طرق لتوليد وتقييم نماذج الزرد لأمراض الكلى البشرية الجزء 1

خلاصة

تؤثر الاضطرابات المرتبطة بالكلى على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. أظهر مسح لمرضى أمراض الكلى المزمنة (CKD) أن عبء أمراض الكلى يتزايد كل عام. صنفت دراسة العبء العالمي للأمراض (GBD) لعام 2017 مرض الكلى المزمن على أنه السبب الرئيسي الثاني عشر للوفاة في جميع أنحاء العالم. ومن ثم ، فإن تحديد أسباب أمراض الكلى ، وتطوير طرق التشخيص الدقيقة ، والعلاجات الجديدة تعتبر وثيقة الصلة بالموضوع. تلعب الكائنات الحية النموذجية التي تلخص الأمراض البشرية بأمانة أدوارًا مهمة في فهم عملية المرض وتوفر أرضية قيمة لإيجاد علاج لها. يعتبر سمك الزرد نموذجًا ممتازًا لدراسة التطور والفيزيولوجيا المرضية والجوانب الجزيئية لأمراض الكلى البشرية. في هذه المراجعة ، نلخص العديد من التلاعبات الوراثية والتجريبية التي يمكن إجراؤها في أسماك الزرد لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الكلى البشرية بشكل أفضل. نقترح أن تكون هذه الطرق مفيدة في تطوير علاجات محتملة لعلاج أمراض الكلى.

وفقًا للدراسات ذات الصلة ،cistancheهو عشب صيني تقليدي تم استخدامه لعدة قرون لعلاج الأمراض المختلفة. لقد ثبت علميًا أنه يمتلك خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للشيخوخة ومضادة للأكسدة. أظهرت الدراسات أن الكستانش مفيد للمرضى الذين يعانون من أمراض الكلى. من المعروف أن المكونات النشطة للكيستانش تقلل الالتهاب وتحسن وظائف الكلى وتستعيد خلايا الكلى التالفة. وبالتالي ، فإن دمج الكستانش في خطة علاج أمراض الكلى يمكن أن يقدم فوائد كبيرة للمرضى في إدارة حالتهم. يساعد Cistanche على تقليل البيلة البروتينية ، ويقلل من مستويات BUN والكرياتينين ، ويقلل من خطر حدوث المزيد من تلف الكلى. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد cistanche أيضًا في تقليل مستويات الكوليسترول والدهون الثلاثية التي يمكن أن تكون خطيرة على المرضى الذين يعانون منمرض كلوي.

انقر فوق Cistanche Norge

لمزيد من المعلومات:

ديفيد دينغ

@ wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501

الكلمات الدالة:CKD ، AKI ، نموذج لأسماك الزرد لأمراض الكلى البشرية ، والكلية ، وأمراض الكلى

مقدمة

الكلى هي أحد الأعضاء الحيوية في الفقاريات التي تزيل الفضلات وتحافظ على الأس الهيدروجيني والأيونات وتركيزات المستقلب في الدم ضمن النطاق الفسيولوجي. تفرز الكلى إرثروبويتين الذي ينظم إنتاج خلايا الدم الحمراء وينشط فيتامين د الذي يساعد العظام على امتصاص الكالسيوم. يوجد حوالي مليون نيفرون في كل كلية بشرية ، وهي الوحدات الهيكلية والوظيفية لهذا العضو. وبالتالي ، فإن عيوب النيفرون تؤثر على بنية ووظائف الكلى. يمكن أن يحدث الخلل الوظيفي في الكلى بسبب الطفرات الجينية أو العدوى أو الإصابة أو الأدوية أو التعرض لمركبات سامة في البيئة. تعتبر الأمراض المزمنة مثل مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم من العوامل الرئيسية المساهمة في عبء أمراض الكلى (ليفي وآخرون ، 2010). يزيد ضعف وظائف الكلى من خطر حدوث مضاعفات في أنظمة الأعضاء الأخرى أيضًا (Thomas et al. ، 2008). الأنواع الشائعة لأمراض الكلى وأسبابها موضحة في الجدول 1.

