ميثيل جاسمونيت يزيل التانين المميز القابل للتحلل ، الفافونويد ، واستجابات فيتو أوكسيليبين في الرمان (بونيكا جراناتوم إل.) يترك الجزء الأول

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:يمكن لميثيل جاسمونيت (MeJA) المنتج في النباتات التوسط في استجابتها للضغوط البيئية. وقد ثبت أيضًا أن التطبيق الخارجي لـ MeJA ينشط مسارات الإشارات ويحث على تراكم فيتواليكسين في العديد من الأنواع النباتية. لفهم كيفية استجابة نباتات الرمان كيميائياً للضغوط البيئية ، تم إجراء تحليل المستقلب في أوراق الرمان التي خضعت لتطبيق MeJA وكشف عن تغييرات فريدة في التانينات القابلة للتحلل المائي والفلافونويد والأوكسيليبينات النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تحليلات النسخ و qPCR في الوقت الحقيقي لأوراق الرمان المعالجة بالمحاكاة و MeJA الجينات الأيضية المعبر عنها تفاضليًا وعوامل النسخ التي يحتمل أن تشارك في التحكم فيقابل للتحلل بالماءمسارات التانين والفلافونويد والفيتو أوكسيليبين. التوصيف الجزيئي والكيميائي الحيوي والمعلوماتية الحيوية فقطليبوكسيجينازمع التعبير المستدام الناجم عن MeJA أظهر أنه قادر على أكسدة الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة ، على الرغم من عدم وجوده في الحيز الخلوي حيث تم إنتاج Phyto-oxylipins غير jasmonate (non-JA). اقترحت هذه النتائج بشكل جماعي أنه في حين أن القمع الواسع للفلافونويد والأنثوسيانين يتم التحكم فيه جزئيًا على الأقل على مستوى النسخ ، فإن التخليق الحيوي المستحث لـ non-JAأكسيليبينات فيتومن المحتمل ألا يتم تنظيمها بشكل نسخي. بشكل عام ، فإن الفهم الأفضل لكيفية استجابة أوراق الرمان للضغوط البيئية لن يؤدي فقط إلى تعزيز صحة النبات وإنتاجيته ، بل سيكون له أيضًا تأثير على صحة الإنسان حيث أن الفاكهة التي تنتجها نباتات الرمان تعد مصدرًا غنيًا للمركبات الغذائية.

الكلمات الدالة:ميثيل جاسمونيت.فلافونويد· أنثوسيانين. · حامض دهني.فيتو أوكسيليبين· ليبوكسجيناز

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

مقدمة

عندما تصاب أو تتعرض للهجوم من قبل الحيوانات العاشبة ومسببات الأمراض ، تنتج النباتات وتطلق ميثيل جاسمونيت (MeJA) ، والذي تدركه أنسجة النبات غير المصابة والنباتات المجاورة لتنشيط الاستجابة الدفاعية (Cheong and Choi 2003). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التطبيق الخارجي لـ MeJA على النبات يؤدي إلى إثارة مسارات الإشارات بالإضافة إلى إنتاج البروتينات ذات الصلة بالإمراض والمواد الكيميائية الدفاعية المعروفة باسم phytoalexins. أظهرت فيتواليكسينات الفينول ، مثل الفلافونويد والأنثوسيانين ، زيادة في التراكم استجابةً لعلاج MeJA في نباتات مختلفة ، مثل Arabidopsis thaliana والعنب (Vitis vinifera) والموز (Musa acuminate) والتفاح (Malus Domestica) والتوت الأحمر (Rubus idaeus) ) (باندي وآخرون 2016 ، بورتو وآخرون 2015 ، دي جيتيريت آل 2012 ، شفيق وآخرون 2011 ، فلو ريس ورويز ديل كاستيلو 2014). يبدأ التخليق الحيوي لمركبات الفلافونويد والأنثوسيانين بتكوين كالكون نارينجينين من الكومارويل CoA وثلاثة جزيئات من مادة مالونيل CoA المحفزة بواسطة سينثيز تشالكون (CHS) والأزمرة اللاحقة لشالكون نارينجينين إلى نارينجينين بواسطة تشالكون أيزوميراز (CHI). ثم يتم استخدام Naringenin لتوليد الهياكل العظمية الأساسية للفلافونويد والأنثوسيانين ، والتي يتم تعديلها بشكل أكبر بمجموعات وظيفية جليكوزيل ، وميثيل ، وهيدروكسيل ، وبرينيل لإحداث هياكل ووظائف متنوعة (Tian et al. 2008).

