استقلاب الفلافونول كايمبفيرول في خلايا الكلى

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

استقلاب الفلافونول Kaempferol في خلايا الكلى يحرر الحلقة B لدخول الإنزيم المساعد Q Biosynthesis

لوسيا فرنانديز ديل ريو¹، وآخرون

الملخصالملخص: الإنزيم المساعد Q (CoQ) هو مكون أساسي في سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ومضاد أكسدة هام موجود في جميع أغشية الخلايا. تتكرر أوجه القصور في CoQ في الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر ، وتقتصر العلاجات الحالية على مكملات CoQ. الاستراتيجيات التي تعتمد على مكملات CoQ تعاني من ضعف امتصاص هذا الجزيء شديد الكراهية للماء والاتجار به. في دراسة سابقة ، تم الإبلاغ عن الفلافونول الغذائي kaempferol ليكون بمثابة مقدمة حلقة CoQ ولزيادة محتوى CoQ فيالكلىالخلايا ، ولكن لم يتم وصف جزء الجزيء الذي يدخل في التخليق الحيوي CoQ ولا الآلية. في هذه الدراسة ، تم عزل kaempferol المسمى على وجه التحديد في الحلقة B من نباتات Arabidopsis.الكلىالخلاياتم التعامل مع هذا المركب بدمج الحلقة B من kaempferol في CoQ المُصنَّع حديثًا ، مما يشير إلى أن الحلقة B يتم استقلابها عبر آلية موصوفة في الخلايا النباتية. Kaempferol هو فلافونويد طبيعي موجود في الفواكه والخضروات ويمتلك خصائص علاجية مضادة للأكسدة ومضادة للسرطان ومضادة للالتهابات. إن الفهم الأفضل لدور kaempferol باعتباره مقدمة حلقة CoQ يجعل هذا المركب النشط بيولوجيًا مرشحًا محتملًا لتصميم التدخلات التي تهدف إلى زيادة التخليق الحيوي الداخلي لـ CoQ وقد يحسن الأنماط الظاهرية التي تعاني من نقص CoQ في الشيخوخة والمرض.

الكلمات الدالة مركبات الفلافونويد؛ الفلافونول. كايمبفيرول. أنزيم Q ؛الكلىالخلايا. السلف

يمكن أن يحسن القسطرة وظائف الكلى

1 المقدمة

Coenzyme Q (CoQ أو ubiquinone) هو جزيء صغير محب للدهون موجود في كل مكان في أغشية الخلايا. من الناحية الهيكلية ، يتكون من حلقة بنزكوينون وذيل متعدد الأيزوبرينويد يختلف في الطول بين الأنواع [1]. في الثدييات ، يوجد CoQ9 (ذيل ذو تسعة أيزوبرين) و CoQ10 (ذيل من عشرة أيزوبرين) ، حيث يسود CoQ9 في القوارض و CoQ10 في البشر [1]. يحدث تخليق CoQ داخل الميتوكوندريا من خلال خطوات متعددة ينفذها ، على الأقل ، 14 بروتينًا تُعرف باسم بروتينات COQ [1،2]. يلعب CoQ دورًا في الوظائف الخلوية المتعددة [3،4]. ومع ذلك ، فإن الوظيفة الأساسية لـ CoQ هي قبول الإلكترونات والبروتونات من المجمعات التنفسية الأولى والثانية والتبرع بها إلى المركب III [1،4]. تسمح سعة الأكسدة والاختزال هذه لـ CoQ بالتنقل بين ثلاث حالات مختلفة: ubiquinone (مؤكسد) ، semiquinone (شبه مؤكسد) ، و ubiquinol (منخفض) [1،5]. في شكله يوبيكوينول ، يلعب CoQH2 دورًا مهمًا كمضاد للأكسدة ويوفر الحماية للحمض النووي والبروتينات والدهون ضد الإجهاد التأكسدي [6،7].

يتناقص محتوى CoQ مع ​​تقدم العمر في مجموعة متنوعة من أنسجة الثدييات ، كما يتضح من انخفاض معدل التخليق الحيوي [8-10]. تم استكشاف إمكانية زيادة محتوى CoQ10 من خلال المكملات الغذائية على نطاق واسع في العقود الأخيرة [6،9]. على الرغم من الحاجة إلى مزيد من الدراسات المضبوطة لتحديد فعالية CoQ10 كدواء مضاد للشيخوخة لدى البشر [11] ، فقد تم الإبلاغ سابقًا أن مستويات بلازما CoQ في كبار السن ترتبط بالنشاط البدني المعزز وانخفاض ضرر أكسدة الدهون. وأن مكملات CoQ10 تحسن الحيوية والأداء البدني ونوعية الحياة لدى كبار السن [9]. تعتبر حالة التأثيرات المفيدة لمكملات CoQ10 أقوى بالنسبة لعدد من الأمراض المرتبطة بالعمر مثل أمراض القلب والأوعية الدموية ، واعتلال الأعصاب ، والالتهاب ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، والتهاب المفاصل ، والتسرطن ، والسكري ، وهشاشة العظام ، وفرط كوليسترول الدم [3،8،11]. ثبت أن مكملات CoQ10 تقلل من علامات الالتهاب ، والتي توجد عادة بمستويات عالية في الأمراض المرتبطة بالعمر المذكورة أعلاه [12-14].

