلات الحمض النووي الريبي (RNA) الدليلية المطلوبة. تم نقل خلايا A375P باستخدام Lipofectamine 3000 (Invitrogen، L3000015)، متبوعًا باختيار البروميسين. أكدت فحوصات المساح تحرير جين PPT1 بواسطة CRISPR/Cas9، وتم تأكيد ضربة قاضية PPT1 بواسطة النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد PPT1 (Origene). تسلسلات دليل RNA oligos هي كما يلي: دليل RNA غير المستهدف للأمام (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT)، دليل RNA غير المستهدف العكسي (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC)، دليل PPT1 البشري RNA 1 للأمام (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC)، دليل PPT1 البشري RNA 1 عكس (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA)، دليل PPT1 البشري RNA 3 إلى الأمام (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) ودليل PPT1 البشري RNA 3 العكسي (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). تشمل الحيوانات المستنسخة المزروعة من الخلايا المفردة المستخدمة في هذه الورقة ما يلي: استنساخ C8 هو دليل بشري 1 واستنساخ B5 هو دليل بشري 3. اللطخة المناعية. تم طلاء مليون خلية في طبق بحجم 10 سم، وتم تقديم العلاجات في اليوم التالي؛ تم جمع الخلايا عن طريق الكشط. تم إعداد lysates الخلية الكاملة باستخدام المخزن المؤقت لتحلل SDS. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific، 23225). تم استخدام 30-50 ميكروغرام من البروتين في SDS-PAGE وتم نقله إلى غشاء PVDF (Bio-Rad، 1620177). تم حجب الغشاء باستخدام 5% من BSA أو 5% من الحليب منزوع الدسم، حسب الظروف المثالية، وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات. تم غسل أغشية PVDF باستخدام 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc.، CS -9997) واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المرتبط بـ HRP الخاص بالأنواع. تم بعد ذلك غسل الأغشية وتطويرها باستخدام ركيزة Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific، 32106) وأفلام التصوير الإشعاعي الذاتي (Lab Scientific Inc.، XAR ALF 1318). بالنسبة لدراسات التهاب الحنجرة، تم فصل البروتين ليساتيس بواسطة SDS-PAGE ونقله إلى أغشية PVDF. بعد حجب 5% من BSA، تم تحضين أغشية PVDF مع الأجسام المضادة الأولية المشار إليها طوال الليل عند 4 درجات، وغسلها في PBS/Tween، وحضنت مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالبيروكسيداز. تم اكتشاف النشاط المناعي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP (CalBioTech)، وركيزة التألق الكيميائي (Thermo Fisher Scientific)، ونظام التصوير ChemicDoc MP (Bio-Rad). بالنسبة للتجارب التي تنطوي على طاف، تم استزراع الخلايا في وسط خالٍ من FBS لتجنب تشويه SDS-PAGE. تم حصاد المواد الطافية للخلية وطردها لمدة 10 دقائق عند 500 جرام عند 4 درجات لإزالة بقايا الخلية. تم تركيز المواد الطافية الناتجة 10 × باستخدام Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 4500 جم عند 4 درجات. تم خلط المركزات مع المخزن المؤقت للعينة وتحليلها عن طريق النشاف الغربي كما هو موضح أعلاه. تم إجراء تلطيخ هلام البروتين باستخدام تلطيخ Ponceau الأحمر. فحص نشاط LMP و Cathepsin L. كان بلازميد pEGFP-hGal3 البشري هدية من Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) وتم استخدامه لإنشاء خط A375P-Galectin-3. تم شراء العمود الفقري لمتجه البلازميد للتحكم pEGFP-C1 (novo prolabs، V012024). تم نقل البلازميدات (1 ميكروغرام / مل) إلى خلايا A375P باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen، 11668019) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة؛ تم اختيار الخلايا المنقولة بشكل ثابت باستخدام G418 (Gibco، 10131035). بالنسبة إلى LMP، تم حساب إجمالي 25 خلية A375P-galectin-3 من الخلايا الإيجابية في حقول صور متعددة. تم حساب النسبة المئوية للخلايا النقطية الإيجابية في كل حقل على حدة، وتم حساب النسبة المئوية المتوسطة لكل مجموعة. تم استخدام مجموعة الفحص Magic Red Cathepsin L (Abcam، ab270774) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تصوير الخلايا تحت المجهر المقلوب Zeiss Axio Observer 7. تم حساب الكثافة المتكاملة الخام لـ Magic Red باستخدام برنامج Fiji - ImageJ (NIH). MTT (3-[4، 5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl]-2، 5 بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم) مقايسة صلاحية الخلية. تم طلاء 2000 خلية في ثلاث نسخ في كل بئر من 96- لوحة البئر، وتم إجراء فحوصات MTT لمدة 3- يوم باستخدام مجموعة قابلية بقاء الخلية (Roche, 11465007001) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إعطاء المعالجة المانعة لمدة ساعة واحدة، تليها المعالجة الكيميائية للخلايا بمثبطات مع أو بدون DC661. تم استخدام طريقة الانحدار غير الخطي (تناسب المنحنى) لحساب IC50.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

