يعمل إسكات MiR-103a-3p على تحسين ترسب أكسالات الكالسيوم في كلية الفئران عن طريق تنشيط محور UMOD/TRPV5

الحفاظ على التوازناستقلاب الكالسيوم (Ca2+).في الكلى أمر بالغ الأهمية فيمنع تشكيل حصوات الكلى. من الناحية الوظيفية، يجب الكشف عن microRNA (miRNA) المشارك في هذه العملية. لقد تسببنا في إصابة الخلايا E NRK-52بواسطةعلاج الأكسالات. تمت دراسة دور الفصيلة الفرعية لقناة الكاتيون المحتملة للمستقبل العابر V 5 (TRPV5) في الخلايا التي يسببها الأكسالات عن طريق ترنسفكأيشن TRPV5 الزائد، qRT-PCR، لطخة غربية، MTT، واكتشاف التصاق البلورات. بعد تحديد تعبير اليورومودولين (UMOD) في الخلايا المصابة، أكدنا التفاعل بين TRPV5 وUMOD عن طريق الهطول المناعي المشترك (CoIP) ومقايسات التحلل الحيوي على سطح الخلية. تم إجراء التحقق من صحة TRPV5 الذي ينظم UMOD في الحيوية والالتصاق البلوري وتركيز Ca 2+ للخلايا التي يسببها الأكسالات. تم استخدام تحليل المعلوماتية الحيوية ومقايسة لوسيفيراز لتحديد UMOD الذي يستهدف ميرنا. تم اكتشاف دور محور miR-103a-3p المنظم UMOD/TRPV5 من خلال تجارب الإنقاذ. قمنا ببناء نموذج فأر بمعالجة جلايكول الإيثيلين (EG) لفحص محور miR-103a-3p/ UMOD/TRPV5 في الجسم الحي عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H&E)، واللطخة الغربية، والكيمياء المناعية. (إهك). تنظيم خلايا NRK -52 E المحمية من TRPV5 من الإصابة الناجمة عن الأكسالات عن طريق تعزيز قابلية الخلية للخلايا ومنع التصاق CaOx. تم استنفاد UMOD في الخلايا التي يسببها الأكسالات وتفاعل بشكل إيجابي مع TRPV5. عكس إسكات UMOD تأثير فرط تعبير TRPV على الخلايا التي يسببها الأكسالات. استهدف miR-103a-3p UMOD وتم التوسط فيه في تنظيم محور UMOD/TRPV5 في الخلايا التي يسببها الأكسالات. تقليل تنظيم miR-103a-3p المخفف من CaOx الناتج عن EGترسب في أنسجة الكلىفي الجسم الحي عن طريق تفعيل محور UMOD/TRPV5. أدى إسكات miR-103a-3p إلى تحسين ترسب CaOx في كلية الفئران عن طريق تنشيط محور UMOD/TRPV5.

تركيبة عشبية لـالترسيب في أنسجة الكلى

1. مقدمة

حصوات المسالك البولية، واحدة من أكثرالأمراض الشائعة في جراحة المسالك البولية، ناتجة عن ترسيب بلورات مفرطة التشبع من البول في الكلى [1]. على الرغم من أنها ليست عدوانية مثل الأورام الخبيثة، إلا أن حصوات المسالك البولية كان لها منذ فترة طويلة تأثير خطير على صحة الإنسان بسبب ارتفاع معدل حدوثها وتكرارها [2]. أكدت الدراسات أن ظهور حصوات المسالك البولية هو متعدد العوامل ويشمل الوراثة، والتمثيل الغذائي، والمناخ البيئي، وعادات نمط الحياة [3، 4]. تمثل حصوات أكسالات الكالسيوم (CaOx) غالبية حالات هذا المرض، ومعظم المرضى الذين يعانون من حصوات تحتوي على الكالسيوم2+- يعانون من مزيج من فرط كالسيوم البول [5]. لقد أثبتت الدراسات الفيزيائية والكيميائية أن تشبع CaOx في البول يرتبط بتركيز Ca2+ وأن زيادة الكالسيوم في البول يهيئ أو يعزز تكوين Ca2+- المحتوي على تحصي الكلية [6]. يمكن أن تؤدي حصوات الكلى إلى ارتفاع ضغط الدم وأمراض الكلى المزمنة ومرض الكلى في المرحلة النهائية. أفادت الدراسات أن التدابير الوقائية، بما في ذلك التدخلات الدوائية المحددة والتوصيات المتعلقة بنمط الحياة والتغييرات الغذائية، يمكن متابعتها بعد تقييم استقلابي شامل [7، 8]. أشارت العديد من الدراسات البشرية إلى أن الأنظمة الغذائية التي تحتوي على كمية أكبر من الخضار والفواكه تلعب دورًا في الوقاية من حصوات الكلى [9-11]. في الوقت الحاضر، ينبغي إجراء دراسة متعمقة حول الآلية الجزيئية لفرط كالسيوم البول الناجم عن استقلاب الكالسيوم غير الطبيعي في تكوين حصوات الكلى.