ومع ذلك ، فإن سلسلة polyisoprenoid الطويلة تجعل CoQ10 شديد المحبة للدهون ويصعب امتصاصه. تشكل المكملات الغذائية CoQ10 العديد من التحديات ، بما في ذلك الامتصاص النوعي عبر الجهاز الهضمي [5] ، والامتصاص الخلوي لغشاء البلازما ، والنقل عبر الأغشية داخل الخلايا ، والاستيعاب بواسطة الميتوكوندريا. كل خطوات الاتجار هذه تجعل عملية مكملات CoQ10 الخارجية غير فعالة للغاية [3،9]. في هذا الصدد ، يتم دراسة المركبات البديلة لإدارة CoQ10 (على سبيل المثال ، الكبسولات الزيتية والجسيمات النانوية) [3،15،16] ، بالإضافة إلى الاستراتيجيات الجديدة التي يمكن أن تعزز التوليف الداخلي لـ CoQ [2،3]. سابقًا ، وصفنا قدرة kaempferol ، وهو فلافونول موجود في الفواكه والخضروات ، على زيادة محتوى CoQ من خلال العمل كمقدمة جديدة لـ CoQ في الفئران والبشر.الكلىالخلايا[17]. ومع ذلك ، لم يتم تحديد المسار الأيضي الدقيق الذي يشارك من خلاله kaempferol في التخليق الحيوي CoQ. تم اقتراح فرضيتين: (1) يمكن أن يكون Kaempferol ركيزة مباشرة من COQ2 في مسار التخليق الحيوي CoQ وسيتم استقلابه لاحقًا بواسطة بروتينات COQ المختلفة حتى يصل إلى الهيكل النهائي لـ CoQ ؛ أو بدلاً من ذلك ، (2) يمكن استقلاب الكايمبفيرول في الخلية لإنتاج سلائف حلقة CoQ محتملة ، والتي سيتم دمجها بعد ذلك في مسار التخليق الحيوي CoQ [17]. في دراسة حديثة ، وصف Soubeyrand والمؤلفون المشاركون [18] أنه في النباتات ، ترتبط مسارات التخليق الحيوي للفلافونويدات و CoQ بالفعل وأن الكايمبفيرول يمكن أن يكون بمثابة مقدمة لتخليق CoQ. لقد أثبتوا أن الحلقة B من kaempferol تخضع لانقسام بيروكسيد ، لإعطاء 4- حمض هيدروكسي بنزويك (4HB) ، وهو مقدمة شائعة لحلقة البنزوكوينون من CoQ [18].

الهدف من العمل الحالي هو زيادة وصف العلاقة بين kaempferol و CoQ في خلايا الثدييات. تظهر نتائجنا ذلك فيالكلىالخلايا ، الحلقة B من kaempferol هي جزء من الجزيء الذي يدخل في التخليق الحيوي CoQ ، مما يشير إلى أن الآلية الموصوفة للنباتات من المحتمل أن يتم حفظها في الفقاريات.

2. النتائج

لفهم كيفية عمل kaempferol كمقدمة لـ CoQ في خلايا الثدييات ، قررنا اختبار ما إذا كانت الحلقة B من kaempferol هي جزء من الجزيء الذي يدخل في مسار CoQ الحيوي ، كما ورد أنه يحدث في النباتات [18]. لم تنجح جهودنا لتوليف كيمبفيرول كيميائيًا على وجه التحديد 13C المسمى في الحلقة B (13C 6- [B-ring] -kaempferol). كاستراتيجية بديلة ، اخترنا عزل 13C 6- [B-ring] -kaempferol من مزارع نبات Arabidopsis thaliana. مثل هذا التركيب في الجسم الحي للحلقة B المسمى kaempferol ممكن لأن النباتات تستمد الحلقة B من kaempferol حصريًا من مجموعة فينيل من فينيل ألانين [19]. في المقابل ، فإن الحلقة A والحلقة C تنشأ من malonyl-CoA [19]. من خلال تغذية 13C 6- L-phenylalanine (13C 6- Phe) لنباتات Arabidopsis المزروعة في ظروف معقمة ، يمكن للمرء الحصول على kaempferol المسمى على وجه التحديد على B-ring [18]. علاوة على ذلك ، لتعزيز تراكم الكايمبفيرول ، تم إجراء تغذية 13C 6- Phe باستخدام الفلافونويد -30- هيدروكسيلاز أرابيدوبسيس بالضربة القاضية ، والذي لا يمكنه زيادة استقلاب الكايمبفيرول إلى أنثوسيانين [20]. يجب ملاحظة أن الكايمبفيرول الذي تم الحصول عليه بهذه الطريقة يتكون من خليط من 13 درجة مئوية 6- [الحلقة B] -kaempferol بالإضافة إلى kaempferol غير المصنف ، والذي كان موجودًا في أنسجة النبات قبل التغذية بـ 13 درجة مئوية {{36) }} فينيل. كان الإثراء المحدد لـ 13C 6- [حلقة B] -kaempferol في الخليط المستخدم في تجاربنا حوالي 10 بالمائة من إجمالي مجموعة kaempferol (أي ، بدون ملصق بالإضافة إلى المسمى).