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>تشابه 75 في المائة) ولا تحتوي على ببتيد إشارة ، في حين أن النوع الثاني LOXs تمتلك تشابه تسلسل منخفض بشكل عام (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

الرمان (Punica granatum L.) هو محصول بستاني متخصص ذو قيمة للمركبات الفينولية الوفيرة في ثماره ، مثل مركبات الفلافونويد والأنثوسيانين والتانينات القابلة للتحلل المائي (HTs) المشتقة من وسيط مسار شيكيمات (أونو وآخرون 2016) ). ركزت العديد من الدراسات حتى الآن على دور الفينول الرمان في تخفيف الضغوط والمرض لدى البشر (Wu and Tian 2017) ، في المقابل ، لا يُعرف الكثير عن وظيفة الفينولات والمواد الكيميائية النباتية الأخرى في الدفاع عن الرمان ضد العوامل اللاأحيائية والحيوية (على سبيل المثال. الجرح ، مسببات الأمراض ، تحريض MeJA) في الأوراق والثمار. قام تقريران حديثان بتقييم معالجة MeJA قبل الحصاد على جودة ما بعد الحصاد لثمار الرمان (Koushesh Saba and Zarei 2019 ؛ Garcia-Pastor وآخرون 2020). تم تحليل الأنثوسيانين الكلي والفلافونويد والفينولات للفواكه المعالجة بـ MeJA ، ولكن ليس الأوراق ، بشكل جماعي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. حللت إحدى الدراسات أيضًا الأنثوسيانين الفردي باستخدام مقياس الطيف الكتلي (Garcia-Pastor et al.2020). ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تستجيب أنسجة نبات الرمان ، سواء كانت أوراقًا أو ثمارًا ، للضغوط البيئية قبل مجموعة الفاكهة.

لبدء تشريح التفاعلات بين نباتات الرمان والعوامل البيئية ، قمنا بفحص الاستجابة الأيضية لأوراق الرمان لتطبيق MeJA الخارجي باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) ومقياس الطيف الكتلي الترادفي بالرش الكهربائي السائل (LC-ESI-MS / MS) . لوحظت تغييرات فريدة في HTs و flavonoids و anthocyanins بالإضافة إلى التغيرات في الدهون والأحماض الدهنية و Phyto-oxylipins في أوراق الرمان المعالجة بـ MeJA. كشف تحليل النسخ المقارن ، الذي تم التحقق من صحته من خلال تحليل qPCR في الوقت الفعلي ، أن الجينات الهيكلية و / أو التنظيمية المشاركة في التمثيل الغذائي HT ، والفلافونويد ، والأنثوسيانين ، و Phyto-oxylipin تم التعبير عنها بشكل تفاضلي في أوراق الرمان التي تمت معالجتها بطريقة وهمية و MeJA. تعرض جين LOX الوحيد الذي أظهر تعبيرًا منظمًا مستدامًا في الأوراق المعالجة بـ MeJA لمزيد من التوصيف الجزيئي والكيميائي الحيوي والتطور الوراثي.

المواد والأساليب

مواد كيميائية

تم شراء معايير -غلوكوجالين وخماسي الجلوكوز الخماسي من Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (شنغهاي ، الصين). تم الحصول على المواد الكيميائية المستخدمة في اختبار LOX من البائعين التاليين: 3- (ديميثيلامينو) حمض البنزويك (DMAB) (Adamas Reagent، Co.، Ltd.، Shanghai، China)، linoleic acid (Sigma-Aldrich، St. Louis ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 3- methyl -2- benzothiazolinone (MBTH) والهيموغلوبين (Sangon Biotech Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين).

