تنشيط البلاعم بواسطة السكريات منخفضة الوزن الجزيئي من Cistanche Deserticola

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

［الامتناعالصقيع］

لفحص تأثير التنشيط المناعي وآلية السكريات منخفضة الوزن الجزيئي منCistanche Deserticola(LMSC) على الضامة البريتونية الفأرية ، RAW264. 7 خلايا. RAW264. تم تقسيم 7 خلايا إلى مجموعة التحكم العادية ، ومجموعة التحكم الإيجابية LPS ، ومجموعات العلاج LMSC. RAW264. عولجت 7 خلايا بتركيزات مختلفة من LMSC من 3. 91 إلى 62. 5 جم · لتر - 1. تم استخدام المقايسة الحمراء المحايدة للكشف عن النشاط البلعمي للبلاعم. لم يتم الكشف عن أي إصدار باستخدام NO kit ، وتفعيل البلاعم المرتبطة بمستويات التعبير البروتيني (TNF- و IL -6 و IKK و p-IKK و IκB و p-IκB و NF-κB و p-NF-B) تم الكشف عنها بواسطة لطخة ويسترن. أظهرت النتائج أن LMSC كان له تأثير تنشيط على الضامة. يمكن أن يزيد بشكل كبير من إصدار NO في RAW264. 7 خلايا وتعزز التعبير عن السيتوكينات TNF- و IL -6. علاوة على ذلك ، زاد LMSC بشكل كبير من فسفرة IKK و IκB و NF-κB p65. علاوة على ذلك ، فإن أحد المكونات الرئيسية للمانيتول في LMSC عزز بشكل كبير نشاط البلعمة للبلاعم. أظهرت هذه النتائج أن LMSC يمكن أن ينشط الضامة عن طريق تنظيم مسار إشارات NF-B ، وقد يكون المانيتول أحد المكونات النشطة الرئيسية في LMSC．

［الكلمات المفتاحية: السكريات منخفضة الوزن الجزيئي. Cistanche الصحراء تنشيط المناعة الضامة. عامل التهابي NF- B

Cistanche deserticola YC Maهو نبات ينتمي إلى الجنسCistanche Deserticolaواي سي ما. يمكن استخدام جذعها السمين كدواء. له وظائف تغذية الكلى يانغ ، الجوهر المغذي والدم ، وترطيب الأمعاء. ومن المعروف باسم "الجينسنغ الصحراوي". تشمل المكونات الكيميائية لـ Cistanche جليكوسيدات فينيلثانويد ، جليكوسيدات إيريدويد ، سكريات ، قشور ، وأنواع أخرى كثيرة. وجدت الدراسات الدوائية الحديثة أن Cistanche لديها العديد من الأنشطة البيولوجية مثل الحماية العصبية ، ومكافحة الأورام ، وتنظيم المناعة ، ومضادات الالتهابات ، ومضادات الأكسدة [1]. وقد أظهرت الدراسات أن مغلي السيستانش والسكريات يمكن أن يحسن بشكل كبير قدرة البلعمة ووظيفة إفراز البلاعم [2-3]. ومع ذلك ، لا يوجد تقرير عن أبحاث النشاط للكربوهيدرات منخفضة الوزن الجزيئي. لذلك ، استخدمت هذه الدراسة نظام الاستزراع في المختبر لـ RAW264. 7 الضامة البريتونية الفئران لاستكشاف النشاط المناعي والآليات ذات الصلة من Cistanche منخفضة الوزن الجزيئي الكربوهيدرات. يمكن أن يوفر هذا البحث المزيد من الأدلة التجريبية لفهم شامل لتأثير Cistanche's immunomodulationفي المستقبل ، وذلك لتوجيه تطبيقه السريري بشكل أكبر.