أمراض الكلى

تساهم أمراض الكلى في جزء كبير من عبء المرض على مستوى العالم. يتأثر حوالي 750 مليون شخص في جميع أنحاء العالم باضطرابات متعلقة بالكلى (Crews et al. ، 2019). CKD هو الأكثر شيوعًا بينهم مع انتشار عالمي بنسبة 13.4 في المائة (Hill et al. ، 2016). صنفت دراسة عبء المرض العالمي لعام 2010 مرض الكلى المزمن على أنه السبب الرئيسي الثامن عشر للوفاة في جميع أنحاء العالم ، والذي قفز إلى المرتبة الثانية عشرة بحلول عام 2017 لتسببه في الحد الأقصى لعدد الوفيات على مستوى العالم (Jha et al. ، 2013 ؛ Carney ، 2020). وفقًا لدراسة عبء المرض العالمي في عام 2017 ، تم الإبلاغ عن حوالي 697.5 مليون حالة من مرض الكلى المزمن في جميع أنحاء العالم ، من بينهم 1.2 مليون شخص ماتوا. من المقدر أن يرتفع عدد الوفيات بسبب مرض الكلى المزمن إلى 4 ملايين بحلول عام 2040 في سيناريو أسوأ الحالات (فورمان وآخرون ، 2018). يعيش ثلث مرضى الكلى المزمن في دولتين ، الصين والهند (بيكبوف وآخرون ، 2020). حالة CKD بين السكان الهنود غير واضحة بسبب عدم وجود أنظمة دقيقة لجمع البيانات. تم الإبلاغ عن حوالي 115 مليون حالة من CKD في الهند في عام 2017 (Bikbov et al. ، 2020). أكثر الأمراض شيوعًا بين سكان الهند هي مرض السكري وارتفاع ضغط الدم (Geldsetzer et al. ، 2018). وفقًا لتقرير المجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR) ، يبلغ معدل انتشار مرض السكري وارتفاع ضغط الدم بين السكان البالغين في المناطق الحضرية 28 بالمائة و 21.4 بالمائة على التوالي (فارما ، 2015). ما بين 40 في المائة إلى 60 في المائة من مرض الكلى المزمن ، تحدث الحالات بسبب هذه المضاعفات ويتزايد عددها بسرعة (Rajapurkar et al. ، 2012). أبلغ مركز بيانات أمراض الكلى التابع للجمعية الدولية لأمراض الكلى عن انتشار بنسبة 16.8 في المائة من CDK بين السكان الهنود (Ene-Iordache et al. ، 2016). تختلف أسباب CKD في جميع أنحاء الهند. أبلغت ولاية أندرا براديش وأوديشا وجوا عن مستويات عالية من مرض الكلى المزمن لأسباب غير معروفة تعرف باسم اعتلال الكلية الخلالي المزمن (فاروجيز وأبراهام ، 2018). نظرًا لأن عدد مرضى الكلى المزمن يتزايد في جميع أنحاء العالم بمعدل ينذر بالخطر ، فهناك حاجة ملحة لإجراء تحليل شامل للأسباب الجذرية لأمراض الكلى الشائعة لإيجاد طرق أفضل للوقاية منها وعلاجها. يمكن أن توفر الكائنات الحية النموذجية التي يمكن أن تحاكي فسيولوجيا الإنسان والظروف المرضية طرقًا رائعة لمعالجة المشكلات المذكورة أعلاه. لقد أصبح سمك الزرد نموذجًا مفيدًا لدراسة التطور والأمراض وتقديم طرق واعدة لتحديد أهداف وعقاقير علاجية جديدة. في هذه المراجعة ، ناقشنا طرقًا مختلفة لتلخيص أمراض الكلى البشرية في الزرد وكيف يمكن استخدام هذه النماذج لفهم إمراضية المرض وآلياته الجزيئية الكامنة. قد يؤدي هذا إلى توليد أساليب علاجية جديدة لإدارة وعلاج أمراض الكلى.

أوجه التشابه بين كلية الإنسان والسمك الزرد

يعتبر نمو الكلى في الثدييات فريدًا من نوعه لأنه يحدث من خلال ثلاثة هياكل متميزة أثناء التطور الجنيني: الكبر ، والكلية المتوسطة ، والكلية الكبرى. الهيكلان الأولان عابران في الثدييات ولا يستمر سوى metanephros طوال الحياة (Smyth et al. ، 2017 ؛ Jain ، 2014). Pronephros هي الكلية الوظيفية أثناء التطور الجنيني في الفقاريات السفلية مثل البرمائيات والأسماك ، والتي يتم استبدالها بالكلية المتوسطة باعتبارها الكلية الوظيفية في مراحل لاحقة (Tahara et al. ، 1993 ؛ Diep et al. ، 2015). يصف الجدول 2 المدة الزمنية لأشكال مختلفة من الكلى في البشر ، والفئران ، و Xenopus ، والزرد.

