آثار توسط لمكافحة الشيخوخة من مستخلص القسطرة

ثقافة المفوضية الأوروبية

تم الحصول على الخلايا البطانية للوريد السري البشري من مجموعة الثقافة الأمريكية (ماناساس فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من وسط نمو بطاني من ثاني أكسيد الكربون -2 (EGM -2 ؛ Lonza ، Walkerville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS). تمت تربية ECs لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، في وسط EGM -2 (تحكم) أو HG 30 ملي مولار ، مع أو بدون إضافة تركيزات مختلفة من Cistanche (1040 ميكروغرام / مل).

فحص جدوى الخلية

تمت زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة في وسط EGM -2 مكمل بنسبة 2 في المائة من FBS وتركيزات مختلفة من Cistanche ، وعولجت بمحلول MTT لمدة 4 ساعات. تم إذابة رواسب فورمازان الناتجة باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، حيث تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة VersaMax ELISA (MolecularDevices ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

مقايسة هجرة خدش الجرح

أصيبت الخلايا ، ثم تم استبدال الوسائط الثقافية بوسائط جديدة تحتوي على تركيزات مختلفة من Cistanche. تمت صيانة الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة. عند الهجرة الكاملة ، تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر (شركة أوليمبوس الضوئية المحدودة ، طوكيو ، اليابان). تم حساب الخلايا المهاجرة باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 200x وقياسها يدويًا

تلطيخ SA-P- غال

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >تم عد 500 خلية باستخدام ثلاثة حقول مستقلة.

تحليل لطخة غربية

تم حصاد الخلايا وتحللها في محلول استخراج البروتين (Intron Biotechnology ، Inc ، Gyeonggi ، كوريا) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (1 0 دقيقة عند 4 درجات مئوية). تم قياس تركيزات البروتين الكلية في المواد الطافية باستخدام فحوصات برادفورد. بعد التسخين عند 95 درجة لمدة 5 دقائق ، تم فصل عينات البروتين (30 ميكروغرام) بنسبة 8 ~ 12 بالمائة من الصوديوم دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد الكهربائي. تم بعد ذلك نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (MilliporeBedford ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة. تم تحضين الأغشية في 5 في المائة من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول ملحي بتريس (TBS) مكمل بنسبة 0.05 في المائة من TBS مع Tween -20 (TBST) (30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) ، ثم حضنت في 5 في المائة من مساحة سطح الجسم في TBST مع الأجسام المضادة الأولية (1: 200 إلى لتر ، 000) (بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). بعد ذلك ، تم تلقيح الأغشية إما بأجسام مضادة للأرانب أو مضادة للفئران مقترنة بـ HRP (1: 5 ، 000) لـ h ، وتم اكتشاف نطاقات البروتين باستخدام مجموعة محسنة للكشف عن اللمعان الكيميائي (Intron Biotechnology ، Inc. ) ومصور LAS -1000 (Fuji Film Corp. ، طوكيو ، اليابان). تم إجراء التحليل شبه الكمي لنتائج قياس الكثافة باستخدام Image J (المعاهد الوطنية للصحة ، Bethesda ، MD بالولايات المتحدة الأمريكية).

قياس تركيز NO إنتاج NO تم تحديدها عن طريق الكشف عن تركيز النتريت باستخدام NO مجموعات الفحص ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد الكثافة الضوئية عند 560 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة ، وتم حساب التركيزات باستخدام منحنى المعايرة.

تحليل احصائي

يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني بالإضافة إلى الانحراف المعياري (SD) تم تحديد الأهمية الإحصائية من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). تم إجراء المقارنات اللاحقة بين المجموعات باستخدام اختبارات المقارنات المتعددة Bonferroni. تم إجراء جميع الحسابات باستخدام SPSS في Windows (الإصدار 23. 0 ؛ IBM Corp ، و Armonk ، و NYUSA) ، وقيم P<0.05 were considered statistically significant.

النتائج والمناقشة

Cistanche السمية الخلوية

لتحديد السمية الخلوية لـ Cistanche على ECs ، تم تحضين الخلايا بتركيزات مختلفة من Cistanche (0 إلى 100 ميكروغرام / مل) لمدة 72 ساعة. أظهر Cistanche سمية خلوية كبيرة (P.<0.05) at concentrations >50 ميكروغرام / مل في جميع نقاط العلاج (الشكل 1). لذلك ، فإن تركيزات Cistanche من<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

ينظم مسار بروتين كيناز (MAPK) المُنشط بالميتوجين العمليات الرئيسية المشاركة في تطوير الأوعية الدموية EC ، مثل تكاثر الخلايا ، والغزو ، والورم الخبيث والبقاء على قيد الحياة ، وتكوين الأوعية (Pišlar et al. ، 2015). تتضمن MAPK ERK و c-Jun N-terminal kinase و p38 (Kim and Choi ، 2010). يعد ERK و p38 بروتينات إشارات مهمة تشارك في التئام الجروح ، بينما يلعب ERK دورًا مهمًا في التحكم في انتقال الخلايا وانتشارها وتمايزها وبقائها (روسكوسكي ، 2012). في دراسة حديثة ، تم اقتراح مسار إشارات p38 MAPK للمشاركة في التئام الجروح (Loughlin and Artlett ، 2011 ؛ Kim et al. ، 2019 ؛ Wang et al. ، 2019). في هذه الدراسة ، قمنا بفحص التعبير البروتيني لـ ERK و p38 لتحديد مسارات الإشارات المشاركة في هجرة EC التي تنظمها Cistanche. أدت معالجة القسطرة (40 ميكروغرام / مل) إلى زيادة ترحيل EC 1. 5- ضعفًا بالنسبة إلى مجموعة التحكم (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2. 5- أضعاف أعلى من عنصر التحكم (P.<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

رسم بياني 1.آثارسيستانش(Cistanche) على صلاحية الخلية. تم التعامل مع الخلايا بـ Cistanche (0 حتى 100جم / مل) لمدة 72 ساعة. صلاحية الخليةتم حسابه كنسبة مئوية من الخلايا القابلة للحياة المستزرعة فيغياب Cistanche. تظهر النتائج يعني ± SD. *P<0.05.