TRPV5 هو بروتين مهم ينظم نقل الكالسيوم 2+ عبر أغشية الخلايا [12]. في أنسجة الكلى، يوجد TRPV5 بشكل أساسي في النبيبات الملتوية البعيدة (DCT) والنبيبات الجامعة (CNT) المسؤولة عن تنظيم إعادة امتصاص الكالسيوم في البول 2+ والحفاظ على توازن الكالسيوم 2+ في الجسم [13] . تشير الأدلة المتاحة إلى أن تعبير TRPV5 المنظم قد يكون عاملاً ممرضًا حيويًا في تكوين فرط كالسيوم البول و Ca2+- المحتوي على تحصي الكلية [14].

الجدول 1: تسلسلات التمهيدي المستخدمة في qRT-PCR.

اليورومودولين (UMOD)، المعروف أيضًا باسم بروتين تام-هورسفال، هو البروتين السكري الأكثر وفرة في البول [15]، والذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية مع مجموعة متنوعة من الوظائف الفسيولوجية مثل موازنة استقلاب الماء والكهارل وتنظيم المناعة. والوقاية من حصوات الكلى والحماية من التهابات المسالك البولية [16-18]. في الوقت الحاضر، هناك تقارير قليلة حول الآلية الجزيئية المحددة لـ UMOD في تكوين حصوات الكلى.

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) الصغيرة غير المشفرة وحيدة الجديلة ويبلغ طولها حوالي 20-22 نيوكليوتيدات، وهي موجودة على نطاق واسع في الثدييات [19]. يمكن أن تنظم miRNAs الناضجة التعبير ما بعد النسخي للجينات المستهدفة عن طريق الارتباط الكامل أو الجزئي بشكل تكميلي لـ 3′-UTR من mRNA المستهدف، مما يؤدي إلى تدهور أو تثبيط تخليق البروتين الترجمي [20]. نظرًا لأن miRNAs تؤثر بشكل كبير على الأنشطة الفسيولوجية البشرية مثل النمو والتطور، وموت الخلايا المبرمج، والتمثيل الغذائي، فإنها تعتبر تحمل وعدًا كبيرًا للوقاية من الأمراض وعلاجها [21]. في السنوات الأخيرة، أصبح البحث المتعلق بدور miRNAs في ظهور وتطور حصوات الكلى موضوعًا ساخنًا [22، 23].

لذلك، بحثت هذه الدراسة في العلاقة بين UMOD وTRPV5 في الوقاية من تكوين حصوات الكلى وأوضحت دور miR-103a-3p في استهداف UMOD وتنظيمه، مما يساهم في فهم أعمق لـ UMOD. التسبب في حصوات الكلى وتقديم أفكار جديدة للوقاية من المرض وإدارته.

2. المواد والأساليب

2.1. زراعة الخلايا وعلاج الأكسالات.