على الرغم من أن التعقيد الكلي للكلية يزداد كلما تحركنا نحو الأشكال الأعلى ، فإن النيفرون هي الوحدات الهيكلية والوظيفية لجميع أنواع الكلى. يتكون كل نيفرون من ثلاثة أجزاء: الجسيم الكلوي لتصفية الدم ، والنبيبات لامتصاص وإفراز المواد المذابة ، وقناة التجميع لجمع النفايات غير المرغوب فيها لإخراجها. يتم نقش النسيج الطلائي الأنبوبي في أجزاء مختلفة للقيام بوظائف محددة. تمتلك النيفرون من جميع أشكال الكلى نمط تجزئة مشابه (Desgrange و Cereghini ، 2015). يشبه التنظيم القطاعي للنبيبات الكلوية الزرد والكلية المتوسطة الثدييات ، كما هو مبين في الشكل 1. ) والأنابيب المتأخرة البعيدة (DL) ، والتي تشبه نمط تجزئة النيفرون الميتانيكي للثدييات. الزرد لديه غدة صماء تسمى كريات ستانيوس (CS) ، والتي تحافظ على توازن الكالسيوم (كريشنامورثي ، 1976). يتكون CS من خلال تمايز الخلايا الظهارية الكلوية بين مقاطع DE و DL ، والتي تنفصل تدريجياً عن النبيبات وتشكل الغدة CS المقترنة التي يتم وضعها خلف الصفاق على سطح الكلية في الأسماك البالغة (روبرتس وإيليس ، 2012 ؛ نايلور) وآخرون ، 2018). أحد الاختلافات الرئيسية بين نيفرون الزرد والثدييات هو عدم وجود حلقة Henle في الزرد ، والتي تعمل كمضاعف للتيار المعاكس لتوليد التدرج التناضحي النخاعي للحفاظ على المياه. هذا الجزء ليس له أي فائدة في الزرد لأنه من أسماك المياه العذبة (Elmonem et al. ، 2018). يمتلك كل جزء أنواع خلايا مميزة وتعبيرات جينية خاصة بالقطعة ، والتي يتم حفظها بين الفقاريات (Verlander ، 1998 ؛ Desgrange and Cereghini ، 2015). تتبع جميع أنواع الكلى مسارات نمو متشابهة. تشارك المراحل الأربع التالية على التوالي في تطوير النيفرون ؛ أ: تحريض الأديم المتوسط ​​لتكوين البريمورديوم الكلوي ، ب: الاندمال الظهاري ونمو القناة الكلوية ، C: نمذجة النيفرون إلى أجزاء متخصصة ، و D: أوعية النيفرون لترشيح الدم (دروموند ، 2003).

طرق توليد نماذج الزرد لأمراض الكلى البشرية

تمتلك أسماك الزرد زوجًا واحدًا من الكبريتات التي تبدأ في التكوين بعد 12 ساعة بعد الإخصاب (hpf) وتصبح تعمل بكامل طاقتها بمقدار 48 حصانًا. توافر تسلسل الجينوم الكامل ، 71 في المائة من الجينات البشرية لديها على الأقل مقوم واحد لأسماك الزرد ، سهولة التعامل ، الأجنة الشفافة ، وقت التوليد القصير ، تقنيات التلاعب الجيني الفعالة ، طرق توليد الأسماك المعدلة وراثيا والفحص السريع تجعل الزرد هو النموذج الأنسب لكائن الحي دراسة تشوهات الكلى (Howe et al. ، 2013 ؛ Poureetezadi and Wingert ، 2016). تتمثل إحدى السمات الحاسمة لأسماك الزرد البالغة في قدرتها على تجديد نيفرونات جديدة من خلال عملية تكوين الكلية الجديدة استجابةً لإصابة الكلى (Chambers and Wingert ، 2016). يصف الجدول 3 المقارنات بين أسماك الزرد وكائنات النماذج الشائعة الأخرى مثل الفئران و Xenopus. أظهرت التلاعبات الجينية في أسماك الزرد أنه يمكن تحديد المكونات الجينية الجديدة لتطور الكلى ووظيفتها باستخدام هذا الكائن الحي النموذجي (Poureetezadi and Wingert ، 2016). هناك عدة طرق لتوليد نماذج من أسماك الزرد لأمراض الكلى البشرية.

