الميتفورمين يحمي الخلايا الظهارية للعدسة من الشيخوخة في نموذج الماوس الطبيعي

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

المقدمة

تشكل الخلايا الظهارية للعدسة (LECs) طبقة أحادية من الخلايا المبطنة للكبسولة الأمامية للعدسة وتمتد إلى قوس العدسة الاستوائية [1 ، 2]. يعتبر البناء الطبيعي ووظيفة LECs ضروريين للحفاظ على الشفافية والتوازن الأيضي للعدسة بأكملها [3]. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن شيخوخة LECs قد تؤدي إلى تعديل وتمسخ وتراكم بروتينات العدسة بما في ذلك الإنزيمات والبلورات ، مما يؤدي في النهاية إلى عتامة العدسة أو حتى إعتام عدسة العين [3-5]. لا يزال إعتام عدسة العين المرتبط بالعمر (ARC) هو السبب الرئيسي لضعف البصر والعمى ، مما يؤثر بشدة على نوعية حياة كبار السن [6]. حاليًا ، لا توجد استراتيجيات فعالة لمنع تطور ARC. لذلك ، من الضروري تطوير تدخل دوائي يمكنه تحسين شفافية العدسة وتأخير تقدم ARC.

على مدى العقود القليلة الماضية ، حقق العلماء تقدمًا ملحوظًا في تحسين الصحة وإطالة العمر باستخدام العديد من التدخلات الجينية والغذائية والصيدلانية [7]. الميتفورمين (MET) هو أحد العوامل المضادة للشيخوخة التي تمت دراستها على نطاق واسع. تشير دراسات كبيرة إلى أن MET يمكن أن يخفف من الشيخوخة ويطيل عمرًا صحيًا في أنظمة النماذج الحيوانية المختلفة. لا يمكن لـ MET إطالة عمر Caenorhabditis elegans فحسب ، بل يمكنها أيضًا تعزيز صحتها وحيويتها [8]. يمكن أن يقلل MET من التراكم المرتبط بالعمر والإجهاد التأكسدي لتلف الحمض النووي في الخلايا الجذعية للمعي المتوسط ​​من ذبابة الفاكهة لإطالة عمرها [9]. تشير الدراسات السابقة أيضًا إلى أن إعطاء جرعات منخفضة مزمنة من MET يحسن صحة الفئران وعمرها [10]. علاوة على ذلك ، تشير الدلائل الناشئة إلى أنه عندما يعالج مرضى السكري بـ MET ، فإنهم يظهرون فوائد للبقاء على قيد الحياة ، حتى عند مقارنتهم بالضوابط الذين لا يعانون من مرض السكري [11].

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

بالإضافة إلى النشاط المعزز لعمر MET في الكائنات الحية النموذجية المختلفة ، يستهدف MET مسارات إشارات خلوية متعددة لتحسين الأمراض المرتبطة بالعمر. لقد ثبت أن MET يعدل الالتهام الذاتي بشكل رئيسي عن طريق تنشيط بروتين كيناز (AMP) المنشط بالأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) ويمنع التنكس العصبي والتهاب الأعصاب للعب دور الحماية العصبية في مرض باركنسون [12]. وبالمثل ، يخفف MET التغيرات المرتبطة بالعمر في الخلايا البطانية الجيبية للكبد عبر مسارات AMPK وأكسيد النيتريك البطاني [13].جرعة cistanche redditعلاوة على ذلك ، فإن تنشيط AMPK المزمن بواسطة MET يمنع اعتلال عضلة القلب عن طريق تنظيم الالتهام الذاتي في الفئران المصابة بداء السكري OVE26 [14]. بالإضافة إلى ذلك ، يخفف MET من تدهور القلب والأوعية الدموية المرتبط بالعمر من خلال تعزيز البلعمة الذاتية وتقييد السعرات الحرارية [15]. علاوة على ذلك ، يمكن أن يمنع علاج MET تصلب الشرايين المرتبط بالعمر في الفئران والأرانب الناتجة عن نظام غذائي عالي الدهون ، مما يمنع بشكل كبير تكلس اللويحات المتصلبة العصيدي ، ويقلل من مستويات البروتين التفاعلي C عالي الحساسية ، ويثبط تنشيط مسار العامل النووي كابا ب (NF-kB) في الأوعية الدموية [16-18].