تم الحصول على خط خلايا كلى الفئران الظهارية NRK {{0}} E (GNR 8) من المركز الصيني لمجموعة ثقافة النوع (CCCTCC) (شنغهاي، الصين). تم تحضير DMEM (12800017، Gibco، الولايات المتحدة الأمريكية) مخلوطًا بالماء المقطر، ومحلول NaHCO3 بنسبة 7.5% (25080094، Gibco، الولايات المتحدة الأمريكية)، و5% مصل بقري جنيني (FBS) (BC-SE-FBS02، قناة Bio، الصين) للاستزراع. الخلايا في الحاضنة (37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون). بعد الزراعة الفرعية، تم تحفيز الخلايا باستخدام الأكسالات المخففة (0.75 مليمول / لتر، 135623، سيجما ألدريش، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 48 ساعة (ح)، كما هو موضح سابقًا [24]. 2.2. ترنسفكأيشن الخلية. لدراسة الآلية الجزيئية، TRPV 5- الإفراط في التعبير عن البلازميد (Bes-mR -001007572، Ber sinBio، قوانغتشو، الصين)، UMOD-overexpressing البلازميد (Bes-mR -001278605، BersinBio، قوانغتشو، الصين) ، الحمض النووي الريبي (RNA) المتداخل الصغير ضد UMOD (siUMOD) (5′-CTCTTT TATCACACTTGATATGA -3 ′، GenePharma، Shanghai، China)، مثبط miR -103 a -3 p (GenePharma، Shanghai، الصين)، وmiR-103a-3p mimic (BersinBio، قوانغتشو، الصين) تعرضوا لعمليات نقل مختلفة في خلايا NRK - 52 E، مع إعداد عناصر التحكم المقابلة. قبل ترنسفكأيشن، تم استزراع خلايا NRK -52 E في لوحة بئر 6- (2 × 106 خلية / بئر). حتى الوصول إلى حوالي 80٪ من التقاء الخلايا، تم نقل البلازميد TRPV 5- الزائد التعبير، أو البلازميد الزائد UMOD، أو siUMOD، أو مثبط miR-103a-3p، أو التقليد إلى NRK-52E الخلايا باستخدام زمن ليبويك 2000 (11668019، Invitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك، تلقت خلايا NRK- 52E المنقولة تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ولطخة غربية لتقييم الجودة ثم تمت معالجتها بالأوكسالات.

2.3. استخراج الحمض النووي الريبي وqRT-PCR.

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) وmRNA من خلايا NRK -52 E باستخدام Cell RNA Kit (19231ES50، Yeasen، الصين) وMolPure® Cell/Tissue miRNA Kit (19331ES50، Yeasen، الصين). بعد ذلك، تم استخدام HiScript II One-Step RT-PCR Kit (P612-01، Vazyme، الصين) للتفاعل مع المستخلص باتباع تعليمات التشغيل. تم ضبط حالة التضخيم على النحو التالي: 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية)، و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم إجراء qRT-PCR في نظام ABI 7500 (النظم البيولوجية التطبيقية، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل تعبيرات mRNA النسبية بواسطة طريقة 2−ΔΔCt [25]، مع استخدام -actin أو U6 للتطبيع. يتم عرض جميع تسلسلات التمهيدي في الجدول 1.

2.4. لطخة غربية.

تم تحليل البروتين الكلي من العينات (خلايا NRK-52E وأنسجة كلى الفئران) باستخدام RIPA Lysis Buffer (R0010، Solarbio، الصين) وتم قياسه بواسطة مجموعة فحص البروتين BCA (BI-WB005، Sbjbio، الصين). تم فصل الكميات المتساوية من البروتين بنسبة 10٪ بالرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (P0690، Beyotime، الصين) ونقلها إلى أغشية PVDF (AR 0136- 02، Boster، China). بعد معالجتها باستخدام حاجز مانع (P0252، Beyotime، الصين)، تم تحضين الأغشية بمضاد TRPV5 (ab137028، 83 كيلو دالتون، 1/10000)، ومضاد UMOD (ab207170، 110 كيلو دالتون، 1/1000)، ومضاد {{ {20}}أجسام مضادة للأكتين (ab8226، 42 كيلو دالتون، 1/1000) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. تم بعد ذلك استخدام الأجسام المضادة الثانوية بما في ذلك IgG المضاد للأرنب (ab97051، 1/2000) وIgG المضاد للفأر (ab205719، 1/2000) لاحتضان الأغشية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تم تشغيل اكتشاف لطخة البروتين النسبية في نظام iBright Imaging System (CL750، Invitrogen، USA) باستخدام ECL Buffer (WBKlS0100، Millipore، USA) للتصور. - الأكتين بمثابة الرقابة الداخلية.

2.5. فحص صلاحية الخلية.

تم إعداد تعليق الخلية كما هو موضح في هذه الدراسة [24]. تم زرع خلايا NRK -52 E في 96- ألواح زراعة البئر بكثافة 5 0 00 خلية / بئر، و1 0 ميكرولتر ميثيل ثيازوليل ثنائي فينيل- تم استخدام محلول بروميد التترازوليوم (MTT) (40201ES72، Yeasen، الصين) لعلاج الخلايا في كل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، تليها معالجة SDS-HCL. لتقييم صلاحية الخلية، تم قياس قيمة الكثافة الضوئية (OD) عند طول موجة قدره 570 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروية (VL0L00D0، Thermo Fisher، الولايات المتحدة الأمريكية).