فحص تشكيل مستعمرة. تم زرع 2،000 خلية لكل بئر في 6-لوحة بئر وتمت معالجتها في اليوم التالي؛ تم الاحتفاظ بالخلايا تحت العلاج لمدة 8 أيام. تم غسل المستعمرات المتكونة في كل بئر باستخدام PBS، وتم تثبيتها بالميثانول البارد عند -2 0 درجة لمدة 20 دقيقة، وملطخة بمحلول مائي كريستال بنفسجي 0.5٪ (V5265؛ MilliporeSigma).

اختبار استبعاد صبغة التريبان الزرقاء. تم تحضير خليط التفاعل لفحص التريبان الأزرق عن طريق خلط جزء واحد من 0.4% التريبان الأزرق (25- 900-CI، كورنينج) وجزء واحد من عينات الخلايا المخففة. تم تحضين الخليط لمدة دقيقة واحدة، وتم حساب الخلايا على مقياس قياس الخلايا (Nexcelom، Vision -310-0208).

الشكل 8. DC661- التعبير السطحي للكالريتيكولين المستحث يجهز الخلايا التائية ضد الخلايا السرطانية. (أ)

الشكل 9. يؤدي تلقيح الخلايا المعالجة بالتيار المستمر 661- إلى رفض الورم في سياقات محددة. (أ)

رغوة-LPO. تمت دراسة LLP باستخدام مسبار الفلورسنت، FOAMLPO. تم تصنيع FOAM-LPO كما هو موضح سابقًا (26). تم استزراع الخلايا على 8 Well μSlide (المرجع نفسه، 80807) وتم علاجها بمثبطات ومع أو بدون DC661. تم تحضين الخلايا بوسط يحتوي على FOAM-LPO (1 M) في جو يحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون و95% هواء لمدة 5 دقائق عند 37 درجة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام الوسائط، ثم تمت ملاحظة الخلايا تحت المجهر (المجهر المقلوب Zeiss Axio Observer 7) للكشف عن تحول التألق من 586 إلى 512 نانومتر استجابةً لـ LLP. qRT-PCR والاشعال. تم استزراع خلايا A375P (3 × 105) في أطباق بحجم 60 مم وتم علاجها باستخدام DMSO أو DC661 (3 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (QIAGEN، 74134) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تصنيع [كدنا] باستخدام مجموعة iScript Reverse Transcriptase مع 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Thermo Scientific، K1642). تم إعداد تفاعل qPCR باستخدام SYBR Green PCR Master Mix (BioRad، 1725121) الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من cDNA. تم إجراء جميع القياسات في ثلاث نسخ، وتم استخدام BACTIN كمعيار داخلي لحسابات ΔCT. تم إجراء تحليل التعبير الجيني باستخدام الاشعال التالية: PTGS2/COX -2 للأمام (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG)، PTGS2/COX -2 عكسي (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA)، CARS للأمام (CTGGACTACTCCAGCAACACCA)، عكس CARS (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC)، CHAC1 للأمام (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC)، عكس CHAC1 (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG)، BACTIN للأمام (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT)، وعكس BACTIN (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