بناءً على هذه الملاحظات ، حاولت الدراسة الحالية استكشاف ما إذا كان MET يمكن أن يؤخر شيخوخة ARC والآلية الجزيئية الأساسية. النتائج التي توصلنا إليها هي كما يلي: (1) أدى العلاج المزمن بجرعة منخفضة من MET إلى تأخير شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي ، وبالتالي تثبيط عتامة العدسة ؛ (1) تم تعطيل مسار AMPK ، وتعطل التدفق الذاتي في LECs الشيخوخة ؛ (i) ) أدى العلاج المزمن بجرعة منخفضة من MET إلى تأخير شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي عن طريق تنشيط مسار AMPK وتعزيز الالتهام الذاتي. تثبت النتائج التي توصلنا إليها الدور المفترض لمكافحة الشيخوخة لـ MET وتوفر أدلة كافية على أن MET قد يثبت أنه خيار علاجي محتمل لـ ARC.

النتائج

ارتبط شيخوخة LECs بـ ARC في الفئران ذات العمر الطبيعي

تم التحقيق على نطاق واسع في الآليات المحتملة المتعددة لـ ARC ، بما في ذلك تأثير الشيخوخة.فوائد استخراج cistanche ،ومع ذلك ، فإن العلاقة بين شيخوخة LECs و ARC في الجسم الحي لا تزال غير واضحة. افترضنا أن شيخوخة LECs قد تؤدي إلى ARC في الجسم الحي. لذلك ، قمنا ببناء نموذج الماوس لـ ARC. كشفت نتائجنا أن شفافية العدسة في الفئران ذات العمر الطبيعي (الفئران الأكبر سنًا) انخفضت بشكل ملحوظ مقارنةً بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الفئران الصغيرة) (الشكل 1 أ). كما هو مبين في الشكل 1 ب ، كان معدل حدوث إعتام عدسة العين في المجموعة ذات العمر الطبيعي 95.23 في المائة. أشار اختبار تلطيخ H&E إلى أن LECs في المجموعة الضابطة كانت مستديرة الشكل ومرتبة بانتظام ، وكانت كثافة LECs العادية عالية نسبيًا ، في حين أن LECs للفئران ذات العمر الطبيعي كانت مسطحة الشكل ومرتبة بشكل غير متساو ، وكثافة انخفض LECs الشيخوخة بشكل ملحوظ (الشكل 1 ج). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تلوين SA - - Gal أن نسبة LECs المسنة كانت مرتفعة في الفئران ذات العمر الطبيعي (الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، قمنا بتحليل التعبير البروتيني للعلامات المرتبطة بالشيخوخة عبر تلطيخ IHC وتحليل اللطخة الغربية. كشف تلطيخ IHC عن زيادة التعبير عن p21 و p53 في LECs للفئران ذات العمر الطبيعي مقارنة بالفئران الصغيرة (الشكل 1 هـ ، و). وبالمثل ، اكتشفنا أيضًا أن التعبير البروتيني عن p21 و p53 كان أعلى في كبسولات العدسة للفئران ذات العمر الطبيعي مقارنةً بكبسولات العدسة للفئران الصغيرة (الشكل 1 جم). تشير هذه النتائج إلى أن شيخوخة LECs كان مرتبطًا بـ ARC في الفئران ذات العمر الطبيعي.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

حسنت الجرعات المنخفضة المزمنة من MET من شفافية العدسة وخففت من شيخوخة LECs قبل أن نختبر تأثير الميتفورمين على ARC ، قررنا ما إذا كانت الجرعة المنخفضة المزمنة من MET آمنة للفئران. بعد علاج MET لمدة 10 أشهر ، مات 28 فأرًا (18 في المجموعة ذات العمر الطبيعي و 10 في المجموعة MET) لأسباب طبيعية. وجدنا أن الفئران الحية في كلا المجموعتين كانت بصحة جيدة ، ولم يكن هناك فرق كبير في أوزان الجسم وأوزان الأعضاء بين المجموعتين (الجدول 1). لذلك ، أشارت هذه النتائج إلى أن جرعة الميتفورمين المستخدمة في الدراسة كانت آمنة للحيوانات ويمكن استخدامها في التجارب اللاحقة.