باستخدام 13C 6- [B-ring] -kaempferol المستخرج وتنقيته من نبات الأرابيدوبسيس ، عالجنا الفأرالكلىالخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (TKPTS) والمقاسة de novo والمحتوى الكلي لـ CoQ (الشكل 1). تم استخدام kaempferol غير المسمى ، kaempferol المسمى 13C عالميًا (13C-kaempferol) ، و 13 C المسمى 4HB (13C 6-4 HB) كعلاجات تكميلية (الشكل 1 أ). تم تضمين الخلايا المعالجة بمركبات الإيثانول كعنصر تحكم. لاحظنا أنه من حيث إجمالي CoQ (CoQ plus 13C 6- CoQ) ، تمت زيادة كل من CoQ9 و CoQ10 عن طريق العلاج باستخدام kaempferol (بصرف النظر عن الملصق) و 4 HB (الشكل 1 ب ، ج) ، كما هو موضح سابقًا لـالكلىالخلايا [17]. 13C 6- تم اكتشاف CoQ في الخلايا المعالجة بـ 13C-kaempferol و 13 C 6-4 HB ، وهو ما يتفق مع دور هذه المركبات كسلائف حلقة CoQ [17 ، 21]. والجدير بالذكر أن المعالجة بـ 13C 6- [حلقة B] -kaempferol أدت أيضًا إلى تخليق 13C 6- CoQ (الشكل 1 ب ، ج) ، مما يشير إلى أن الحلقة B من kaempferol هي جزء من الجزيء الذي يدخل في التخليق الحيوي CoQ. كما هو متوقع ، أدى وضع العلامات الأقل تحديدًا للحلقة B في خليط 13C 6- [B-ring] -kaempferol / kaempferol إلى انخفاض كمية 13C 6- CoQ (الشكل 1 ب ، ج)

3. مناقشة

Kaempferol هو نوع طبيعي من الفلافونول موجود في الشاي وكذلك في العديد من الخضار والفواكه مثل البروكلي والعنب واللفت والطماطم والحمضيات ، من بين أمور أخرى [22،23]. أكثر الخصائص المعروفة للكايمبفيرول هي آثاره المضادة للالتهابات في كل من الالتهابات الحادة والمزمنة ، ودوره في الوقاية من أنواع متعددة من السرطان [24-26]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه يحمي وظائف الكبد والقلب ويمنع أمراض التمثيل الغذائي والأمراض التنكسية العصبية [24،26]. يُعتقد أن Kaempferol يحقق آثاره المفيدة من خلال تنظيم العديد من المسارات الخلوية [24 ، 26] ، ولكن قد تكون وظيفته المضادة للأكسدة مهمة أيضًا. يقلل كايمبفيرول بشكل كبير من الإجهاد التأكسدي وبيروكسيد الدهون ويمكن أن يحسن نشاط الدفاع المضاد للأكسدة [26]. تعتبر مجموعة C -3 هيدروكسيل مهمة بشكل خاص لهذا النشاط المضاد للأكسدة [27].

في عام 2015 ، Xie et al. [21] وصف أن مركب الريسفيراترول الغذائي ، والذي تم ربطه بفوائد صحية متعددة [28] ، يمكن أن يكون بمثابة مقدمة حلقية في التخليق الحيوي لـ CoQ في الإشريكية القولونية ، والسكاروميسيس سيريفيسياي ، وخلايا الثدييات. في دراسة لاحقة ، تم وصف الكايمبفيرول بشكل إضافي ليكون بمثابة مقدمة حلقة CoQ ولزيادة محتوى CoQ في خلايا الثدييات [17]. ثبت أن الزيادة في CoQ التي يسببها الكايمبفيرول أقوى من التأثير الذي تمارسه مركبات البوليفينول الأخرى ، بما في ذلك ريسفيراترول. في الواقع ، لم تظهر كيرسيتين ، نارينجين ، لوتولين ، وبيكياتانول أي تأثير [17]. ربطت هذه الدراسات بين المنتجات الطبيعية الموجودة بشكل عام في النظام الغذائي والتخليق الحيوي CoQ ، على الرغم من عدم تحديد الآلية المسؤولة عن الدمج. في الآونة الأخيرة ، تم وصف أن تخليق مركبات الفلافونويد مرتبط بالفعل بتركيب CoQ في النباتات [18]. علاوة على ذلك ، أظهر المؤلفون أنه في النباتات ، يتم شق الحلقة B من kaempferol بواسطة بيروكسيدازات غير معروفة تنتج 4HB والتي تدخل مباشرة في مسار التخليق الحيوي CoQ [18].