ترنسفكأيشن سيرنا. تم إجراء دراسات ضربة قاضية وراثية للإنسان ULK1، ATG7، TAX1BP1، BNIP3، PPT1، وMFSD12 في خطوط الخلايا A375P. تم إجراء دراسات التثبيط الوراثي للفأر Ppt1 والكالريتيكولين في خلايا MC38. سيرنا غير المستهدف (SC{{10}})، ULK1 البشري (SC-44182)، ATG7 (SC-41447)، TAX1BP1/T6BP (SC-106831)، BNIP3 (الشوري {{2 0}})، PPT1/CLN1 (الشوري -105216)، MFSD12 (الشوري -97888)، الماوس Ppt1/Cln1 (الشوري -142398) والكالريتيكولين / Calregulin (sc -29895) تم شراء siRNAs من شركة Santa Cruz Biotechnology. تتكون هذه siRNAs من مجموعات من 3-5 siRNAs محددة الهدف. التدفق الخلوي. تم قياس تحريض Ferroptosis باستخدام C 11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11، Thermo Fisher Scientific، D3861). تم زرع خلايا A375P في 6- صفيحة بئر وتم علاجها باستخدام DMSO، والفيروستاتين {{40}} (10 ميكرومتر)، وشفة روكستاتين -1 (2 ميكرومتر)، والإيلاستين (5 ميكرومتر) )، DC661 (3 ميكرومتر)، أو مجموعة لمدة 24 ساعة. تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 300 جرام لمدة 5 دقائق. تمت إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر 1X HBSS (Corning، 21-023-CV) تحتوي على 1 ميكرومتر C 11- BODIPY واحتضانها عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة. تم تكوير الخلايا وإعادة تعليقها في 500 ميكرولتر 1X HBSS، وتم قياس شدة التألق على مقياس الكريات BD LSRII باستخدام 530/30 Blue (مرفق التدفق الأساسي بجامعة بنسلفانيا). تم إجراء قياس كمية التعبير عن سطح الخلية للكاريتيكولين لموت الخلايا المناعية كما هو موضح سابقًا (45) عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استزراع الخلايا B16F10 أو MC38 ومعالجتها باستخدام NAC (10 مم) أو DC661 (3 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تمت معالجة خلايا MC38 باستخدام siPpt1 أو siNT لمدة 48 ساعة في وجود أو عدم وجود 10 ملم NAC لمدة 24 ساعة. تم تلوين الخلايا باستخدام الأجسام المضادة CALR (تقنية تشوير الخلايا، 12238)، والجسم المضاد الثاني المضاد للأرنب Alexa Fluor 647 (Invitrogen)، ويوديد البروبيديوم (PI) (Biolegend، 421301). تم الحصول على عينات ملطخة على مقياس التدفق الخلوي BD LSRII باستخدام 710/50 Blue و670/30 Red لالتقاط مضان PI وCALR، على التوالي (منشأة التدفق الأساسية بجامعة بنسلفانيا)، واقتصر التحليل على الخلايا الإيجابية والسلبية PI CALR لتجنب الأحداث الإيجابية الكاذبة. تحضير الخلايا التائية ونسبة السمية الخلوية. تمت زراعة الخلايا السرطانية B16 أو MC38 (5 × 104) ومعالجتها باستخدام NAC (10 مم) أو DC661 (1 ميكرومتر أو 3 ميكرومتر)، على التوالي، لمدة 24 ساعة. بالنسبة للتثبيط الوراثي لـ Calr، عولجت خلايا MC38 باستخدام Calr siRNA أو siRNA غير المستهدف (siNT) لمدة 48 ساعة، يليها العلاج باستخدام DMSO أو 3 ميكرومتر DC661 لمدة 24 ساعة. تمت بعد ذلك زراعة الخلايا الطحالية باستخدام DC661 مع أو بدون خلايا B16 أو MC38 في وجود IL-2 (5 وحدة دولية/مل) وتم زراعتها لمدة 72 ساعة. تم تأكيد التحضير بواسطة IFN-ELISA (Biolegend، 430815) للطاف. تم بعد ذلك زراعة خلايا الطحال المجهزة بخلايا B16 أو MC38 المزروعة حديثًا بنسب من الهدف إلى المستجيب (B16 أو MC38 إلى الطحال) تبلغ 1:20 و1:50 للخلايا B16 وMC38، على التوالي. تم قياس إطلاق LDH المرتبط بموت الخلايا B16 أو MC38 ثم نسبة السمية الخلوية وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (MilliporeSigma، 4744926001) (31). فحوصات التطعيم ضد الأورام ودراسات العلاج الكيميائي مع نماذج السرطان القائمة. تم الحصول على فئران WT C57BL/6 البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع، وفئران NOD/SCID، وفئران BALB/c من مختبر جاكسون. بالنسبة لتجارب التطعيم ضد الأورام، تمت معالجة خلايا WT B16F10 وMC38 وCT26 باستخدام DC661 (3 ميكرومتر) لمدة 36 ساعة في قوارير سعة 175 سم2. بعد ذلك، تم جمع المواد الطافية والخلايا المنفصلة في أنبوب صقر سعة 50 مل. تم طرد الخلايا وغسلها باستخدام PBS المثلج. للتطعيم ، تم حقن 150 ميكرولتر من التعليق الخلوي في الجانب الأيسر من الفئران C57BL / 6 ذات الكفاءة المناعية ، أو فئران NOD / SCID التي تعاني من عوز المناعة (1.8 × 104 خلايا B16F10 ، 1.5 × 106 خلايا MC38 لكل فأر) ، أو فئران BALB / c مسانجية (3.0). × 106 خلايا CT26 لكل ماوس). تم حقن الخلايا المذابة بالتجميد المعلقة في برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم سلبي. بعد أسبوع واحد، تم حقن الخلايا السرطانية الحية من نفس النوع (3 × 104 خلايا B16F10، أو 2 × 105 خلايا MC38، أو 5 × 105 خلايا CT26 لكل فأر) مع حجم متساو من Matrigel (Corning، 354248) في الجهة اليمنى. من الفئران المحصنة. تم قياس الأورام باستخدام الفرجار الإلكتروني، وتم حساب الحجم على أنه L × W2 × 0.5. تمت مراقبة نمو الورم بانتظام في الأيام التالية، واعتبر عدم وجود الأورام مؤشرا على التطعيم الفعال ضد الأورام. تم تكرار دراسات التطعيم DC661-MC38 في الفئران NOD/SCID. إحصائيات. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار t-tailed 2- للطالب عند مقارنة مجموعتين. تم استخدام طريقة 1-اختبار ANOVA عند مقارنة أكثر من مجموعتين. تم رفض الفرضية الصفرية بشكل ملحوظ إذا كانت قيمة P أقل من 0.05. وتظهر البيانات على أنها متوسط ​​± SEM. الموافقة على الدراسة. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لجامعة بنسلفانيا.