بعد ذلك ، تم إعطاء جرعة منخفضة مزمنة من MET لتقييم ما إذا كان MET يمكن أن يثبط عتامة العدسة ويخفف شيخوخة LECs المرتبطة بالعمر في الفئران ذات العمر الطبيعي. كما هو متوقع ، تم تحسين شفافية العدسة في مجموعة MET بشكل كبير مقارنة بشفافية العدسة في المجموعة ذات العمر الطبيعي (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أكدت الملاحظات المورفولوجية أن عدسة مجموعة MET أظهرت انخفاضًا في العتامة. كان معدل حدوث إعتام عدسة العين في المجموعة العمرية بشكل طبيعي 95.23٪ ، بينما كان ذلك في مجموعة MET 19. 00٪ (الشكل 2 ب). كشفت مقايسة تلطيخ H & E أن كثافة LECs في مجموعة MET كانت أعلى بشكل ملحوظ من ذلك في الفئران ذات العمر الطبيعي (الشكل 2 ج). علاوة على ذلك ، كانت LECs الخاصة بمجموعة MET مستديرة نسبيًا مقارنةً بالمجموعة ذات العمر الطبيعي (الشكل 2 ج). أظهر تلوين SA - - أن نسبة LECs المسنة انخفضت بشكل ملحوظ في مجموعة MET مقارنةً بالمجموعة ذات العمر الطبيعي (الشكل 2 د). كشف تحليل IHC أن التعبير عن p21 و p53 قد انخفض أكثر في LECs من مجموعة MET مقارنة بالمجموعة ذات العمر الطبيعي (الشكل 2 هـ ، و). وبالمثل ، كشف تحليل اللطخة الغربية أن التعبير البروتيني عن p21 و p53 انخفض بشكل ملحوظ في كبسولات العدسة لمجموعة MET مقارنة مع تلك الخاصة بالمجموعة ذات العمر الطبيعي (الشكل 2g). تشير هذه النتائج إلى أن إعطاء جرعة منخفضة مزمنة من MET يمكن أن يحسن شفافية العدسة ويخفف من شيخوخة LECs.

خففت إدارة الجرعات المنخفضة المزمنة من MET من شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي عن طريق تنشيط AMPK. تدعم كمية هائلة من البيانات الاستنتاج القائل بأن تنشيط AMPK يكفي لإطالة العمر الافتراضي في الكائنات الحية النموذجية ، مما يزيد من جاذبيته كهدف طول العمر [19،20] . بالنظر إلى هذه النظرية ، قمنا بتقييم التعبير عن مسار AMPK في LECs من الفئران. تم تخفيض مستوى FAS mRNA النسبي في المجموعة ذات العمر الطبيعي وزاد في مجموعة MET (الشكل 3 أ). كما هو مبين في الشكل 3 ب ، ج ، تم تقليل التعبير عن AMPKa الفسفوري (Thr172) و ACC (Ser79) الفسفوري في LECs للفئران ذات العمر الطبيعي مقارنة مع الفئران الصغيرة. ومع ذلك ، فإن التعبير عن AMPKa الفسفوري (Thr172) و ACC الفسفوري (Ser79) كان مرتفعًا في LECs من مجموعة MET مقارنةً بالمجموعة ذات العمر الطبيعي. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل اللطخة الغربية أن التعبير البروتيني عن AMPKa الفسفوري (Thr172) و ACC (Ser79) الفسفوري قد تم تنظيمه بشكل كبير في كبسولات العدسة للمسنين بشكل طبيعي ، ومستويات التعبير البروتيني لـ AMPKa الفسفوري (Thr172) و ACC الفسفوري ( Ser79) في كبسولات العدسة لمجموعة MET (الشكل ثلاثي الأبعاد). كشفت هذه البيانات أن مسار AMPK قد تم تعطيله في LECs للفئران ذات العمر الطبيعي. علاوة على ذلك ، خففت إدارة الجرعات المنخفضة المزمنة من MET من شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي عن طريق تنشيط AMPK.