هنا ، أكدنا أن إنزيمات مماثلة قد تكون موجودة في خلايا الثدييات ، مما يسمح بحدوث آلية مماثلة. على الرغم من أن الدراسات الإضافية ضرورية لتحديد ما إذا كان انقسام الكايمبفيرول في الثدييات ينتج 4HB ، فإن نتائجنا تثبت أن الحلقة B للفلافونول هي جزء من الجزيء الذي يدخل في مسار CoQ الحيوي (الشكل 2). يجب مشاركة هذه الإنزيمات المحددة في النباتات وخلايا الثدييات ولكن يبدو أنها غائبة في S. cerevisiae ، على الأقل في الخلفية الوراثية BY4741 ، حيث تم وصف الخميرة بأنها تتضمن 13C-kaempferol بشكل هامشي جدًا [17]. في النباتات ، تتطلب كيمياء التفاعل التواجد المتزامن لرابط مزدوج بين C -2 و C -3 ، ومجموعة هيدروكسيل على C -3 [18] ، منذ dihydrokaempferol (لا فشل C 2- الرابطة المزدوجة C3) والنارينجين (بدون رابطة C 2- C3 المزدوجة ولا C -3 –OH) في أن تكون ركائز الانقسام البيروكسيدى. الملاحظة المستقلة السابقة بأن apigenin (لا يوجد رابط مزدوج C 2- C3) و naringenin فشل في تحسين محتوى CoQ فيالكلىتدعم الخلايا [17] الفرضية القائلة بأن النباتات والثدييات تشترك في آلية مماثلة.

نظرًا للتوافر الحيوي المحدود لمكملات CoQ10 ، فقد كان تحفيز التوليف الداخلي لـ CoQ هو محور العديد من الدراسات [١.٩]. إن فهم كيفية قيام kaempferol بتقوية مسار التخليق الحيوي CoQ له أهمية كبيرة نظرًا لأن قدرته على زيادة محتوى CoQ الداخلي له إمكانات قوية لتخفيف أوجه القصور في CoQ المرتبطة بالشيخوخة أو المرض. علاوة على ذلك ، يمكن للمرضى أن يجدوا فوائد إضافية لأن الاستهلاك المنتظم للفلافونويد مرتبط بتقليل مخاطر الإصابة بالأمراض المرتبطة بالعمر كما هو موصوف أعلاه [24-26]. على الرغم من أن التوافر البيولوجي للكايمبفيرول منخفض جدًا [29] ، فإن الزيادة في CoQ فيالكلىالخلايالوحظ في الجرعات التي يمكن الحصول عليها من الناحية الفسيولوجية ، عن طريق المكملات عن طريق الفم أو عن طريق استهلاك الأطعمة المحتوية على الفلافونويد [27] ، وحتى كمية تكميلية طفيفة من سلائف CoQ يمكن أن تحرك التدفق الأيضي لصالح تخليق CoQ.

هناك حاجة إلى مزيد من البحث لوصف الكايمبفيرول كمركب فعال لعلاج نقص CoQ. من الضروري إجراء مزيد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي لفهم العلاقة بين kaempferol و CoQ بشكل كامل ، والعثور على الصيغة الأنسب للمركب النشط بيولوجيًا ، وتحديد الإنزيم (الإنزيمات) المسؤول عن الانقسام البيروكسدي.

4. المواد والطرق

4.1 المواد الكيميائية والكواشف

تم الحصول على kaempferol غير المصنف من Santa Cruz Biotechnology، Inc. (دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ 13C 6-4 HB from Cambridge Isotope Laboratories، Inc. (Tewksbury، MA، USA)؛ و 13 C-kaempferol من Isolife (Wageningen ، هولندا). تم الحصول على معايير CoQ9 و CoQ1 0 من Sigma-Aldrich (سان لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصنيع Dipropoxy-CoQ10 بشكل أساسي كما وصفه Edlund [30] لـ diethoxy-Q10 ، فيما عدا 1- تم استبدال البروبانول بالإيثانول مع الحفاظ على الكواشف والظروف الأخرى. تم تحضير 13C 6- [B-ring] -kaempferol من مزارع نباتية في المختبر من نباتات Arabidopsis thaliana flavonoid -30 - هيدروكسيلاز التي تم تغذيتها لمدة 48 ساعة بجرعة 250 ميكرومتر من 13 درجة مئوية 6- L-Phenylalanine ( Cambridge Isotope Laboratories، Inc.، Tewksbury، MA، USA) [18]. تم تجانس الأوراق (حوالي 1.5 جم) باستخدام مطحنة أنسجة Pyrex في 5 × 900 ميكرولتر من الميثانول ، وتم طرد المستخلصات عند 18 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق. تم تجميع المواد الطافية (5 × ~ 800 ميكرولتر) وخلطها إلى حجم متساوٍ من 2 مولار من حمض الهيدروكلوريك وحضنت عند 70 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة من أجل التحلل المائي لاتحادات الجليكوزيل-كايمبفيرول. تم خلط أجزاء التحلل المائي (200 ميكرولتر) مع حجم متساوٍ من 100 بالمائة من الميثانول وطردها عند 18 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة. تم تحديد العينات (100 ميكرولتر لكل منها) بالكروماتوجراف على عمود Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 × 100 مم ، 3.5 ميكرومتر ؛ Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم الاحتفاظ بها عند 30 درجة مئوية باستخدام 25- دقيقة لبدء التدرج الخطي من 10 ملي أمونيوم فورمات درجة الحموضة 3.5 إلى 100 في المائة ميثانول بمعدل تدفق 0.8 مل / دقيقة. تم جمع Kaempferol (18.7 دقيقة) عن طريق مراقبة الامتصاصية عند 365 نانومتر ، وتبخره حتى يجف بغاز النيتروجين ، ثم أعيد تعليقه في ميثانول بنسبة 100 ٪ للتقدير الكمي باستخدام معامل الانقراض الجزيئي البالغ 21242 متر مكعب. أشارت تحليلات MS / MS إلى أن المستحضر يتكون من حوالي 10 بالمائة من 13C المسمى kaempferol (M plus 6) و ~ 90 بالمائة من kaempferol غير المصنف.