نبات السيستانش الصيني – مضاد للأورام

مراجع

1. زيه هج، وآخرون. دراسة عشوائية للمرحلة الثانية قبل الجراحة لتثبيط الالتهام الذاتي بجرعة عالية من هيدروكسي كلوروكين وجيمسيتابين / ناب باكليتاكسيل في مرضى سرطان البنكرياس. الدقة السريرية للسرطان. 2020;26(13):3126–3134.

2. ريبيكا فولكس فاجن، وآخرون. يعزز PPT1 نمو الورم وهو الهدف الجزيئي لمشتقات الكلوروكين في السرطان. اكتشاف السرطان. 2019;9(2):220–229.

3. برون إس، وآخرون. GNS561، مثبط الالتهام الذاتي الجديد النشط ضد الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الخلايا الكبدية والنقائل الكبدية من سرطان القولون والمستقيم. ي السرطان. 2021;12(18):5432-5438.

4. برون إس، وآخرون. GNS561، مثبط PPT1 في المرحلة السريرية، فعال ضد سرطان الخلايا الكبدية عن طريق تعديل وظائف الليزوزومية. الالتهام الذاتي. 2022;18(3):678–694.

5. أوبيرل سي، وآخرون. إن نفاذية الغشاء الليزوزومي وإطلاق الكاثيبين هو حدث تضخيم يعتمد على Bax / Bak لموت الخلايا المبرمج في الخلايا الليفية والخلايا الوحيدة. موت الخلايا يختلف. 2010;17(7):1167-1178.

6. Boya P، Kroemer G. نفاذية الغشاء الليزوزومي في موت الخلايا. الجين الورمي. 2008;27(50):6434–6451.

7. ريبيكا فولكس فاجن، وآخرون. نهج موحد لاستهداف أدوار التحلل والنمو في الليزوزوم. اكتشاف السرطان. 2017;7(11):1266-1283.

8. تانغ آر، وآخرون. Ferroptosis، necroptosis، وpyroptosis في المناعة المضادة للسرطان. ي هيماتول أونكول. 2020;13(1):110.

9. ياماموتو ك، وآخرون. تعمل الالتهام الذاتي على تعزيز التهرب المناعي لسرطان البنكرياس عن طريق تحطيم MHCI. طبيعة. 2020;581(7806):100–105.

10. دينغ جي، وآخرون. يتغلب تثبيط ULK1 على عرض المستضد المخترق ويستعيد المناعة المضادة للأورام في سرطان الرئة المتحول LKB1. نات السرطان. 2021;2(5):503-514.

11. لازارو م، وآخرون. يقوم يوبيكويتين كيناز PINK1 بتجنيد مستقبلات الالتهام الذاتي للحث على التخفيف من الالتهام. طبيعة. 2015;524(7565):309-314.