أعادت إدارة الجرعات المنخفضة المزمنة من MET تدفق البلعمة الذاتية للتخفيف من شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي أشارت الدراسات السابقة إلى أن الالتهام الذاتي قد يلعب دورًا مهمًا في مكافحة الآثار الضارة للشيخوخة [21 ، 22]. لمزيد من تحليل التغييرات الجزيئية والخلوية في العدسة بعد العلاج MET ، حددنا التعبير عن LC3 و p62 لأنهما مقبولان على نطاق واسع كمؤشرات حيوية لمستويات الالتهام الذاتي. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، زاد مستوى التعبير النسبي لـ p62 mRNA بشكل ملحوظ في المجموعة ذات العمر الطبيعي مقارنةً بمجموعة التحكم ؛ ومع ذلك ، كان مستوى تعبير mRNA النسبي لـ p62 خاضعًا للتنظيم إلى حد كبير في مجموعة MET مقارنةً بالمجموعة ذات العمر الطبيعي.cistanche جنكيز خانبالإضافة إلى ذلك ، كشف تلطيخ IHC عن زيادة مستويات البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 السلسلة الخفيفة 3 (LC 3- II / l) و p62 في LECs للفئران المسنة بشكل طبيعي. علاوة على ذلك ، أوضحت نتائجنا أن مستويات LC 3- II / l و p62 انخفضت بشكل ملحوظ في LECs لمجموعة MET (الشكل 4 ب ، ج). تمت زيادة مستويات البروتين في LC 3- ll و p62 بشكل ملحوظ في كبسولات العدسة لمجموعة العمر الطبيعي (الشكل 4 د). إجمالاً ، توقعنا أن تدفق البلعمة الذاتية كان ضعيفًا في LECs للفئران ذات العمر الطبيعي ويمكن استعادتها عن طريق إعطاء جرعة منخفضة مزمنة من MET للتخفيف من شيخوخة LECs في الفئران ذات العمر الطبيعي.

نقاش

يعتبر إعتام عدسة العين غير المعالج سببًا رئيسيًا للعمى في جميع أنحاء العالم والذي يتميز بعتامة العدسة البلورية [23]. أظهرت الدراسات الوبائية أن العمر هو عامل الخطر المهيمن لإعتام عدسة العين ، والمعروف باسم ARC ، والعلاج الوحيد هو الاستئصال الجراحي [24]. أظهرت الدراسات السابقة أن شيخوخة LECs هي السبب الرئيسي لـ ARC [25]. حتى الآن ، لا توجد عوامل علاجية فعالة لتثبيط غشاوة العدسة وتخفيف شيخوخة LECs دون آثار جانبية غير مرغوب فيها. تركزت الدراسة الحالية على تقييم الأساس البيولوجي الجزيئي لشيخوخة LECs وآلية حماية LECs العادية من الشيخوخة. كشفت نتائجنا أن تعطيل AMPK وضعف الالتهام الذاتي كانا مرتبطين مع شيخوخة LECs و ARC. علاوة على ذلك ، وجدنا أن MET قد يحمي LECs من الشيخوخة ويمنع ضبابية العدسة عن طريق تنشيط AMPK وتعزيز الالتهام الذاتي.

الشيخوخة هي عملية بيولوجية أساسية مصحوبة بتدهور عام في وظيفة الأنسجة. مع زيادة العمر ، تصبح الاختلالات المرتبطة بالعمر مثل ARC صحية خطيرة

القضايا [26]. تم الإبلاغ عن شيخوخة LECs للمشاركة في حدوث وتطوير ARC [5]. كشفت نتائجنا أن LECs للفئران ذات العمر الطبيعي كانت مسطحة الشكل ومرتبة بشكل غير متساو ، وانخفضت كثافة LECs بشكل ملحوظ (الشكل 1 ج ، د). بالإضافة إلى ذلك ، تم تنظيم التعبير عن الجينات المرتبطة بالشيخوخة (p21 و p53) في LECs للفئران ذات العمر الطبيعي (الشكل 1 هـ ، و ، ز). أشارت نتائجنا إلى أن شيخوخة LECs كان مرتبطًا بحدوث وتطور ARC. لذلك ، قد يكون الفهم الدقيق للآليات الجزيئية الكامنة وراء شيخوخة LECs مطلوبًا لتوفير الأساس المنطقي لاستراتيجيات العلاج الجديدة.

MET هو أكثر الأدوية الموصوفة على نطاق واسع لخفض سكر الدم عن طريق الفم لمرض السكري من النوع 2 في جميع أنحاء العالم. تشير الدلائل الناشئة إلى أن MET له آثار مفيدة على الصحة تتجاوز تلك المرتبطة بتحسين نسبة السكر في الدم [27]. لقد تم التأكيد على أن آليات MET مهمة لاستهداف المسارات الأساسية في الشيخوخة البيولوجية ، مثل تنشيط AMPK ، وزيادة الالتهام الذاتي ، وتثبيط الالتهاب ، وممارسة التأثيرات المضادة للأكسدة [28]. في البشر ، تم استخدام تقنية MET في الممارسة السريرية لأكثر من 60 عامًا ؛ يتمتع بملف أمان عالٍ ويتمتع بموقع فريد للتدخل في العديد من المسارات الحاسمة المسؤولة عن الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن تأثيرات MET على ARC والآلية التنظيمية لتلك التأثيرات. وبالتالي ، في دراستنا ، أدت الجرعات المنخفضة المزمنة من MET في الفئران ذات العمر الطبيعي إلى تحسين شفافية العدسة (الشكل 2 أ) وتخفيف شيخوخة LECs في الجسم الحي (الشكل 2).