4.2 شروط وعلاجات زراعة الخلايا

الفأرالكلىتم توفير الخلايا الطلائية الأنبوبية القريبة (TKPTS) [31] ، من قبل الدكتورة إلسا بيلو ريوس (مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس التقنية ، لوبوك ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) والدكتورة جوديت ك.ماجييسي (جامعة أركنساس للعلوم الطبية ، ليتل روك ، أركنساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). نمت خلايا TKPTS في DMEM / F12 التي تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وتكملها بنسبة 1 0 في المائة من مصل بقري جنيني (FBS) ، و 2 ملي مولار من الجلوتامين L ، وجنتاميسين - أمفوتريسين ب (125 ميكروغرام / مل و 5 مجم. / مل على التوالي). تم الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة إلى قرارات CoQ ، تم زرع الخلايا في 12- ألواح بئر بكمية أولية من 60 ، 000 خلية / بئر ومعالجتها بـ 5 ميكرومتر من kaempferol ، 13C-kaempferol ، 13C 6- [B -Ring] -kaempferol ، أو 1 ميكرومتر 4HB لمدة 48 ساعة. في المنشور السابق حيث وصفنا kaempferol بأنه مقدمة جديدة لـ CoQ ، أجريت تجارب باستخدام 10 ميكرومتر 13C-kaempferol [17]. ومع ذلك ، فإن الكمية المحدودة من 13C 6- [B-ring] -kaempferol المتاحة أدت بنا إلى تقليل التركيز المستخدم ، على الرغم من أن الظروف لا تزال في النطاق حيث تم الإبلاغ عن kaempferol لزيادة محتوى CoQ [17]. تمت إضافة الإيثانول إلى عنصر التحكم حيث تم إبقاء السيارة أقل من 0.05 في المائة من الحجم النهائي. تم تحضين الخلايا تحت ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية ، 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون). بعد الوقت المحدد ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ملحي مخزّن من الفوسفات 1X (PBS) ، وفصله عن لوحات الاستزراع باستخدام التربسين- EDTA (Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تكويرها بواسطة الطرد المركزي منخفض السرعة (حوالي 1000 ×) ز). تمت إزالة المادة الطافية وتخزين كريات الخلية عند درجة حرارة -20 درجة حتى الاستخدام.

4.3 استخراج الدهون

تم تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من 1X PBS. قبل استخلاص الدهون ، تم حفظ 10 قسامات ميكرولتر لقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد [32]. بعد ذلك ، تمت إضافة ديبروبوكسي - CoQ10 إلى 90 ميكرولتر المتبقية كمعيار داخلي. لبدء الاستخراج ، تمت إضافة 2 مل من الميثانول. تم تدوير المعلق الخلوي وتم إضافة 2 مل من الإيثر البترولي. تم نقل طبقة إيثر البترول العلوية (التي تحتوي على جميع الدهون غير القابلة للتصبن ، بما في ذلك CoQ) إلى أنبوب نظيف. تمت إضافة 2 مل آخر من الإيثر البترولي إلى طبقة الميثانول الأصلية ، وتم تدوير العينات مرة أخرى. تمت إزالة الطبقة العلوية ، متحدًا مع الطبقة السابقة ، وتم تجفيف الطور العضوي المجمع تحت تيار من غاز النيتروجين. تم تحضير سلسلة من معايير CoQ9 و CoQ10 التي تحتوي على isopropoxy-CoQ10 واستخراج الدهون بالتزامن مع عينات الخلايا لإنشاء منحنيات قياسية CoQ9 و CoQ10.