علم الوراثة إلى الأمام

تُستخدم شاشة الوراثة الأمامية لتحديد الجينات المرتبطة بالأنماط الظاهرية محل الاهتمام (لوسون وولف ، 2011). يتم استخدام كل من الطفرات الكيميائية والتدخلية في شاشات الوراثة الأمامية (Patton and Zon ، 2001). الطفرات الكيميائية عبارة عن فحص قائم على ثلاثة أجيال يتم فيه علاج الذكور البالغين بالمطفرات الكيميائية مثل إيثيل ميثان سلفونات (EMS) أو إيثيل نيتروسوريا (ENU) أو المطفرات الفيزيائية مثل إشعاع جاما لتوليد العديد من الطفرات في الخلايا الجرثومية (فارشني و بيرجس ، 2014). ثم يتم تهجين الطفرات الحاملة للأسماك مع الإناث من النوع البري لتوليد أسماك F1 التي تحتوي على أليلات فريدة من الطفرات المتولدة. يتم تجاوز أسماك F1 لتوليد حاملات F2 التي يتم تهجينها بعد ذلك للحصول على طفرات متماثلة اللواقح في الجيل F3. ثم يتم عزل النسل الذي يحتوي على الأنماط الظاهرية المرغوبة واستخدامه في رسم الخرائط الجينية والتسلسل لتحديد الجين المتحور (Patton and Zon ، 2001). يمكن أن تساعد الاختلافات الأخرى في هذه الشاشة ، مثل استخدام أحادي الصيغة الصبغية ومتماثلة اللواقح ثنائية الصبغيات ، في تقليل الوقت والجهد اللازمين لتحديد النمط الظاهري والطفرة الجينية المسببة (تمت مناقشتها بالتفصيل بواسطة Patton and Zon ، 2001). يمكن دمج خطوط المراسل المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في العضو المعني مع الفحص الجيني التقليدي للأمام لفحص المسوخات ذات الأهمية بسهولة. أدت شاشة الطفرات القائمة على ENU إلى تحديد أسماك الزرد المتحولة المصباح (lib) والتي تظهر عيوبًا مورفولوجية وتجزئة النيفرون مشابهة لأجنة الزرد التي تعاني من نقص حمض الريتينويك (RA). لقد وجد أن متحولات lib لها انتقال C إلى A في النيوكليوتيد 174 من aldh1a2 ، والذي من المتوقع أن يصنع بروتينًا مبتورًا بطول 58 من الأحماض الأمينية ، وبالتالي يلغي وظيفة aldh1a2 ويؤثر على تخليق RA من الشبكية. كشف تحليل lib ، بدون رقبة (nls) متحولة ذات طفرة نقطية في المجال التحفيزي للأجنة المعالجة aldh1a2 و DEAB (مثبط تخليق حمض الريتينويك) أن مستويات RA تعدل تجزئة النيفرون عن طريق تغيير التعبير المكاني لقطاعات عوامل النسخ المحددة (Wingert و Davidson، 2011؛ ​​Begemann et al.، 2001؛ Mullins et al.، 1994). ساعد متحولة أخرى تسمى Zeppelin في تحديد brac2 كمنظم لتطور الخلايا البودوسية (Kroeger et al. ، 2017).

الطفرات الإدراجية هي طريقة تعتمد على الترانسبوزون أو مضاد للفيروسات تُستخدم لإدخال الحمض النووي بشكل عشوائي في مواضع جينية مختلفة ، ثم يساعد هذا الحمض النووي الغريب في تحديد الجين المتحور (أمستردام وآخرون ، 1999). أجرى مختبر هوبكنز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا شاشة طفرات إدخال في أجنة الزرد باستخدام ناقلات الفيروسات القهقرية. حددوا 12 جينًا كانت مرتبطة بأنماط ظاهرية معيبة في الكلى تظهر كيسات في المنطقة الأنبوبية الكبيبية ، من بينها أربعة مرتبطة بتكوين الأهداب (Sun et al. ، 2004). تتمثل عيوب نهج علم الوراثة المتقدم في أن عملية الفحص مرهقة وتستغرق وقتًا طويلاً. ومع ذلك ، فإن التطورات في تكنولوجيا التسلسل الجديدة جعلت منهج علم الوراثة المتقدم أكثر كفاءة.