من المسلم به على نطاق واسع أن MET ينشط مسار AMPK وهو الآلية المحتملة لـ MET لممارسة تأثير مضاد للشيخوخة [29]. يلعب جهاز استشعار الطاقة الخلوية AMPK دورًا مهمًا في تنظيم توازن الطاقة الخلوية [30]. أوضحت العديد من الدراسات أن AMPK تعمل كمتكامل ووسيط للعديد من المسارات والعمليات التي تربط علم الطاقة بطول العمر. في دراستنا ، وجدنا أن تعطيل AMPK كان سمة من سمات LECs الشيخوخة في الفئران ذات العمر الطبيعي (الشكل 3). بعد ذلك ، تم إظهار MET لتحفيز مسار AMPK لمنع شيخوخة LECs (الشكل 3). كمنشط AMPK راسخ ، يُعزى دور MET في الوقاية من الشيخوخة عمومًا إلى آثاره على تعديل مسارات إشارات المصب ، مثل استعادة الالتهام الذاتي ، وتفعيل Sirt1 و Foxo1 وقمع mTOR [31،32]. قدمت دراستنا خطًا جديدًا من الأدلة التي تؤكد على أهمية وظيفة AMPK التي يتم تنشيطها بواسطة MET في منع حدوث ARC.

كما ذكر أعلاه ، يتواصل AMPK مع العديد من المسارات والبروتينات لممارسة تأثير مضاد للشيخوخة ، بما في ذلك زيادة الالتهام الذاتي. اجتذبت عملية الالتهام الذاتي ، التي ظهرت كعملية أساسية لضمان طول العمر ، اهتمامًا واسع النطاق كهدف علاجي محتمل للأمراض المرتبطة بالعمر. الالتهام الذاتي هو عملية بيولوجية معقدة متعددة الخطوات. تسمى العملية الكاملة للالتهام الذاتي التدفق الذاتي ، والذي يستخدم على نطاق واسع لتعكس مستوى الالتهام الذاتي. كمؤشر على البلعمة الذاتية ، فإن LC 3- Il مرتبط بإحكام بغشاء البلعمة الذاتية الذي يتحلل بفعل الإنزيمات الليزوزومية.تمديد الحياة cistancheوبالمثل ، فإن p62 ، ركيزة خاصة بالتهمة الذاتية ، عادة ما تتحلل في جسيم البلعمة الذاتية ، ويعكس تعبيرها بشكل غير مباشر مستوى الالتهام الذاتي. في هذه الدراسة ، أشارت النتائج التي توصلنا إليها إلى أن مستوى الالتهام الذاتي انخفض بشكل واضح في LECs الشيخوخة (الشكل 4) ، بينما عكس MET ضعف الالتهام الذاتي المرتبط بالعمر (الشكل 4). تُعزى الآلية الجزيئية المضادة للشيخوخة في MET إلى الوظيفة الأساسية لـ AMPK في الخلايا لأنها تعزز بشكل عام الالتهام الذاتي عبر تنشيط AMPK [33]. علاوة على ذلك ، يظهر MET لزيادة الالتهام الذاتي بشكل مباشر ، مما يساهم في منع الشيخوخة [34]. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التفصيلية لتوضيح الآليات الأساسية ، مما يثبت أن MET يعزز الالتهام الذاتي عبر مسار AMPK مستقل أو معتمد.

لقد ثبت أن انتشار ARC لم يرتبط بالجنس في السكان من أصل آسيوي [35 ، 36]. لذلك ، لم نعتبر الجنس عاملاً قد يؤثر على ARC. يجب تفسير دراستنا مع مراعاة القيود المذكورة أعلاه.