Cistanche deserticola لها العديد من التأثيرات ، انقر هنا لمعرفة المزيد

1. المواد

RAW264. تم شراء 7 خلايا من مركز الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية ؛ تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) من PAN Biotech ، ألمانيا ؛ تم شراء المضادات الحيوية وسيط DMEM من شركة Zhongke Machen Technology Co.، Ltd. عديدات السكاريد الدهنية من Escherichia coli O55: B5 (LPS) التي تم شراؤها من شركة Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية. تم شراء مجموعة أكسيد النيتريك (NO) من معهد Nanjing Jiancheng للهندسة الحيوية. تم شراء مجموعة اللمعان الكيميائي ECL من Thermo Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ تم شراء الجسم المضاد من Cell Signaling Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ كانت Cistanche cistanche مجموع الجليكوزيدات ، والسكريات منخفضة الوزن الجزيئي ، والسكريات متعددة السكاريد من صنع يدوي من قبل مجموعتنا البحثية. كان الجزء الكتلي من إجمالي الجليكوسيدات cistanche 78.76 في المائة. الجزء الكتلي للسكريات منخفضة الوزن الجزيئيCistanche Deserticolaهو 58. 00 بالمائة والكسر الكتلي لـCistanche Deserticolaالسكريات 65. 24 في المئة. تم شراء نظام تقسيم التصوير متعدد الهلام -5200 Tanon من Shanghai Tianneng Technology Co.، Ltd .؛ تم شراء قارئ صفيحة ميكروسكوبية Sunrise-Basic من شركة TECAN.

2. الطريقة

2. 1 طريقة حمراء محايدة لقياس نشاط البلعمة من الضامة

خذ الضامة البريتونية للماوس في مرحلة النمو اللوغاريتمي ، بعد التربسين ، عد الخلايا ، واضبط عدد الخلايا إلى 5 × 104 خلية / مل ، وقم بتلقيحها في 96- لوحة زراعة خلية بئر ، 100 ميكرولتر / بئر ، عند 37 درجة مزروعة تحت ظروف 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، بعد أن تلتصق الخلايا بالجدار ، تخلص من المادة الطافية للثقافة ، أضف وسط DMEM (10 بالمائة FBS زائد 1 بالمائة P / S) ، LPS (1 مجم · لتر - 1) و Cistanche cistanche على التوالي مجموع الجليكوسيدات ،سيستانشتمت زراعة السكريات الكلية ، و Cistanche cistanche منخفضة الوزن الجزيئي (3.91 ~ 62.5 جم · لتر -1 ، على التوالي ، تمت تصفيتها بغشاء مرشح قبل الإعطاء). بعد الزراعة لمدة 48 ساعة ، أضف 1 0 0 ميكرولتر من محلول ملحي فسيولوجي أحمر محايد بنسبة 0.075 في المائة لكل بئر ، واستمر في الزراعة لمدة 4 ساعات ، ونضح المادة الطافية ، واغسل 3 مرات باستخدام PBS ، وأضف محلول الخلية (حمض الخليك الجليدي - الإيثانول 1: 1) 100 ميكرولتر ، ضعه على 4 درجات لمدة ساعتين ، وقياس الامتصاصية (A540 نانومتر) بعد أن يتم تحلل الخلايا.

2. 2 الكشف عن أي كمية الإفراج في طاف الخلية

تلقيح RAW264. 7 خلايا في 48- لوحة بئر (1 × 105 خلية / مل ، 500 ميكرولتر / بئر) ، نضح وسط ثقافة الخلية بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، أضف وسيط DMEM (10 بالمائة FBS بالإضافة إلى 1 بالمائة P / S) ، 500 ميكرولتر لكل من LPS (1 مجم · لتر -1) و Cistanche cistanche إجمالي الجليكوزيدات ، السكريات الكلية ، والسكريات منخفضة الوزن الجزيئي (3.91 ~ 62.5 جم · لتر -1 ، على التوالي). بعد 24 ساعة من الثقافة التعريفي ، تم جمع المادة الطافية. تحديد تركيز NO في طاف الخلية لكل مجموعة باستخدام مجموعة NO ، واتبع التعليمات ، وأخيراً اكتشف الامتصاصية (A570 نانومتر) باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة

2. 3. لطخة ويسترن

تلقيح RAW264. 7 خلايا في 6- لوحة بئر ، نضح وسط استنبات الخلية بعد فترة الحضانة بين عشية وضحاها ، أضف وسيط DMEM (10 بالمائة FBS زائد 1 بالمائة P / S) ، LPS (1 مجم · L - 1) ، وسيستانشكان إجمالي السكريات والسكريات منخفضة الوزن الجزيئي (3.91 ~ 62.5 جم · لتر -1) كل 2 مل ، وتم التخلص من المادة الطافية بعد 24 ساعة من الثقافة التعريفي. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني والتخلص منها. بعد التربسين ، يتم سحب الخلايا لأسفل. الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، أضف 1 0 0 ميكرولتر NP40 Lysis Buffer ، و lse على الجليد لمدة 40 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، تم أخذ المادة الطافية ، وتم تحديد تركيز البروتين بطريقة BCA ، وتم تعديل تركيز البروتين لكل هيستون بالتساوي. خذ نفس الكمية من عينات البروتين وافصلها على 12 بالمائة SDS-PAGE تحت ضغط ثابت. ثم استخدم خزان النقل الكهربائي Bio-Rad لنقل الغشاء بتيار ثابت 350 مللي أمبير لمدة ساعة واحدة ، ونقل البروتين إلى غشاء PVDF (المعالجة المسبقة لغشاء PVDF: ينقع في الميثانول ويتوازن مع المخزن المؤقت للنقل). بعد حجب الحليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة (المكون مع TBST الذي يحتوي على 0.1 بالمائة توين -20) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ، تم غسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBST ، وتم تحضين الغشاء في مخفف البروتين الأولي للجسم المضاد عند 4 بين عشية وضحاها. تم غسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBST كل يوم ، وتمت إضافة المادة المخففة المقابلة إلى الحضانة لمدة ساعة واحدة. تم غسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBST ، وتم تطوير الشرائط باستخدام مطور اللمعان الكيميائي ECL.

2. 4 تحليل البيانات

يتم التعبير عن البيانات كـ x ± s ، ويتم اختبار أهمية الاختلاف باستخدام برنامج GraphPad Prism 6 الإحصائي لتحليل التباين أحادي الاتجاه. اتخاذ ص<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. النتائج

3. 1. آثار cistanche cistanche السكريات ذات الوزن الجزيئي المنخفض ، إجمالي الجليكوزيدات ، والسكريات الكلية على النشاط البلعمي لـ RAW264. 7 خلايا

يُظهر البحث على المكونات الكيميائية لـ Cistanche ذلكسيستانشيحتوي بشكل رئيسيجليكوسيدات فينيلثانويد، جليكوسيدات القزحية ، والكربوهيدرات. في هذه التجربة ، تم اختيار إجمالي جليكوسيدات cistanche (بما في ذلك جليكوسيدات كحول الفينيثيل وجليكوسيدات إيريدويد) والسكريات منخفضة الجزيئات والسكريات. تم فحص المواقع النشطة الثلاثة من السكريات الكلية لتأثيرها على تنشيط RAW264. 7 خلايا. يمكن أن يؤدي كل من عديد السكاريد Cistanche cistanche و cistanche منخفض الوزن الجزيئي إلى زيادة النشاط البلعمي لـ RAW264 بشكل كبير. 7 خلايا ، لكن النشاط البلعمي لمجموعة إدارة الجليكوزيد الكلي لا يتغير بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، أدى عقار التحكم الإيجابي LPS أيضًا إلى تحسن كبير في نشاط البلعمة لـ RAW264. 7 خلايا ، كما هو موضح في الشكل 1. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي والسكريات المتعددة في Cistanche قد يكون لها تأثير في تنشيط RAW264. 7 خلايا.

3. 2. تأثير Cistanche إجمالي الجليكوسيدات والسكريات الجزيئية المنخفضة والسكريات الكلية على محتوى أكسيد النيتريك (NO) في طاف الخلية

من أجل مزيد من التحقيق في تأثير التنشيط للمواقع النشطة الثلاثة لـ Cistanche على RAW264. 7 خلايا ، تم تحديد محتوى أكسيد النيتروجين في طاف الخلية المحفز بواسطة أدوية مختلفة. أظهرت النتائج أن إطلاق NO في مجموعة LPS كان أعلى بكثير من ذلك في المجموعة الضابطة الفارغة (P.<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">سيستانشلم يكن لها تأثير كبير. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن كلاً من السكريات والسكريات منخفضة الوزن الجزيئي لـ Cistanche يمكن أن تعزز إطلاق NO من RAW264. 7 خلايا. من بينها ، تأثير السكريات منخفضة الوزن الجزيئي لـ Cistanche مهم بشكل خاص ، كما هو موضح في الشكل 2.