الضربة القاضية للجينات باستخدام نوكليازات قابلة للبرمجة

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لاستخدام الزرد ككائن حي في توافر تقنيات فعالة لتحرير الجينوم مثل CRISPR / Cas و TALEN و ZFN (Sertori et al. ، 2016). تعد تقنية CRISPR (التكرار المتناوب القصير المتباعد بشكل منتظم متباعد المسافات) / Cas9 أكثر تقنيات تحرير الجينوم تنوعًا وشائعة الاستخدام في أسماك الزرد. تم تصميم الوهم من CRISPR RNA (crRNA) و crRNA المنشط عبر (tracrRNA) كدليل واحد RNA (sgRNA) ، والذي يتم حقنه جنبًا إلى جنب مع بروتين Cas9 / mRNA في أجنة الزرد في مرحلة الخلية الواحدة (Varshney et al. ، 2016). يرتبط sgRNA بتسلسل الحمض النووي المستهدف 20bp المجاور لسلسلة NGG المجاورة لـ protospacer (PAM) في الجينوم ، ثم يولد Cas9 قطعًا مزدوجًا في تسلسل الحمض النووي المستهدف. يُفضل بعد ذلك إصلاح هذا من خلال الانضمام إلى طرف غير متماثل ، وهو عبارة عن آلية إصلاح عرضة للخطأ تؤدي إلى توليد إدخال / حذف عشوائي (indel) مما يؤدي إلى تغييرات في إطار القراءة لتسلسل التشفير ، وبالتالي ، يلغي وظائف الجين المعني. تم تطوير منهجيات متقدمة في السنوات الأخيرة لزيادة فعالية تقنية تحرير الجينوم القائمة على كريسبر (Liu et al. ، 2019). من الممكن حذف جزء كبير من الحمض النووي باستخدام اثنين أو أكثر من sgRNAs في وقت واحد (Kim and Zhang ، 2020). من الممكن أيضًا استهداف جينات متعددة في وقت واحد بكفاءة في جنين واحد من أسماك الزرد (Shah et al. ، 2016). تم إجراء العديد من الدراسات لتوليد طفرات الزرد لتلخيص أمراض الكلى البشرية باستخدام تقنية CRISPR / Cas9. أدت الضربة القاضية بوساطة CRISPR لبروتين الغشاء الهدبي Arl13b إلى توليد طفرات تحاكي "متلازمة جوبيرت" (Cantagrel et al. ، 2008). يُذكر أن الطفرات في جين ELMO1 البشري تساهم في اعتلال الكلية السكري. تُظهر أسماك الزرد الطافرة elmo1 أنماطًا ظاهرية تُرى في أجنة مفرطة السكر في الدم ناتجة عن ضربة قاضية للجين pdx1 مثل الكبيبة الأكبر ، وخلية القدم المعيبة ، والرقبة الأقصر ، والترشيح المفرط ، وبالتالي تسليط الضوء على الوظيفة المحفوظة لهذا الجين (شارما وآخرون ، 2016). تُظهر أسماك الزرد المتحولة magi2a المتلازمة الكلوية المقاومة للستيرويد والتي تُلاحظ أيضًا في الأشخاص الذين يعانون من طفرات في MAGI2 (Jobst-Schwan et al. ، 2019). تسلط هذه الملاحظات الضوء على ملاءمة سمك الزرد ككائن حي لنمذجة أمراض الكلى البشرية.

طريقة أخرى لتوليد طفرات الزرد هي نوكلياز مستجيب يشبه النسخ المنشط (TALEN) استنادًا إلى تحرير الجينوم. في هذه التقنية ، يتكون مجال ربط الحمض النووي TALE من مونومرات ، يتكون كل مونومر من تكرار مترادف لـ 34 من بقايا الأحماض الأمينية التي ترتبط بنيوكليوتيد معين في تسلسل الحمض النووي. يتم اشتقاق تسلسلات TALE هذه من البكتيريا الممرضة Xanthomonas التي تغير نسخ الجينات في الخلايا المضيفة (Boch and Bonas ، 2010). يتكون بناء استهداف TALEN من إشارة توطين نووية ، ومجال ربط الحمض النووي ، ومجال نوكلياز FokI في نهاية الكربوكسيل الخاصة بهم. تعمل TALEN في أزواج مع مواقع الربط الخاصة بها الموجودة على خيوط متقابلة من الحمض النووي مفصولة بتسلسل مباعد من 12 إلى 25 نقطة أساس. ترتبط التركيبات بالموقع المستهدف في النواة وتولد فاصلًا مزدوجًا ، يتم إصلاحه بعد ذلك من خلال انضمام طرف غير متماثل (Liu et al. ، 2014). يمكن لأسماك الزرد الطافرة التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR أو TALEN تنشيط الجينات التي تعوض فقدان الجينات ذات الأهمية ، مما يجعل من الصعب الكشف عن وظيفة الجين (روسي وآخرون ، 2015). ومع ذلك ، من الممكن تحديد هذه الجينات التعويضية عن طريق تحليل النسخ باستخدام أساليب تسلسل الجيل التالي (NGS) ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد وظيفة الجين المعني. يمكن أن يساعد تحديد الجينات والمسارات الجزيئية التي تعوض عن فقدان وظيفة الجين في إيجاد طرق علاج جديدة للطفرات الجينية التي تسبب أمراضًا خطيرة (El-Brolosy and Stainier ، 2017).