استنتاج

باختصار ، لقد أثبتنا أن تعطيل مسار AMPK والضعف المرتبط بالعمر في الالتهام الذاتي قد يساهم في شيخوخة LECs وحدوث ARC. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت البيانات من تجاربنا أن MET أخّر بشكل فعال شيخوخة LECs وتشكيل ARC من خلال تنشيط مسار AMPK وزيادة الالتهام الذاتي. النتائج التي توصلنا إليها هي خط أساسي لمزيد من التحقيق في الآليات الجزيئية المفيدة في دور MET أثناء عملية الشيخوخة في ARC وستكون مفيدة لإجراء المزيد من الدراسات المكثفة حول تطوير استراتيجيات جديدة ضد حدوث وتطور ARC.

المواد والطرق الكواشف

تم شراء MET من شركة Bristol-Myers Squibb (الصين). تم الحصول على SQSTM1 / p62 (3340-1) من Abcam (MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة ضد LC3 (12741) و phospho-acetyl CoA carboxylase (p-ACC) (Ser79) (3661) من Cell Signaling Technology ( ماجستير ، الولايات المتحدة الأمريكية).

الحيوانات والعلاج

تم شراء الفئران الذكور C57BL6J التي كان عمرها 3 و 8 أشهر من شركة Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (بكين ، الصين). تم إيواء الفئران في ظروف يتم التحكم في درجة حرارتها (درجة الحرارة ، 20-25 درجة ورطوبة نسبية ، 55 ± 15 بالمائة) مع دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة ، مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. تمت الموافقة على جميع الإجراءات والبروتوكولات التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة هاربين الطبية.

تم تقسيم الفئران إلى المجموعات الثلاث التالية: (1) المجموعة الضابطة التي تحتوي على فئران صغيرة (بعمر 3 أشهر ، وزن الجسم =29. 72 ± 1.66 جم ، ن =40) تلقت نظامًا غذائيًا قياسيًا من الفئران والمياه إعلان بالشهرة ؛ عندما كان عمر الفئران شهرًا واحدًا 0 ، تم تقسيم 120 فأرًا بشكل عشوائي إلى مجموعتين: مجموعة العمر الطبيعي ومجموعة MET. (1) الفئة العمرية بشكل طبيعي (الفئران الأكبر سنًا ، 20 شهرًا ، وزن الجسم =32. 98 ± 1.93 جم ، ن =60) تلقت نظامًا غذائيًا قياسيًا للماوس ومنقى للإعلان عن الماء ؛ (2) مجموعة MET ( 20 شهرًا ، وزن الجسم =31. 21 ± 2.81 جم ، ن =60) تم الحفاظ عليه على نظام غذائي قياسي منقى للماوس والماء حتى بلغ عمر الفئران 10 أشهر ؛ وبعد ذلك بدأ العلاج. تم تغذية الفئران في مجموعة MET بنظام غذائي مكمل بنسبة 0.1 في المائة من MET (بريستول مايرز سكويب ، الصين) والماء مجانًا لمدة 10 أشهر.

عزل العدسات وكبسولات العدسة

تم التخلص من الفئران عن طريق خلع عنق الرحم. تم استئصال العين بأكملها على الفور من جميع حيوانات التجارب ووضعها في محلول ملحي معقم. تم وضع العصب البصري لأعلى وتثبيته بملاقط. ثم تم عمل شق في العصب البصري الذي يدخل العين ، وسحب الصلبة للخلف لكشف العدسة.cistanche nzبعد ذلك ، استخدمنا ملاقط لإزالة أجزاء الجسم الهدبية برفق على المستوى الاستوائي للعدسة. تم التقاط صور للعدسة الجديدة على الفور ، وتم إصلاح العدسة بسرعة بنسبة 4 في المائة لامتصاص العرق في درجة حرارة الغرفة. تم تقشير كبسولات العدسة بأكملها بسرعة من العدسة المتبقية ، وتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند 80 درجة مئوية للتجارب اللاحقة.

الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E)

تم إصلاح العدسة الجديدة على الفور بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة ودمجها في البارافين. للفحص النسيجي ، تم تقطيع الأنسجة إلى شرائح 4- ميكرومتر. بعد إزالة الكافيين وإعادة التميؤ ، تم تلطيخ أقسام البارافين المحضرة بمحلول الهيماتوكسيلين (H) لمدة 8 دقائق ، تليها 5 غمس في 1 بالمائة من الإيثانول الحمضي (1 بالمائة HCI في 70 بالمائة إيثانول)

والشطف بالماء المقطر. بعد ذلك ، تم تلطيخ المقاطع بمحلول يوزين (E) لمدة 3 دقائق ، متبوعًا بالجفاف باستخدام كحول متدرج وإزالة بالزيلين. لوحظت تغيرات مورفولوجية تحت المجهر (نيكون ، إكليبس ، اليابان).