المواد النباتية

تم توفير ثمار وبذور الرمان (cv. Wonderful) بسخاء من قبل أكاديمية Panzhihua للعلوم الزراعية والغابات وتم التعرف عليها من قبل الدكتور Binjie Ge في حديقة Shanghai Chenshan النباتية. تم إيداع عينة قسيمة (رقم CSHO173966) في معشبة حديقة شنغهاي شينشان النباتية ، شنغهاي ، الصين. نمت شتلات الرمان في غرفة نمو يمكن التحكم بدرجة حرارتها لمدة 6 أسابيع عند 25 درجة و 16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة. يقال إن تركيز MeJA لتطبيق الرش على الأنسجة النباتية يتراوح من 100 إلى 250 ميكرومتر （Ku وآخرون 2014 ؛ هيكمان وآخرون 2017). تم تطبيق تركيزات مختلفة من MeJA مبدئيًا على أوراق الرمان ، والتي أدى 200 ميكرومتر منها MeJA إلى استجابة استقلابية ملحوظة في التحليل الأولي وتم استخدامها لتحليل المستقلب والتعبير الجيني الموصوف في هذه الدراسة. قبل معالجة MeJA ، تم نقل نصف نباتات الرمان إلى غرفة نمو أخرى مع ظروف مماثلة. بينما تم رش النباتات في غرفة نمو واحدة بـ 200 ميكرومتر MeJA ، تم رش النباتات الموجودة في غرفة النمو الأخرى بالماء (أي التحكم الوهمي). في 2- ساعة ، 3- ساعة ، 6- h و 12- h و 24- h و 30- h و 36- h و 48- h و 72- h بعد العلاج ، تغادر من 3 تم تجميع 5 نباتات معالجة بالمحاكاة أو MeJA ، والتي تشكل تكرارًا بيولوجيًا واحدًا. تم جمع ثلاث مكررات بيولوجية لتجارب العلاج الوهمي و MeJA. تم تقسيم كل مكرر بيولوجي إلى قسامات لتنميط المستقلب وتحليلات التعبير الجيني.

تحليل التنميط المستقلب

تم تجفيف أوراق الرمان بالتجميد ووزنها وطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام خرز زركونيا في مضرب حبة (Mixer Mill MM 400 ، Retsch GmbH ، Haan ، ألمانيا) للتسعينيات عند 30 هرتز. لتحليل HPLC ، تم استخراج عينة الورقة في 70 بالمائة من الميثانول لمدة 60 دقيقة تحت صوتنة وطردها عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تم نقل المادة الطافية إلى قارورة HPLC ، تم حقن 30 ميكرولتر منها على مرحلة عكسية HPLC (Agilent 1200 ، Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحليلها كما هو موضح سابقًا (Wil-son et al. 2019). تم الكشف عن المستقلبات عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر و 280 نانومتر و 320 نانومتر و 360 نانومتر. تم إنشاء منحنيات المعايرة القياسية للجلوكوجالين والخماسي الجلوكوز. تم استخدامها لتحويل مناطق القمم التي تتناسب مع أوقات الاحتفاظ وأطياف امتصاص الجلوكوجالين والبنتاغالويل الجلوكوز إلى التركيزات الخاصة.

لتحليل LC-ESI-MS / MS ، تم استخراج عينة الأوراق المتجانسة (1 0 0 مجم) في 1 مل من 70 بالمائة من الميثانول عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، تم طرد الميثانول بالطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق وتم تمرير superna-tant عبر خرطوشة CNWBOND Carbon-GCB SPE （ANPEL ، شنغهاي ، الصين） و 0. 22- مرشح حقن ميكرومتر (ANPEL) قبل تحليل المستقلب.