4.4. تحليل CoQ

تم تحليل محتوى CoQ9 و CoQ10 المسمى وغير المسمى من المستخلصات الدهنية باستخدام HPLC-MS / MS كما هو موضح سابقًا [17]. باختصار ، تم إعادة تعليق العينات في 200 ميكرولتر من الإيثانول المحتوي على 1 مجم / مل من البنزوكوينون من أجل أكسدة جميع الدهون قبل التحليل. تم استخدام مطياف خطي 4000 QTRAP من شركة أبلايد بيوسيستمز (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام برنامج Applied Biosystem ، الإصدار 1.4.2 من Analyst ، للحصول على البيانات ومعالجتها. تم إجراء الفصل الكروماتوغرافي على عمود Luna 5 ميكرومتر PFP (2) 100A (100 × 4.6 مم ، 5 ميكرومتر ؛ Phenomenex ، Torrance ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام مرحلة متنقلة تتكون من 90 بالمائة من المذيب A (95: 5 خليط من الميثانول: أيزوبروبانول يحتوي على 2.5 ملي فورمات أمونيوم) و 10 في المائة مذيب ب (أيزوبروبانول يحتوي على 2.5 ملي مولار فورمات أمونيوم) بمعدل تدفق ثابت قدره 1 مل / دقيقة. تم تحليل جميع العينات في أوضاع مراقبة تفاعل متعددة. كانت الانتقالات المستخدمة: m / z 795.6 / 197.08 (CoQ9 plus H) ، m / z 812.6 / 197.08 (CoQ9 plus NH3) ، m / z 801.6 / 203.08 (13C-CoQ9 plus H) ، m / z 818.6 / 203.08 (13C) -CoQ9 plus NH3) ، m / z 863 .6 / 197.08 (CoQ10 plus H) ، m / z 880.6 / 197.08 (CoQ10 plus NH3) ، m / z {{63} }.6 / 203.08 (13C) -CoQ10 plus H) ، m / z 886.6 / 203.08 (13C-CoQ10 plus NH3) ، m / z 919.7 / 253.1 (ديبروبوكسي- CoQ10 plus H) ، m / z 936.7 / 253.1 (ديبروبوكسي- CoQ10 زائد NH3). تمت الإشارة إلى مساحة كل قمة ، التي تم تطبيعها باستخدام المنحنى القياسي المقابل والمعيار الداخلي ، على أنها الكمية الأولية للبروتين.

4.5 تحليل احصائي

البيانات الموضحة في هذا العمل تمثل ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء التحليلات والرسومات الإحصائية باستخدام Graphpad Prism 8 (Graphpad Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل الاختلافات في محتوى CoQ بالمقارنة مع عنصر التحكم باستخدام ANOVA حدودي أحادي الاتجاه ، لتصحيح مقارنات متعددة مع اختبار Dunnett اللاحق. تمت الإشارة إلى الفروق الجوهرية باسم * p <0. 0="" 5="" ،="" **="" p=""><0. 0="" 1="" ،="" ***="" p=""><0.001 ،="" و="" ****="" ع=""><>

5. الاستنتاجات

تظهر نتائجنا ذلكخلايا الكلىيمكن أن يشق الحلقة B من الفلافونول الغذائي kaempferol لإنتاج سلائف الحلقة المحتملة للتخليق الحيوي CoQ ، على الأرجح 4HB. هذا التمثيل الغذائي لل kaempferol يعزز التخليق الحيوي CoQ ويزيد من محتوى CoQ. يمكن استخدام قدرة kaempferol هذه في تصميم مكملات أكثر كفاءة للتخفيف من أعراض نقص CoQ في الشيخوخة والمرض. سيكون من الضروري إجراء دراسات فسيولوجية إضافية لتأكيد فعالية مكملات الكايمبفيرول لتحفيز التخليق الحيوي للأوبيكوينون على مستوى الكائن الحي بأكمله.

الكاتب الاشتراكات:التصور ، LF-d.-R. ، ES ، GJB ، و CFC ؛ منهجية LF-d.-R. و ES و GJB و CFC ؛ برنامج ، LF-d.-R. ؛ التحقق من الصحة ، LF-d.-R. ، ES ، GJB ، و CFC ؛ تحليل رسمي ، LF-d.-R. ؛ التحقيق ، LF-d.-R. ، و ES ؛ الموارد ، LF-d.-R. و ES و GJB و CFC ؛ معالجة البيانات ، LF-d.-R. ، ES ، GJB ، و CFC ؛ الكتابة - إعداد المسودة الأصلية ، LF-d.-R .؛ كتابة - مراجعة وتحرير ، LF-d.-R. و GJB و CFC ؛ التصور ، LF-d.-R. ، ES ، GJB ، و CFC ؛ الإشراف و GJB و CFC ؛ إدارة المشروع ، GJB ، و CFC ؛ الحصول على التمويل ، و GJB ، و CFC لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل:تم دعم هذا العمل من قبل National Science Grant MCB -1330803 (CFC) و MCB -1712608 (GJB).

شكر وتقدير:نشكر Anish Nag على توليف dipropoxy-CoQ10. قدمت إلسا بيلو رويس (مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس التقنية ، لوبوك ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وجوديت ك.ماجيسي (جامعة أركنساس للعلوم الطبية ، ليتل روك ، أركنساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) الفأرةالكلىالخلايا الطلائية الأنبوبية القريبة (TKPTS). نشكر خورخي توريس لإتاحة مرافق زراعة الخلايا. نشكر منشأة البروتينات الأساسية للأجهزة الجزيئية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ؛ Yu Chen ، لاستخدام QTRAP4000 لتحليل الدهون ؛ وآنا بلوك في USDA-ARS-CMAVE لتحليلات MS / MS.