3. 3. تأثير Cistanche cistanche انخفاض الوزن الجزيئي للسكر على التعبير عن بروتين TNF- و IL -6 في RAW264. 7 خلايا

عامل نخر الورم- هو وسيط التهابي مهم يظهر في عملية تنشيط RAW264. 7 خلايا ، والتي يمكن أن تعزز تخليق وإطلاق السيتوكينات الأخرى (مثل IL -6). أظهرت النتائج أن التعبير عن TNF- و IL -6 قد زاد بشكل ملحوظ بعد تحفيز السكر منخفض الوزن الجزيئي من Cistanche cistanche ، مما يشير إلى أن السكر منخفض الوزن الجزيئي لـ Cistanche قد يعزز التعبير عن TNF - و IL -6 في RAW264. 7 خلايا ، وبالتالي تنشيط البلعمة المناعية الخلوية ، انظر الشكل 3.

3. 4. التأثير التنظيمي لـ Cistanche cistanche سكر منخفض الوزن الجزيئي على مسار إشارات IKK / IκB / NF-B

من أجل استكشاف الآلية المحتملة لـ Cistanche cistanche السكريات منخفضة الوزن الجزيئي في تنشيط RAW264. 7 خلايا ، درس المؤلفون آثارها التنظيمية على مسار الإشارات الكلاسيكي IKK / IκB / NF-B. يمكن أن يؤدي وجود سكر منخفض الوزن الجزيئي إلى زيادة كبيرة في فسفرة NF-B وفسفرة بروتينات الإشارة الرئيسية المنبع الخاصة به IKK و IκB ، ويقلل من التعبير عن إجمالي بروتين IκB ، مما يشير إلى أن له تأثيرًا نشطًا على IKK / مسار إشارات IκB / NF-κB. كما أن لعقار التحكم الإيجابي LPS تأثير تنظيمي مماثل. باختصار ، قد تنشط السكريات منخفضة الوزن الجزيئي لـ Cistanche مسار إشارات IKK / IκB / NF-κB ، مما يتسبب في تخليق وإطلاق السيتوكينات مثل TNF- و IL -6 ، وفي النهاية يتسبب في المناعة تفعيل RAW264. 7 خلايا ، انظر الشكل 4.

3. 5. فحص المكونات النشطة ذات التأثير المنشط للبلاعم في السكريات منخفضة الوزن الجزيئي

قام مختبرنا بتحليل السكريات منخفضة الجزيئات الموجودة فيسيستانشفي المرحلة المبكرة ووجد أنه يحتوي بشكل أساسي على مانيتول (16.53 بالمائة) ، سكروز (8.34 بالمائة) ، سكر الفواكه (25.38 بالمائة) ، جلوكوز (75 بالمائة) ، ومكونات أخرى. لذلك استخدم المؤلف الطريقة الحمراء المحايدة لفحص تأثير تنشيط المكونات المذكورة أعلاه على الضامة. يمكن أن يزيد المانيتول بشكل كبير من نشاط البلعمة للبلاعم بطريقة تعتمد على الجرعة ، في حين أن تأثيرات المكونات الأخرى ليست كبيرة. يشير هذا إلى أن المانيتول قد يكون أحد المكونات النشطة الرئيسية في السكريات منخفضة الوزن الجزيئي في cistanche cistanche لتنشيط الضامة ، كما هو موضح في الشكل 5.

4. مناقشة

تم الإبلاغ عن أن Cistanche cistanche ، وهو نبات طفيلي من عائلة Lydanaceae ، له تأثيرات مناعية ، لذلك يجب أن يحتوي على مواد مناعية. في هذه التجربة ، قام المؤلف بفحص النشاط البلعمي للخلايا الضامة البريتونية للفأر على أجزاء مُنقاة مختلفة منسيستانشووجدت أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي والسكريات في Cistanche لها تأثير تنشيط البلاعم ، لكن إجمالي جليكوسيدات Cistanche ليست واضحة. في الوقت نفسه ، وجد المؤلف أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي يمكنها تنشيط الضامة بتركيزات أقل ، لذلك اختار المؤلفونسيستانشالسكريات منخفضة الوزن الجزيئي كمحور للبحث اللاحق.