تم تحليل المستخلص （2 ميكرولتر باستخدام LC-ESI-MS / MS (Shim-pack UFLC، Shimadzu، Kyoto، Japan؛ QTRAP65 0 0، Applied Biosystems، Foster City، CA، USA) وعمود C1s ذو المرحلة العكسية (ACQUITY UPLC HSS T3،1.8 m، 2.1 mm × 1 0 0 mm، Waters، Milford، MA، USA). تمت التصفية من المستقلبات باستخدام مذيبات (A) ماء يحتوي على 0.04٪ حمض أسيتيك ، و (ب) أسيتونتريل يحتوي على 0.04 بالمائة من حمض الأسيتيك بتدرج 0-11 دقيقة ، 95-5 بالمائة أ ؛ 11-12 دقيقة ، 5 بالمائة أ ؛ 12-12. 1 دقيقة ، 5-95 بالمائة أ ؛ 12. 1-15 دقيقة ، 95 بالمائة أ. تم الحفاظ على معدل التدفق عند 0.4 مل دقيقة -1. تم الحصول على مصيدة الأيونات الخطية (LIT) والمسح الثلاثي الرباعي (QQQ) MS في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة. تم تشغيل مصدر أيون بخاخ توربو عند 500 درجة مئوية بجهد تأين 5500 فولت. تم ضبط غاز الاصطدام (nitro-gen) عند 5 psi. بالنسبة لتحليل MRM ، تم تحسين إمكانات فصل الطاقة (DP) وطاقة الاصطدام (CE) لكل انتقال أيون منتج سلائف.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>تم اعتبار =1 قد تغيرت بشكل ملحوظ.

تحليل النسخ

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أوراق الرمان باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وقياسه باستخدام Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التحقق من سلامة عينات الحمض النووي الريبي من خلال الفصل على هلام الاغاروز (لا يوجد تدهور مرئي) وتحديد نسبة OD20 / 28o (بين 1.8 و 2.2) باستخدام Nanodrop2000. تم إجراء تخصيب mRNA من إجمالي RNA باستخدام خرز مغناطيسي oligo (dT) (Invitrogen). تم إنشاء مكتبات mRNA-Seq باستخدام مجموعة إعداد مكتبة Truseq RNA (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل النسخ على Illumina HiSeq4000 وتم الحصول على 55-60 مليون من 150- قراءات نهاية مزدوجة (PE150) لكل عينة مكتبة.

تمت معالجة بيانات التسلسل الأولي عن طريق إزالة تسلسلات المحول وكذلك القصيرة (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 ، وقيمة P.<>

تحليل qPCR في الوقت الحقيقي

تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي من أوراق الرمان المعالجة بالحمض النووي و MeJA باستخدام RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co. ، Ltd. ، بكين ، الصين). تم إجراء النسخ العكسي (RT) باستخدام إجمالي RNA ومجموعة PrimeScript TM RT Reagent (Takara Bio Inc. ، Kusatsu ، اليابان). تم إجراء PCR الكمي (qPCR) باستخدام مجموعة TB Green TM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) ونظام StepOnePlus Real-Time PCR (Ther-moFisher Scientific). تم إجراء تحليل منحنى الذوبان وأظهر ناتج تضخيم فردي لكل زوج تمهيدي. لتحليل RT-qPCR ، تم فحص ثلاث مكررات بيولوجية ولكل منها ثلاث مكررات تقنية للعينات المعالجة بالمحاكاة و MeJA. تم تحليل التعبير الجيني باستخدام طريقة C المقارنة (△ AC) (Livak and Schmittgen 2001) ، وتم تحديد مستويات الأهمية باستخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل. يتم عرض تسلسل التمهيدي لتحليل qPCR في الوقت الفعلي وكفاءات التضخيم لأزواج التمهيدي في الجدول S1.