12. تشوي واي بي، وآخرون. يقيد TAX1BP1 موت الخلايا المبرمج الناجم عن الفيروس عن طريق تسهيل التدهور بوساطة الحكة لمحول الميتوكوندريا MAVS. مول خلية بيول. 2017;37(1):هـ00422-16.

13. ريكا إس، وآخرون. Bnip3 يضعف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ويحفز دوران الميتوكوندريا. موت الخلايا يختلف. 2011;18(4):721-731.

14. ليو جي، وآخرون. الأساس الميكانيكي لضعف الخلايا الحديدية في الخلايا التي تعبر عن متغير S47 المتمركز في أفريقيا لـ p53. Proc Natl Acad Sci US A. 201;116(17):8390–8396.

15. إركيس دا، وآخرون. تعمل مثبطات BRAF و MEK المتحولة على تنظيم البيئة الدقيقة المناعية للورم عن طريق التهاب الحنجرة. اكتشاف السرطان. 2020;10(2):254–269.

16. سيرانو-بويبلا A، بويا P. نفاذية الغشاء الليزوزومي في موت الخلايا: أدلة جديدة وآثارها على الصحة والمرض. آن نيويورك أكاد العلوم. 2016;1371(1):30–44.

17. ثيروسانجو بي، وآخرون. تؤدي الالتهام الذاتي الناجم عن الكيناكرين في سرطان المبيض إلى تحفيز نفاذية الغشاء الليزوزومي / الميتوكوندريا بوساطة الكاثيبين- إل وموت الخلايا. السرطان (بازل). 2021;13(9):2004.

18. ميشاليت إم سي، وآخرون. موت الخلايا المبرمج المعتمد على الكاثيبين الناتج عن التنشيط فوق الأمثل للخلايا اللمفاوية التائية: آلية محتملة لتحمل الجرعة العالية. ي إيمونول. 2004;172(9):5405-5414.

19. موندال أ، وآخرون. يؤدي نقص Ppt1- إلى خلل تنظيم التوازن الليزوزومي Ca++ الذي يساهم في التسبب في المرض في نموذج الفأر لمرض CLN1. J وراثة ميتاب ديس. 2022;45(3):635-656. 20. إنجل كم، وآخرون. تشتق الفوسفوليباز وأنواع الأكسجين التفاعلية من المؤشرات الحيوية للدهون في البشر والحيوانات الأصحاء والمرضين - مع التركيز على ليسوفوسفاتيديل كولين. فيسيول أمامي. 2021;12:732319.

21. فو ر، وآخرون. فعالية N-acetylcysteine ​​​​في قمع النمط الظاهري لنماذج الفئران لمرض Niemann-Pick، النوع C1. هوم مول جينيت. 2013;22(17):3508–3523.

22. بوز زد، وآخرون. يمنع N-acetylcysteine ​​​​الإجهاد التأكسدي الناجم عن olanzapine في الخلايا العصبية تحت المهاد mHypoA-59. ممثل العلوم. 2020;10(1):19185.

23. خير س، وآخرون. يقوم ASS1 وASL بقمع النمو في سرطان الخلايا الكلوية الصافية من خلال استقلاب النيتروجين المتغير. السرطان متعب. 2021;9(1):40.

24. جيجوتيك أ، وآخرون. مقارنة التأثير الوقائي لحمض الأسكوربيك على تفاعلات أنظمة الأكسدة والاختزال والإندوكانابينويد في الخلايا الليفية الجلدية البشرية المزروعة في المختبر والمعرضة للأشعة فوق البنفسجية وبيروكسيد الهيدروجين. قوس ديرماتول الدقة. 2017;309(4):285–303.

25. دي رايدت تي، وآخرون. استغلال نقاط الضعف في الخلايا السرطانية لتطوير علاج مركب للأورام التي يحركها ras. الخلايا السرطانية. 2011;20(3):400-413.

26. تشانغ العاشر، وآخرون. مراقبة بيروكسيد الدهون داخل الخلايا الرغوية بواسطة مسبار الليزوزوم المستهدف والقياسي. الكيمياء الشرج. 2015;87(16):8292–8300.

27. وي سي واي، وآخرون. يكشف التحليل القائم على المعلوماتية الحيوية عن ارتفاع MFSD12 كمحفز رئيسي لتكاثر الخلايا وهدف علاجي محتمل في سرطان الجلد. الجين الورمي. 2019;38(11):1876-1891.