من خلال فحص تأثير انخفاض الوزن الجزيئي للسكر المستمر على تعبير السيتوكينات TNF- و IL -6 ، وجد المؤلفون أن سكر الثبات منخفض الوزن الجزيئي زاد بشكل ملحوظ من تعبير TNF- و IL -6 ، والتي أثبت أيضًا أن السكر المستمر منخفض الوزن الجزيئي له تأثير على الفئران. الضامة البريتونية لها تأثير منشط. لذلك استكشف المؤلف آلية عملها المحتملة. قم بالبحث

من الواضح أن عديدات السكاريد الدهنية البكتيرية (LPS) يمكن أن تحفز تنشيط الخلايا الضامة للفأر والخلايا الدبقية للفأر من خلال مسارات الإشارات مثل JAK2 / STAT3 و NF-κB و p38 / ERK و MAPK [4-8]. يتم التعرف على مسار NF-B كمسار كلاسيكي ، لذلك تم اختبار بروتينات الإشارة على هذا المسار في هذه التجربة. أظهرت النتائج أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي لـ Cistanche يمكن أن تزيد بشكل كبير من فسفرة NF-B والفسفرة لبروتينات الإشارات الأولية الرئيسية IKK و IκB ، مما يشير إلى أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي منسيستانشقد ينشط عمالقة الفأر البريتوني من خلال مسار إشارات IKK / IκB / NF-B. تطلق خلايا العاثيات السيتوكينات الالتهابية ثم تلعب دورًا في تنشيط المناعة الخلوية.

في المرحلة المبكرة من المختبر ، التركيب الكيميائي لمستخلص السكر منخفض الوزن الجزيئيCistanche Deserticolaتم تحليله بشكل منهجي. لقد وجد أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئي تحتوي بشكل أساسي على مونومرات مثل المانيتول والسكروز والفركتوز والجلوكوز. وجدت أبحاث أخرى أن المانيتول يمكن أن يحسن بشكل كبير نشاط البلعمة من الضامة. لذلك ، يُعتقد أن المانيتول قد يكون مكونًا رئيسيًا للسكريات منخفضة الوزن الجزيئي التي تنشط وظيفة المناعة الخلوية.

باختصار ، استخدمت هذه الدراسة البلاعم في نظام الاستزراع المخبري ووجدت أن السكريات منخفضة الوزن الجزيئيسيستانشلها تأثير تنشيط كبير على الضامة ، وقد تنشط الضامة البريتونية الفأرية من خلال مسار إشارات NF-B ، ثم تلعب دورًا. قد يلعب المانيتول الموجود في السكريات منخفضة الوزن الجزيئي دورًا مهمًا في تنشيط النشاط البلعمي للبلاعم.

مراجع

[1] Tu Pengfei ، Guo Yuhai. تقنيات زراعة الصحراء القيصرية ومضيفها Tamarix [M]. بكين: مطبعة العلوم ، 2015: 31.

[2] جاو إكسياوكسيا ، تشين جون ، بينغ يانلي. نظرة عامة بحثية عن التأثيرات الدوائية لـCistanche Deserticolaعديد السكاريد [J]. الغذاء والدواء ، 2015 ، 17 (2): 136.

[3] وانغ شيانغيان ، تشي يون ، كاي روسلان وآخرون. تنشيط البلاعم من Cistanche Polysaccharide [J]. نشرة الأدوية الصينية ، 2009 ، 25 (6): 787.

[4] ليو تشونغ يوان ، لي يانبينغ. النشاط البيولوجي وآلية عديدات السكاريد الدهنية البكتيرية [J]. مراجعة العلوم الطبية ، 2010 ، 16 (2): 166.

[5] فو زيهوي ، شو لينج ، هوانغ جياو ، وآخرون. يستحث LPS من خلال مسار p38 / MAPK وتنشيط NF-B التعبير عن HIF -1 في RAW264. 7 خلايا [J]. مجلة جامعة تشونغتشينغ الطبية ، 2016 ، 41 (10): 1033.

[6] هاو يوتونج ، تشين تشونهاي ، يانج إكسيسين ، وآخرون. مسار إشارات JAK2 / STAT3 متورط في تنشيط lipo poly-sugar الناجم عن السكر من الخلايا الدبقية الصغيرة ［J］. مجلة الجامعة الطبية العسكرية الثالثة ، 2009 ، 31 (12): 1119.

[7] Song Xiaomin و Liao Lixi و Dong Xin وآخرون. تمنع جليكوسيدات الملباسكوم الالتهاب الناجم عن عديدات السكاريد الدهنية للـ BV -2 الخلايا الدبقية الصغيرة وآليتها [J]. المجلة الصينية للطب الصيني التقليدي ، 2016 ، 41 (13): 2506.