التعبير عن البروتينات المأشوبة ومقايسات الإنزيم وتنقيتها

تم تصنيع إطار القراءة المفتوح لـ Pgr 0 25417 (ترميز LOX المفترض) للاستخدام الأمثل للشفرة في E. coli (Genewiz ، Suzhou ، الصين) وتم استنساخه في pET28a. تم تحويل البلازميد المؤتلف إلى E. coli BL21 (DE3) خلايا. بدأت زراعة 5- مل Luria Bertani (LB) مع 5 0 ميكروغرام مل-إيكانامايسين من مستعمرة واحدة وتم حضنها طوال الليل مع الرج عند 37 درجة مئوية. تم استخدام المزرعة بين عشية وضحاها لتلقيح وسط {8}} مل LB مع 50 ميكروغرام من مل-كانامايسين وسمح لها بالنمو حتى OD600 بمقدار 0.5. تمت إضافة Isopropyl - - D-thiogalactoside (IPTG) إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ملي مولار لتحريض التعبير البروتيني. بعد الحضانة مع الاهتزاز عند 16 درجة لمدة 18 ساعة ، تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي. تم تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت للتحلل (50 ملي مولار NaH ، PO ، الرقم الهيدروجيني 7.4300 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار إيميدازول) وتم تجانسها باستخدام معطل الخلية (Constant Systems Ltd ، Northants ، UK). حبات Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) مع المخزن المؤقت للغسيل (50 مللي مولار NaH ، PO ، درجة الحموضة 7.4300 مللي كلوريد الصوديوم ، 25 مللي مولار إيميدازول) ومخزن الشطف (50 مللي مولار NaH ، PO ، درجة الحموضة 7.4300 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، 500 مللي مولار إيميدازول). تم فصل البروتينات المنقاة على هلام SDS-PAGE 10 بالمائة لتصور نقاء البروتين. تم تحديد تركيز البروتينات المنقاة باستخدام مقايسة برادفورد (برادفورد 1976).

لمقايسة LOX ، تم استخدام حمض اللينوليك كركيزة في طريقة قياس الألوان من خطوتين مع تعديلات طفيفة （Anthon and Barrett 2 0 0 8）. تم تحضين خليط التفاعل 500- ميكرولتر ، بما في ذلك 5 0 ملي مولار فوسفات ، ودرجة الحموضة 6 ، و 10 ملي مولار من DMAB ، و 0.5 ملي مولار من حمض اللينوليك ، وكميات مختلفة من البروتينات المؤتلفة المنقى (1.5 مجم مل-) عند 25 درجة لمدة 10 دقائق ، تمت إضافة محلول ثان 500 ميكرولتر يحتوي على 0.2 ملي مولار من البروم ثنائي الفينيل و 0.1 مجم مل من الهيموجلوبين إلى خليط التفاعل ، والذي تم تحضينه لمدة 5 دقائق إضافية. تم إنهاء التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر 1 بالمائة وزن / حجم كبريتات لوريل الصوديوم. تم تحديد امتصاص الضوء عند 598 نانومتر.

التعريب الخلوي وتحليلات النشوء والتطور

حدد البحث عن جينوم الرمان المشروح (Qin et al. 2 0 17) 1l LOXs مفترض كامل الطول (786 aa إلى 970 aa) ، بما في ذلك Pgr025413 ، Pgr020032 ، Pgr025418 ، Pgr025417 ، PgrO18982 ، PgrO189802 (PgrO18982 ، PgrO189802 تسلسل كامل الطول في GenBank XP _031395793) و Pgr009839 و Pgr008562 و Pgr025678 و PgrO13780. تم التنبؤ بالتوطين الخلوي ومواقع الانقسام لببتيدات الإشارة لرمان LOXs باستخدام TargetP 2.0 (//www.cbs.dtu.dk/servi ces / TargetP /) (Almagro Armenteros et al. 2019).

تحليل موقع ربط TF

للتنبؤ بمواقع الربط الخاصة بـ TFs ، تم الحصول على 1000 نقطة أساس من كودون بدء ATG للجينات المستهدفة من GenBank وتم البحث في مقابل Eucalyptus Grandis TFs في PlantRegMap (الإصدار 5) (Tian et al.2020). تم تعيين تعريف الموقع على P أقل من أو يساوي le -4.