إزالة الجينات باستخدام oligos antisense morpholino

المورفولينوس عبارة عن أليغنوكليوتيدات غير أنيونية مستقرة نسبيًا بالمقارنة مع أوليغومرات الحمض النووي الريبي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) (Summerton ، 1999). يرتبط oligonucleotides المورفولينو المضاد للحساسية بـ mRNA للبروتين المستهدف في موقع بدء الترجمة الخاص به ويمنع ترجمته. يمكن لنوع آخر من oligos antisense morpholino أن يستهدف وصلات التضفير ويمنع التضفير pre-mRNA (Summerton ، 1999). يعتبر تأثير القليل من Morpholino-antisense عابرًا ويمكن استخدامه لدراسة الدور التنموي المبكر للجينات المعنية. يتم حقن مادة morpholino-antisense oligo في 1-4 مرحلة الخلية من أجنة الزرد ويمكن رؤية تأثيرها حتى 3-5 أيام بعد الإخصاب (pdf) (بيل وآخرون ، 2009). غالبًا ما تعرض أليغنوكليوتيدات مورفولينو المضادة للحساسية تأثيرات غير مستهدفة (Robu et al. ، 2007). يجب إجراء تجارب التحكم مثل تجربة الإنقاذ عن طريق حقن مورفولينو جنبًا إلى جنب مع الرنا المرسال الذي لا يمكن استهدافه بواسطة هذا oligo المضاد للحساسية للتحقق من خصوصيته (Eisen and Smith ، 2008). تم تطوير مورفولينو الذي يتم تنشيطه ضوئيًا ، والذي يمكن التحكم في نشاطه مكانيًا وزمنيًا عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (Tallafuss et al. ، 2012). تم إجراء العديد من الدراسات باستخدام مورفولينو المضاد لتحليل الجين بوساطة oligo-down لفهم أمراض الكلى البشرية. على سبيل المثال ، أدت الضربة القاضية لجين النيفروسيستين -3 إلى تكوين الأكياس واستسقاء الرأس في أجنة الزرد بطريقة مشابهة لمرض من النوع {18}} (زهو وآخرون ، 2010).

تُعرف المضادات الحيوية للأمينوغليكوزيد المستخدمة عمومًا لعلاج العديد من الالتهابات التي تهدد الحياة بتأثيرها السام على الكلى والأذن (Mingeot-Leclercq and Tulkens ، 1999). الجنتاميسين هو مضاد حيوي شائع الاستخدام ويمكن أن يسبب إصابة الكلى الحادة (AKI) في الزرد. يتسبب الجنتاميسين في تسطيح ظهارة حدود الفرشاة ، وفقدان النسيج الطلائي الأنبوبي ، وتشوه بنية الكبيبات ، وداء الفسفوليبيدات الليزوزومية ، وتراكم الكريات البيض أو حطام الخلية في التجويف الأنبوبي ، الذي يحاكي جرعة زائدة من الجنتاميسين في البشر (Cianciolo Cosentino et al. ، 2010). يمكن أن تتجدد أسماك الزرد وتستبدل النيفرون التالف. يمكن استخدام إهانة الجنتاميسين لدراسة التجدد الكلوي في أسماك الزرد (Kamei et al. ، 2015). تؤدي إصابة الجنتاميسين إلى استجابة التجدد التي تحفز الخلايا الجذعية للكلى على الخضوع لمراحل المواصفات والتكاثر والتمايز لتوليد نيفرونات جديدة. يستغرق تجديد النيفرون حوالي 14 إلى 21 يومًا في الأسماك البالغة (Diep et al.، 2011؛ ​​McCampbell et al.، 2015). Cisplatin ، الذي يستخدم كدواء علاجي كيميائي لعلاج الأورام ، له أيضًا تأثيرات سامة على الكلى ، كما لوحظ في سمك الزرد (Hentschel et al. ، 2005). Etimicin هو أمينوغليكوزيد آخر يمكن استخدامه أثناء محاكاة السمية الكلوية المنخفضة والسمية الأذنية في أجنة الزرد (Shao et al. ، 2020). وبالتالي ، يمكن دراسة تجديد الكلى الكلوي الحاد في أسماك الزرد بمساعدة هذه المضادات الحيوية.

إصابة ميكانيكية بالكلى

يمكن أن يصاب سمكة الزرد بأذى جسديًا باستخدام الاستئصال أو الطعن أو الجرح بالتبريد. يمكن إجراء الإصابة الجراحية باستخدام ملاقط دقيقة لطعن المنطقة المرغوبة من الكبريتات لإنشاء نموذج AKI. تم استخدام هذه التقنية لإتلاف القناة الكلوية القريبة من مجرور ، مما يضعف تدفق السوائل ويؤدي إلى تكوين الكيس في غضون 30 دقيقة (Kramer-Zucker ، 2005). وجد أن الانخفاض في معدل تدفق السوائل في الكبريتات يولد ضغطًا عكسيًا في موقع دخول السائل ، مما يتسبب في تمدد اللمعة النبيبية وتكوين الكيس. قامت مجموعة أخرى من الباحثين بعمل انسداد في الأنابيب الكلوية عند 50 حصانًا أو في الأنابيب الكلوية المتوسطة من سمكة الزرد البالغ عمرها 12- شهرًا باستخدام ملاقط لقرص المنطقة القريبة من أنابيب التجميع البعيدة (Hellman et al. ، 2010). اكتشفوا أن تندب الأنابيب يؤدي إلى زيادة معدل ضربات الأهداب وزيادة تنظيم عامل النسخ foxj1a الذي ينظم التعبير الجيني المولّد للدهون. يشير هذا إلى أن إصابة الأنابيب الكلوية تولد إشارة حسية ميكانيكية قائمة على الأهداب للحفاظ على توازن النيفرون.