28. ألديني جي، وآخرون. N-Acetylcysteine ​​​​كعامل مضاد للأكسدة وثاني كبريتيد: الأسباب. الدقة الراديكالية الحرة. 2018;52(7):751–762. 29. أبو رميلة م، وآخرون. تكشف الأيضات الليزوزومية عن التنظيم المعتمد على V-ATPase و mTOR لتدفق الأحماض الأمينية من الليزوزومات. علوم. 2017;358(6364):807-813.

30. تشو ج، وآخرون. موت الخلايا المناعية في علاج السرطان: المحرضات الحالية والناشئة. J خلية مول ميد. 2019;23(8):4854–4865. 31. شارما جي، وآخرون. تثبيط PPT1 يعزز النشاط المضاد للورم للجسم المضاد لـ PD -1 في سرطان الجلد. JCI انسايت. 2020;5(17):e133225.

32. مهنيرت جي إم، وآخرون. BAMM (الالتهام الذاتي BRAF وتثبيط MEK في سرطان الجلد): تجربة المرحلة الأولى/الثانية من دابرافينيب وتراميتينيب وهيدروكسي كلوروكين في سرطان الجلد المتحول BRAFV600- المتقدم. الدقة السريرية للسرطان. 2022;28(6):1098–1106. 33. لوي م، وآخرون. تتحكم بروتينات البلعمة الكبيرة في مستويات MHC من الدرجة الأولى على الخلايا الجذعية وتشكل استجابات الخلايا التائية CD8(+) المضادة للفيروسات. مندوب الخلية. 2016;15(5):1076–1087.

34. جواندين ف، وآخرون. تشكل تعبئة السيستين الليزوزومية استجابة TORC1 ونمو الأنسجة للصيام. علوم. 2022;375(6582):eabc4203.

35. شوالفينبيرج حارس مرمى. N-acetylcysteine: مراجعة للفائدة السريرية (دواء قديم بحيل جديدة). ي نوتر متعب. 2021;2021:9949453.

36. بير لا، وآخرون. الاكتشاف المنهجي للمؤشرات الحيوية لمصل الحمل خارج الرحم باستخدام تنميط بروتين 3-D مقترنًا بالكميات الخالية من الملصقات. ي بروتين الدقة. 2011;10(3):1126-1138. 37. جولدمان آر، وآخرون. التأثير الأساسي على بروتين سرطان الخلايا المبيضية الصافية المتحور ARID1A هو تقليل تنظيم مسار الميفالونات على مستوى ما بعد النسخ. بروتينات الخلية مول. 2016;15(11):3348–3360.

38. يتيح Cox J، Mann M. MaxQuant معدلات عالية لتحديد الببتيد، ودقة جماعية فردية لنطاق ppb، وتقدير البروتين على نطاق البروتين. نات للتكنولوجيا الحيوية. 2008;26(12):1367–1372.

39. كوكس جي، وآخرون. أندروميدا: محرك بحث الببتيد مدمج في بيئة MaxQuant. ي بروتين الدقة. 2011;10(4):1794–1805.

40. كوكس جي، وآخرون. تقدير كمي دقيق خالٍ من الملصقات على مستوى البروتين عن طريق التطبيع المتأخر واستخراج نسبة الببتيد القصوى، والذي يطلق عليه MaxLFQ. بروتينات الخلية مول. 2014;13(9):2513-2526.

41. تيانوفا إس، وآخرون. منصة بيرسيوس الحسابية للتحليل الشامل لبيانات omics (البروتينية). طرق نات. 2016;13(9):731-740.

42. Tyanova S، Cox J. Perseus: منصة المعلوماتية الحيوية للتحليل التكاملي لبيانات البروتينات في أبحاث السرطان. طرق مول بيول. 2018;1711:133–148.

43. أليسيا جي إم، وآخرون. تؤدي التغيرات في استقلاب الدهون في الخلايا الليفية القديمة إلى مقاومة خلايا سرطان الجلد المعتمدة على العمر للعلاج المستهدف عبر ناقل الأحماض الدهنية FATP2. اكتشاف السرطان. 2020;10(9):1282–1295.

44. ران فا، وآخرون. هندسة الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس9. نات بروتوك. 2013;8(11):2281–2308.

45. ليو بي، وآخرون. القياس الكمي للتعرض للكاريتيكولين المرتبط بموت الخلايا المناعية. طرق الانزيمول. 2020;632:1–13.