تحليل احصائي

يتم وصف التحليل الإحصائي لتقدير المستقلب الكمي ، ونسخة ، وبيانات qPCR في الوقت الحقيقي في الأقسام المعنية.

نتائج

ينظم MeJA إشارات الخلايا ومسارات التمثيل الغذائي في أوراق الرمان

لفهم الاستجابة النصية على مستوى الجينوم للرمان لاستنباط MeJA ، يتم نسخ أوراق الرمان عند 2- ساعة و 6- ساعة و 24- ساعة و 72- ساعة بعد MeJA أو تم تحليل المعاملة الوهمية (مع كل ثلاثة مكررات بيولوجية) (الشكل S1). تم الحصول على ما يقرب من 55 مليون قراءة تسلسل خام (2 × 150 زوجًا بنهاية مقترنة) لكل نسخة ذات محتوى GC حوالي 52 بالمائة وقيم Q30 تتراوح من 91.6 إلى 95 بالمائة (الجدول S2). بالنسبة لجميع النسخ ، تم تعيين أكثر من 96 بالمائة من قراءات التسلسل المنظف إلى جينوم الرمان المرجعي (تشين وآخرون 2017) (الجدول S3). كانت غالبية النسخ المجمعة أقل من 1000 نقطة أساس (34.3 بالمائة) ، 1000 نقطة أساس - 2000 نقطة أساس (32.9 بالمائة) أو 2000 نقطة أساس - 3000 نقطة أساس (18.1 بالمائة) (الجدول S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1 ، المعدل P.<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

تم تحفيز جينات مسار Shikimate و HT ومستقلبات HT في إجازة الرمان المعالجة بـ MeJA كما هو موضح في تحليل إثراء مسار النسخ و KEGG ، أظهرت ثلاثة جينات مسار اصطناعي حيوي شيكات تعبيرًا منظمًا في الأوراق المعالجة بـ MeJA بالنسبة إلى عناصر التحكم الوهمية في {{3 }} h ، بما في ذلك 3- deoxy-D-arabinose-heptulosonate -7- phosphate synthase (DAHPS) و 3- dehydrogenate synthase (DHS) وثنائي الوظيفة 3- dehydratase dehydratase / shikimate dehydrogenase (DHQ / SDH ؛ يُختصر باسم SDH) (الشكلان S1b و la) على وجه الخصوص ، تم تحديد ثلاثة أشكال إسوية من SDHs للرمان وأظهرت تعبيرًا تفاضليًا في تحليل النسخ ، Pgr020271 ، Pgr019030 ، Pgr019029 ،

لتحديد ما إذا كانت التغييرات في كمية نسخ الجين shikimate و HT biosynthetic genes قد تؤثر على مستوى المستقلبات المشتقة من هذه المسارات ، تم استخلاص المستقلبات الفينولية من الأوراق التي تم حصادها في 24- ساعة ، 30- ساعة. 36- h و 48- h و 72- h بعد MeJA أو التطبيق الوهمي وتحليلها بواسطة HPLC (الشكل 2). وتجدر الإشارة إلى أنه تم اختيار هذه النقاط الزمنية لحساب الوقت اللازم لتخليق البروتين وإنتاج المستقلب وتراكمه بعد تغيرات التعبير المرصودة لجينات shikimate و HT التخليق الحيوي في 6- ساعة. تتطابق أوقات الاحتفاظ وأطياف الامتصاص لاثنين من المستقلبات عند 4.57 دقيقة (الذروة 1) و 24.98 دقيقة (الذروة 2) مع تلك الخاصة بمسار HT وسيطة - جلوكوجالين وسبائك بنتا - جلوكوز ، على التوالي (الشكلان لا و 2 أ). أظهر كلا القمتين تغييرات كبيرة في مناطق الذروة المتكاملة في نقاط زمنية متعددة (الشكل 2 ب). على وجه التحديد ، زادت الذروة 1 في الأوراق المعالجة بـ MeJA بالنسبة إلى عناصر التحكم الوهمية عند 30- ساعة و 36- ساعة و 48- ساعة (الشكل 2 ب). ومن المثير للاهتمام ، أن الأوراق التي تمت معالجتها بـ 2 بوصة من MeJA انخفضت في البداية عند 24- ساعة ، ولكنها زادت لاحقًا عند 30- ساعة و 36- ساعة قبل العودة إلى مستوى مشابه لعناصر التحكم الوهمية في 48- ح و 72- ح (الشكل 2 ب).