إصابة الكلى التي يسببها الليزر

يتم استخدام استئصال الخلايا بالليزر كأداة لدراسة إصابة الكلى وتقليد AKI في الزرد. وصف جونسون وآخرون (2011) طريقة لاستئصال الليزر متبوعًا بتتبع تجديد النيفرون. قاموا بحقن 40 كيلو دالتون ديكستران- FITC في جذع أجنة الزرد عند 48-55 حصان لتسمية الخلايا الظهارية للنبيبات القريبة ، والتي تم استهدافها بعد ذلك للاستئصال بالليزر عند 72 حصانًا. ثم تم إعادة حقن الأجنة المستأصلة مع ديكستران رودامين لتتبع الخلايا الظهارية القريبة. ووجدوا أن أنبوبًا قريبًا متطورًا بالكامل قد تشكل في اليوم السابع بعد الاستئصال بوساطة الليزر (جونسون وآخرون ، 2011). بديل آخر هو استخدام خط معدّل وراثيًا خاصًا بالكلى لتحديد الخلايا للاستئصال بوساطة الليزر ومراقبة سلوك الخلايا المجاورة. تم استخدام ضوء ليزر بنفسجي بطول موجي 405 نانومتر لاستهداف النبيب الكبري لأسماك الزرد Tg (atp1a1a.4: GFP) (Palmyre et al. ، 2014). نظرًا لأن أطياف الإثارة GFP تقع في نطاق الضوء الأزرق إلى البنفسجي ، فقد امتص ضوء الليزر 405 نانومتر ، والذي يعمل كمغسلة للطاقة لإحداث إصابة محتملة في الخلايا الظهارية المستهدفة. أدت هذه التجربة إلى اكتشاف أن هجرة الخلايا هي الاستجابة الأولية للظهارة المصابة. تسببت الهجرة الجماعية للخلايا في تمدد ميكانيكي يوفر محفزات لتكاثر الخلايا لإصلاح النبيب المصاب. لتحديد الوقت الذي تكتسب فيه النبيب الكبري لأسماك الزرد القدرة على التجدد ، استخدم ياكولوف وآخرون (2018) ليزر فوتون 2- لاجتثاث جزء صغير من الأنابيب الكلوية في Tg (cldn2b: lyn-GFP) الأجنة في نقاط زمنية مختلفة وتتبع عملية التجديد. ووجدوا أن استئصال الأنابيب الكلوية 2- من الأجنة بعمر يوم واحد تم إصلاحه سريعًا عن طريق الاستجابات المهاجرة ، في حين أن 1- يوم من الأجنة لم يكن لديها هذه القدرة. لقد أجروا التنميط الجيني للتعبير الجيني لأجنة الزرد المصابة ووجدوا أن cxcr4b والميكا متورطان في عملية الإصلاح هذه (Yakulov et al. ، 2018).

علم الوراثة الكيميائية

يمكن استخدام الجزيئات النشطة بيولوجيًا الصغيرة للتدخل في وظيفة البروتين وفهم دورها البيولوجي. يتوفر عدد كبير من المكتبات الكيميائية تجارياً أو يمكن تصميمها خصيصًا لفحص وظائف البروتين. تشتمل مكتبات الجزيئات الصغيرة هذه على مثبطات كيناز ومثبطات الأنزيم البروتيني والمستقبلات النووية والروابط التي يمكن استخدامها لتحديد دور مسارات الإشارات التي تشارك في تطوير الأعضاء ووظيفتها (Kawasumi و Nghiem ، 2007). في العقود القليلة الماضية ، برز سمك الزرد ككائن حي نموذج فقاري قوي للفحص الكيميائي عالي الإنتاجية وتسجيل النمط الظاهري (كوفمان وآخرون ، 2009). استخدم Cao وآخرون (2009) نهج الغربال الكيميائي لتحديد المركبات التي يمكنها عكس الأنماط الظاهرية التي تسببها الطفرات في pkd2 (الجين السببي لـ PKD) و ift172 (الجين المسؤول عن تكوين الأهداب). لقد اكتشفوا أن مثبط بان هيستون ديستيلاز (pan-HDAC) trichostatin A (TSA) ومثبط HDAC المحدد من الفئة I وحمض الفالبرويك (VPA) يمكن أن يثبط تكوين كيس الكلى في نموذج خروج المغلوب pkd2 (Cao et al. ، 2009 ). وبالتالي ، يمكن أن تكون الوراثة الكيميائية أداة مفيدة لتحديد الأدوية المرشحة الجديدة التي يمكنها إما عكس أو قمع حالات المرض.