تضارب المصالح: الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

--- Journal Molecules (بازل ، سويسرا) ، 25 (13) ISSN 1420-3049 المؤلفون: Fernández-Del-Río et al.
DOI 10.3390 / جزيئات 25132955

مراجع

1. وانغ واي. Hekimi، S. تعقيد صنع ubiquinone. اتجاهات الغدد الصماء. متعب. 2019 ، 30 ، 923-943. [CrossRef] [PubMed]

2. عوض ع. برادلي ، م. فرنانديز ديل ريو ، إل. ناج ، أ. تسوي ، ح. كلارك ، أوجه القصور في الإنزيم المساعد Q10: المسارات في الخميرة والبشر. مقالات Biochem. 2018، 62، 361–376. [CrossRef] [PubMed]

3. Gutierrez-Mariscal، FM؛ يوبيرو سيرانو ، إم ؛ فيلالبا ، جم ؛ Lopez-Miranda، J. Coenzyme Q10: من مقعد إلى عيادة في أمراض الشيخوخة ، مراجعة متعدية. كريت. القس علوم الغذاء. نوتر. 2018 ، 59 ، 2240-2257. [CrossRef] [PubMed]

4. بينينجر ، م. Tekle ، M. ؛ Dallner ، G. التوليف الحيوي Q- الإنزيم ، والوظائف. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 2010 ، 396 ، 74-79. [CrossRef]

5. ستيفلي ، جا. Pagliarini ، DJ الكيمياء الحيوية للتخليق الحيوي لأنزيم الميتوكوندريا Q. اتجاهات Biochem. علوم. 2017 ، 42 ، 824-843. [CrossRef]

6. دياز كاسادو ، مي ؛ كويلز ، جيه إل ؛ باريوكانال-كاسادو ، إي. Gonzalez-Garcia، P.؛ باتينو ، م. لوبيز ، ل. Varela-Lopez، A. مفارقة الإنزيم المساعد Q10 في الشيخوخة. العناصر الغذائية 2019 ، 11 ، 2221. [CrossRef]

7. بينينجر ، م. بريسمار ، ك. Dallner ، G. الدور المضاد للأكسدة لأنزيم q. الميتوكوندريا 2007، 7، S41-S50. [CrossRef]

8. بارسيلوس ، الملكية الفكرية ؛ Haas ، RH CoQ10 والشيخوخة. علم الأحياء (بازل) 2019 ، 8 ، 28. [CrossRef]

9. Hernández-Camacho، JD؛ بيرنير ، م. López-Lluch، G.؛ مكملات Navas، P. Coenzyme Q10 في الشيخوخة والمرض. أمامي. فيسيول. 2018 ، 9 ، 1-11. [CrossRef]

10- كالين أ. Appelkvist ، EL ؛ Dallner ، G. التغيرات المرتبطة بالعمر في التراكيب الدهنية للفئران والأنسجة البشرية. الدهون 1989 ، 24 ، 579-584. [CrossRef]

11. Varela-López، A .؛ جيامبيري ، ف. باتينو ، م. Quiles ، J. Coenzyme Q ودوره في العلاج الغذائي ضد الشيخوخة. جزيئات 2016، 21، 373. [CrossRef] [PubMed]

12. Fan، L .؛ فنغ ، واي. تشين ، جي سي ؛ تشين ، LQ ؛ فو ، سي إل ؛ Chen ، LH آثار مكملات الإنزيم المساعد Q10 على علامات الالتهاب: مراجعة منهجية وتحليل تلوي للتجارب المعشاة ذات الشواهد. فارماكول. الدقة. 2017 ، 119 ، 128-136. [CrossRef] [PubMed]

13. Zhai، J.؛ صبي.؛ لو ، واي. ليو ، سي. Zhang ، L. آثار الإنزيم المساعد Q10 على علامات الالتهاب: مراجعة منهجية وتحليل تلوي. بلوس وان 2017 ، 12 ، e0170172. [CrossRef] [PubMed]

14. شارما ، أ. فونارو ، جي سي ؛ بتلر ، ياء ؛ إيزيكويتز ، جيه إيه ؛ Felker ، GM Coenzyme Q10 وفشل القلب: مراجعة حديثة. سيرك. فشل القلب. 2016 ، 9 ، e002639. [CrossRef]

15. Lee، JS؛ سوه ، جي دبليو ؛ كيم ، إس. Lee ، HG إعداد وتوصيف الجسيمات النانوية اللاصقة المخاطية لتعزيز الامتصاص الخلوي للأنزيم المساعد Q10. J. أجريك. الغذاء تشيم. 2017 ، 65 ، 8930-8937. [CrossRef]

16. Lopez-Lluch، G.؛ ديل بوزو كروز ، ياء ؛ سانشيز كويستا ، أ. كورتيس رودريغيز ، أب ؛ Navas، P. يعتمد التوافر البيولوجي لمكملات الإنزيم المساعد Q10 على الدهون الحاملة والذوبان. التغذية 2018، 57، 133-140. [CrossRef]

17. Fernandez-Del-Rio، L.؛ ناج ، أ. جوتيريز كاسادو ، إي. أريزا ، ياء ؛ عوض ، أ. جوزيف ، منظمة العفو الدولية ؛ كوون ، أو. فيردين ، إي. دي كابو ، ر. شنايدر ، سي ؛ وآخرون. يزيد Kaempferol من مستويات الإنزيم المساعد Q في خلايا الكلى ويعمل بمثابة مقدمة حلقة اصطناعية. راديك مجاني. بيول. ميد. 2017، 110، 176–187. [CrossRef]