تم قياس نشاط Senescence-related -galactosidase (SA - - Gal). {12}} 030). وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، تم غسل أقسام الأنسجة ، بعد سلسلة من العلاجات ، بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات) ثم تم تحضينها في محلول تلوين غالون SA - - (درجة الحموضة 6.0) عند 37 درجة بدون CO2 لمدة 24 ساعة. تم التقاط الصور تحت المجهر الضوئي (نيكون ، إكليبس ، اليابان). تم تقدير النسبة المئوية للخلايا الموجبة للـ SA - - على أنها متوسط ​​عدد الخلايا الموجبة / متوسط ​​عدد الخلايا الإجمالي.

تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (gRT-PCR) تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي من كبسولات العدسة للفئران باستخدام كاشف TRlzol. تم إجراء النسخ العكسي باستخدام ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). تم إجراء تحليل النسخ العكسي الكمي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (qRT-PCR) باستخدام SYBR Green Supermix

عدة (تاكارا ، طوكيو ، اليابان) ، مع اكتين كعنصر تحكم داخلي. تم فحص النسخ للعديد من الجينات المستهدفة ، بما في ذلك FAS (الأمام ، 5'-TTGCTGCACTACAGAATGC -3 'والعكس ، 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT -3') ، p62 (إلى الأمام ، 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA {{-3. 10}} والعكس ، 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT -3 ') و -actin (الأمام ، 5' -TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC -3 'والعكس ، 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG -3'. النسبي كانت مستويات كل تعبير جيني

طريقة. تم تطبيعه إلى -اكتين وحسابه باستخدام 2- △△ ct r تلطيخ كيميائي مناعي (IHC) تم استخدام إجمالي 5 أقسام تمثيلية من كل من العدسات المختارة {{12} لكل مجموعة لتحليل الكيمياء المناعية (IHC) لتقييم التعبير عن p21 و p53 و p-AMPK و p-ACC و LC3 و p62. بعد تحضين العينات المحضرة عند درجة 6 0 لمدة ساعتين ، تم تمريرها عبر الزيلين وسلسلة كحول متدرج لإزالة الكافيين. بعد ذلك ، تم غلي العينات في 0.1 مولار من حامض الستريك (الرقم الهيدروجيني 6.1) لمدة 30 دقيقة وتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، تم نقع العينات بـ 0.3٪ H O ، لتثبيط نشاط بيروكسيداز داخلي المنشأ. بعد ذلك ، تمت إضافة الأجسام المضادة الأولية وتبريدها عند 4 درجات مئوية ، طوال الليل. تم تحضين الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل باستخدام PBS ، تم تحضين العينات في ديامينوبنزيدين (DAB) حتى يتم تطوير كثافة البقعة المطلوبة. تم التقاط صور للخلايا الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر نيكون إكليبس (نيكون ، إكليبس ، اليابان).

تحليل لطخة غربية

تم استخلاص البروتين الكلي من كبسولات العدسات من الفئران باستخدام عازل (RIPA) مع مزيج مثبط البروتياز (بيرس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم استخدام مجموعة حمض البيسينشونينيك (BCA) (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) لقياس تركيز البروتين. . تم تحليل البروتين الكلي （40 ميكروغرام باستخدام دوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ونقله كهربائياً على أغشية مرشح ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (ميليبور ، ألمانيا). تم تحضين الأغشية طوال الليل بجسم مضاد أولي عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. عدة (بيرس للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة الأمريكية). أجريت ثلاث تجارب مستقلة.

تحليل احصائي

تم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري (SD). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism 7. 0 و Microsoft Excel. تم قياس كمية البروتين باستخدام برنامج Image J. تم استخدام اختبار الطالب وتحليل التباين (ANOVA) لحساب الدلالة الإحصائية للبيانات التجريبية. الاختلافات مع القيمة P.<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

توافر البيانات

تم تضمين مجموعات البيانات التي تم استخدامها وتحليلها خلال الدراسة الحالية في هذه المقالة المنشورة.

تم استخراج هذه المقالة من www.nature.com/cddiscovery