نماذج إصابات الكلى المحرضة وراثيا

يمكن استخدام نموذج استئصال الأنسجة المحرض وراثيًا في أسماك الزرد حيث يتم التعبير عن نيتروريدوكتاز البكتيري (NTR) تحت سيطرة مروج مختار يقود التعبير عن NTR في جزء معين من الكبر. يحول NTR الميترونيدازول إلى مستقلب سام للخلايا يمكن أن يسبب الموت للخلايا التي تعبر عن NTR (Curado et al. ، 2008). استخدم Zhou و Hildebrandt (2012) هذه التقنية للحث على إصابة خلايا podocytes عن طريق التعبير عن NTR تحت سيطرة مروج podocin في خط Tg (pod: NTR-mCherry). لقد طوروا أيضًا خطًا مزدوجًا معدلاً وراثيًا من VDBP-GFP (بروتين ربط فيتامين D الموسوم بـ GFP) باعتباره متتبعًا للبروتينية جنبًا إلى جنب مع خط Tg (pod: NTR-mCherry). تسبب العلاج بالميترونيدازول في إصابة خلية البودوسيت مما أدى إلى حدوث وذمة في الجسم بالكامل وتراكم VDBP-GFP في الأنابيب القريبة ، مما يحاكي النمط الظاهري للمتلازمة الكلوية البشرية (Zhou and Hildebrandt ، 2012).

طرق لتقييم تطور وظيفة الكبرونيفروس ووظيفتها في أسماك الزرد

لقد وصفنا طرق إنشاء نماذج لأمراض الكلى البشرية باستخدام الزرد. إن إنشاء نموذج مرض باستخدام كائن حي آخر هو الخطوة الأولى ، والتي تحتاج إلى تقييم لقدرته على إعادة تلخيص الجوانب المختلفة للمرض الذي يظهر عند البشر بأمانة. تقدم أسماك الزرد العديد من المزايا التي يمكن استخدامها لتقييم قدرتها بسرعة لتكون بمثابة بديل لفهم أمراض الكلى البشرية كما هو موضح أدناه.

الفحص القائم على الصرف

غالبًا ما تظهر أجنة أسماك الزرد الطافرة اختلافات شكلية ، مقارنة بالنوع البري الذي يمكن الحكم عليه بسهولة من خلال الملاحظات تحت المجهر. تعد شفافية أجنة الزرد وقدرتها على البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 5 أيام حتى مع وجود عيوب تطورية شديدة ميزة رئيسية في الشاشات القائمة على التشكل. تشمل التغيرات المورفولوجية الشائعة التي لوحظت في أجنة الزرد المصابة بخلل في الكلى وذمة التامور ، والتكيسات الكلوية ، ومحور الجسم المنحني ، واستسقاء الرأس (Poureetezadi and Wingert ، 2016 ؛ Outtandy et al. ، 2019). الوذمة هي إحدى العلامات الشائعة لخلل في الكلى والتي تظهر أيضًا في حالات نقص الأعضاء الأخرى مثل نمو القلب (Hanke et al. ، 2013). المسوخ المصاب بعيوب الكلى قد يصاب بالأكياس بسبب تكاثر الخلايا الظهارية ، كما يمكن ملاحظته بسهولة تحت المجهر (Zhao and Malicki ، 2007 ؛ Yamaguchi et al. ، 2006). غالبًا ما يُرى محور الجسم المنحني في المسوخات التي لديها عيوب أهداب كلوية. تعتبر أسماك الزرد المتحولة مثل Locke (lok) و shen yantf214a (shy) و garbustm304 (grb) و zatortg238a (zar) بعض الأمثلة الأخرى التي تُظهر محور الجسم المنحني (Zhao and Malicki، 2007). تظهر طفرات الزرد المصابة بعيوب في الكلى عيوبًا مورفولوجية متعددة في نفس الجنين. أدت الضربة القاضية لجيني بوليسيستين pkd1a و pkd1b إلى انحناء محور الجسم عن طريق الفم واستسقاء الرأس والغضاريف والعيوب القحفية الوجهية مع التردد المنخفض للكيسات الكلوية (Mangos et al. ، 2010). كان لطفرات بروتينات النقل داخل السجيل ift57 و ift88 و ift172 ، حيث كانت الأهداب معيبة ، محور جسم منحني بطنيًا (Lunt et al. ، 2009). وهكذا ، فإن طفرات الزرد مع الكلى المعيبة تظهر العديد من السمات المورفولوجية التي يمكن التعرف عليها بسهولة.

لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501