كان الحد من معظم مركبات الفلافونويد والأنثوسيانين ، بالإضافة إلى زيادة الفلافون الميثلي والفلافونول ، واضحًا في أوراق الرمان المعالجة بـ MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1 ؛ الجدولين S5 و S6). بالنسبة إلى المستقلبات المتراكمة تفاضليًا ، كان هناك إثراء شامل للمستقلبات المشاركة في التمثيل الغذائي الثانوي / المتخصص للنبات (67 من 102) ، وخاصة المركبات الفينولية (63 من 102) (الجدول S6).

بين الفينولات ، كان الانخفاض المتضافر في مجموعة واسعة من مركبات الفلافونويد والأنثوسيانين (42 من 73 مركبًا منخفضًا) واضحًا في الأوراق المعالجة بـ MeJA (الشكل 3 ؛ الجدول S6). ومن المثير للاهتمام ، أنه تمت زيادة ثلاثة مركبات فلافون وفلافون أحادي أو ثنائي ميثيل ، بما في ذلك ثنائي أو ميثيل كيرسيتين ، وكريزوبيريل O-hexosyl-O-hexoside ، وبيع 5- O-hexoside ، في الأوراق المعالجة بـ MeJA (الشكل 3 ، الجدول S6). العديد من المركبات الوسيطة لمسارات الفلافونويد والأنثوسيانين ، بما في ذلك اللوتولين ، الكريزوبيريل ، ثنائي هيدروكيمبفيرول ، ثنائي هيدروكيرسيتين ، ثنائي هيدروكسيتين ، إيبيكاتشين ، دلفيندين ، بيلارجونيدين ، كانت قابلة للاكتشاف لكنها لم تظهر تغييرات كبيرة في أوراق الجدول المعالجة بـ MeJA (الشكل 3). كانت مشتقات Hydroxycin-namoyl و isoflavones و coumarins من بين الفينولات الأخرى التي أظهرت انخفاض التراكم عند تحريض MeJA (الجدول S6). على النقيض من ذلك ، تمت زيادة اثنين من الأحماض الفينولية ، 2 ، 3- حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك وحمض بروتوكاتيكويك (3 ، 4- حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك) ، وكومارين ، 6- ميثيل كومارين ، في الأوراق المعالجة بـ MeJA (الجدول S6).

تمشيا مع الفلافونويد والأنثوسيانين المخفّضين إلى حد كبير في أوراق الرمان المعالجة بـ MeJA ، نصوص إنزيمين رئيسيين للتخليق الحيوي للفلافونويد والأنثوسيانين. CHS (Pgr005566) و CHI (Pgr025966) ، انخفض بشكل ملحوظ في 6- ساعة و 24- ساعة بعد تطبيق MeJA وفقًا لتحليل النسخ (الشكل 4). تم إجراء تحليل qPCR في الوقت الفعلي لفحص تعبير CHS و CHI مع نقاط زمنية إضافية ، بما في ذلك 2- h ، 3- h ، 6- h ، 12- h ، {{ 11}} h و 48- h و 72- h (الشكل 4). تم إسقاط نصوص CHS في الأوراق المعالجة بـ MeJA عند 3- ساعة وظلت أقل بكثير من تلك الموجودة في الصور الوهمية عناصر التحكم حتى 72- س ، مع أكبر انخفاض عند 12- س. في المقابل ، كان التخفيض في تعبير CHI مهمًا فقط في 24- h و 48- h و 72- h post-MeJA (الشكل 4).

تم استخراج هذه المقالة من بلانتا (2021) 254: 89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9