18. Soubeyrand، E .؛ جونسون ، تي إس ؛ لاتيمر ، إس. بلوك ، أ. كيم ، ياء ؛ كولكوهون ، تا ؛ بوتيلي ، إي. مارتن ، سي. ويلسون ، ماساتشوستس ؛ Basset ، G. يساهم الانقسام البيروكسيدي في kaempferol في التخليق الحيوي لشق benzenoid of ubiquinone في النباتات. مصنع. الخلية 2018 ، 30 ، 2910–2921. [CrossRef]

19. Kreuzaler، F.؛ Hahlbrock، K. التوليف الأنزيمي للمركبات العطرية في النباتات العليا: تكوين Naringenin (5،7، 4- trihydroxyflavanone) من الإنزيم المساعد p-coumaroyl a و malonyl coenzyme a. FEBS ليت. 1972 ، 28 ، 69-72. [CrossRef]

20- شوينبوم ، سي. مارتينز ، إس. إيدر ، سي ؛ فوركمان ، جي. Weisshaar، B. تحديد جين Arabidopsis thaliana flavonoid 3'-hydroxylase والتعبير الوظيفي عن إنزيم p450 المشفر. بيول. تشيم. 2000 ، 381 ، 749-753. [CrossRef]

21. شي ، LX ؛ وليامز ، كيه جيه ؛ هو ، CH ؛ ونغ ، إي. خونغ ، س. روز ، تي إي ؛ كوون ، أو. بنسنجر ، SJ ؛ ماربويس ، بن ؛ تعمل Clarke و CF Resveratrol و par-coumarate كسلائف حلقية للتخليق الحيوي لأنزيم Q. J. ليبيد الدقة. 2015 ، 56 ، 909-919. [CrossRef] [PubMed]

22. Calderon-Montano، JM؛ بورغوس مورون ، إي. بيريز غيريرو ، سي. Lopez-Lazaro، M. مراجعة على الفلافونويد كايمبفيرول الغذائي. ميني القس. ميد. تشيم. 2011 ، 11 ، 298-344. [CrossRef] [PubMed]

23. Devi، KP؛ مالار ، دي إس ؛ نابافي ، سادس ؛ سوريدا ، أ. شياو ، ياء ؛ Nabavi ، SM ؛ داليا ، م. كايمبفيرول ، والتهاب: من الكيمياء إلى الطب. فارماكول ريس. 2015 ، 99 ، 1-10. [CrossRef] [PubMed]

24. Ren، J. ؛ لو ، واي. تشيان ، واي. تشين ، ب. وو ، تي. جي ، جي التقدم الأخير فيما يتعلق بالكايمبفيرول لعلاج الأمراض المختلفة. إكسب. هناك. ميد. 2019 ، 18 ، 2759-2776. [CrossRef] [PubMed]

25. عمران ، م. صالحي ، ب. شريفي راد ، ج. أسلم جوندال ، ت. سعيد ف. عمران أ. شهباز ، م. تسوه فوكو ، PV ؛ عمير أرشد ، م. خان ، ح. وآخرون. Kaempferol: تركيز رئيسي على قدرته المضادة للسرطان. جزيئات 2019،24، 2277. [CrossRef]

26. عمران م. رؤوف ، أ. شاه ، ZA ؛ سعيد ف. عمران أ. أرشد ، MU ؛ أحمد ، ب. ؛ باوزير ، س. عاطف ، م. بيترز ، دي جي ؛ وآخرون. التأثير الوقائي والعلاجي الكيميائي للفلافونويد كايمبفيرول الغذائي: مراجعة شاملة. Phytother Res. 2019 ، 33 ، 263-275. [CrossRef]

27- كوزلوفسكا ، أ. Szostak-Wegierek ، D. Flavonoids - مصادر الغذاء والفوائد الصحية. روكز. بانستو. زاكل. عالية. 2014 ، 65 ، 79-85.

28. Kursvietiene، L .؛ ستانيفيسيني ، أنا. مونجيردين ، أ. بيرناتونين ، ج. تعدد التأثيرات والفوائد الصحية للريسفيراترول. الطب (كاوناس) 2016 ، 52 ، 148-155. [CrossRef]

29. Zabela، V.؛ سامباث ، سي ؛ أوفير ، م. مرادي أفرابولي ، ف. باترويك ، ف. الحرائك الدوائية للكايمبفيرول الغذائي ومستقلبه 4- حمض الخليك هيدروكسي فينيل في الفئران. فيتوتيرابيا 2016 ، 115 ، 189-197. [CrossRef]

30. Edlund ، PO تقدير الإنزيم المساعد Q10 ، ألفا توكوفيرول ، والكوليسترول في العينات البيولوجية عن طريق الكروماتوجرافيا السائلة ذات العمود المزدوج مع قياس الكولومتر والكشف فوق البنفسجي. تشروماتوجر. ب بيوميد. علوم. تطبيق 1988 ، 425 ، 87-97. [CrossRef]

31. Ernest، S. Bello-Reuss، E. التعبير عن البروتين السكري ووظيفته في خط خلية الكلى للفأر. أكون. J. Physiol. 1995، 269، C323-C333. [CrossRef] [PubMed]

32. Stoscheck ، CM الكميات من البروتين. طرق الانزيم. 1990 ، 182 ، 50-68. [CrossRef] [PubMed] توفر العينة: غير متوفر.