يعزز MiR -199-3 p تجديد العضلات ويخفف من الشيخوخة العضلية وضمور العضلات

يرجى الاتصال بـ oscar.xiao@wecistanche.com للحصول على مزيد من المعلومات

تشير تجارب البارابيوسيس إلى أن العوامل الجزيئية المتعلقة بالتجديد والشيخوخة تنتشر في الدم. نوضح هنا أن miR -199-3 p ، الذي يدور في الدم باعتباره ميرنا خالٍ من الخلايا ، انخفض بشكل ملحوظ في دم الفئران المسنة مقارنة بالفئران الصغيرة ؛ و miR -199-3 p لديه القدرة لتعزيز التمايز العضلي وتجديد العضلات. أدى استخدام أجهزة محاكاة miR -199 ، التي توفر miR -199-3 p للفئران المسنة ، إلى تضخم الألياف العضلية وتأخير فقدان قوة العضلات. أدى التناول الجهازي لفئران mdx ، وهو نموذج حيواني معروف لضمور العضلات الدوشيني (DMD) ، إلى تحسين قوة عضلات الفئران بشكل ملحوظ. مجتمعة ، قد يكون لـ miR -199-3 p الخالي من الخلايا في الدم تأثير مضاد للشيخوخة مثل التأثير الضخامي في ألياف العضلات المسنة ويمكن أن يكون له إمكانات كعلاج جديد للحمض النووي الريبي لـ DMD وكذلك الأمراض المرتبطة بالعمر. تزودنا النتائج برؤى جديدة حول الجزيئات الدقيقة التي تدور في الدم كجزيئات مرتبطة بالعمر.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

تتراجع الوظائف الحيوية ، مثل قوة العضلات ، وعمل الجهاز العصبي ، ووظيفة الجهاز التنفسي ، والدفاع ضد العدوى ، ومقاومة الأمراض ، مع تقدم العمر. الأمراض والاختلالات المرتبطة بهذا التدهور الوظيفي آخذة في الازدياد وأصبحت مشاكل رئيسية في المجتمعات المسنة. تحدث تغيرات مختلفة ، مثل التغيرات الأيضية وتنظيم الجينات ، في الجسم مع الشيخوخة -3 ؛ ودراسة مثل هذه التغييرات قد تساعد في فهم الشيخوخة وتقديم استراتيجيات للتعامل مع المشاكل التي تواجه المجتمعات المسنة. تم تحديد الجزيئات الحيوية (بما في ذلك الجينات) المتعلقة بالشيخوخة وقد تكون مفيدة في أبحاث الشيخوخة ؛ على سبيل المثال ، يرتبط تعبير -galactosidase و plolnk4a بالشيخوخة الخلوية 4-6 ، ويعرف نموذج الفأر الذي يفتقر إلى جين klotho بنموذج الشيخوخة مع عدد من الأنماط الظاهرية ، والتي تشبه الشيخوخة المبكرة للإنسان.

Parabiosis هو اتحاد بين شخصين يشتركان في نظام وعائي مشترك ، ويمكن أن يتولد تجريبيًا عن طريق الجراحة. أظهرت التجارب التي أجريت على داء البارابوسيس ، حيث تلتصق القوارض الصغيرة وكبيرة السن لتتشارك نظامًا وعائيًا مشتركًا ، أن عملية الشيخوخة في الحيوانات الصغيرة قد تسارعت ، بينما تم تجديد شباب الحيوانات المسنة 9-12. تشير النتائج بقوة إلى وجود عوامل معينة مرتبطة بالتجديد والشيخوخة ، وتدور مع الدم في نظام الأوعية الدموية ؛ ومع ذلك ، فإن هذه العوامل المنتشرة لم يتم فهمها بالكامل بعد.

يمكن للكيستانش مكافحة الشيخوخة

MicroRNAs (miRNAs) عبارة عن 21-23- رنا صغيرة غير مشفرة بطول نوكليوتيد ، تتم معالجتها من نسخ أطول (miRNAs قبلية) عن طريق الهضم ، مع مجمع معالج دقيق في النواة و Dicer في السيتوبلازم ، ودمجها في يعمل مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) 14،15.MiRNA في RISC كوسيط في إسكات الجينات ، حيث يتم تثبيط ترجمة الرنا المرسال (mRNAs) التي لها تكامل جزئي مع miRNA أو تكون mRNAs التي تحمل متواليات تكاملية تقريبًا إلى miRNA هضم ل 4،15.مستخلص سيستانش المضاد للإشعاعوبالتالي ، تلعب الجزيئات الدقيقة أدوارًا مهمة في تنظيم الجينات من خلال الضغط على التعبير الجيني المستهدف. تم العثور على الآلاف من جينات ميرنا في الحيوانات والنباتات [انظر قاعدة بيانات microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. تم فحص ملف تعريف التعبير عن miRNAs ، وتم اكتشاف التعبير المرتبط بالأنسجة والمرحلة التنموية والتعبير المرتبط بالمرض عن miRNAs 6-21. يرتبط تنظيم الجينات الذي يتضمن الجزيئات المجهرية الجزيئية ارتباطًا وثيقًا بالعديد من الوظائف الحيوية وظواهر الحياة ، بما في ذلك الأمراض 14،16 ، 21-24

توجد MiRNAs في الخارج وكذلك داخل الخلايا. على سبيل المثال ، توجد الجزيئات المجهرية في الدم على شكل نيوكليوتيدات خالية من الخلايا وتنتشر في نظام الأوعية الدموية 2627. يتم دمج هذه الجزيئات الخالية من الخلايا (cf-miRNAs) في حويصلات صغيرة تسمى الحويصلات خارج الخلية أو مرتبطة بالبروتينات ، وبالتالي تكتسب الحماية من نوكليازات خارج الخلية. قد يكون وجود بعض cf-miRNAs مهمًا ؛ على سبيل المثال ، تم اكتشاف روابط مهمة بين cf-miRNAs وأمراض معينة ، 26،27 ، 29-31. قد تعكس Cf-miRNAs التغييرات في حالة phy-sical ؛ وبالتالي ، قد تكون هذه الجزيئات الدقيقة مؤشرات حيوية محتملة لمراقبة أنظمة صيانة الحياة ، وكذلك الأمراض.

أجريت الدراسة الحالية لفحص الارتباطات بين cf-miRNAs والشيخوخة ، وتم فحص cf-miRNAs في دم الفئران الصغيرة وكبار السن. كشفت النتائج عن تغييرات في cf-miRNAs بين دم الفأر الصغير وكبار السن. من بين هذه الجزيئات miRNA ، انخفض miR -199-3 p بشكل ملحوظ في الدم المسن مقارنة بدم الشباب. ومن المثير للاهتمام أن miR -19-3 p لديه القدرة على تعزيز تمايز العضلات وتجديدها ، وقد أدى إعطائه للفئران المسنة إلى تمدد ألياف العضلات. عندما تم إدخال miR -199-3 p في الفئران mdx ، وهو نموذج حيواني للحثل العضلي الدوشيني (DMD) ، تحسنت قوة عضلات الفئران بشكل ملحوظ. تقدم الدراسة الحالية رؤى جديدة في الدورة الدموية cf-miRNAs من حيث الشيخوخة ، والقدرة الكامنة ، والتطبيقات الطبية.

نتائج

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>{{0} شهر) الفئران C57BL / 6J ، باستخدام ميكروأري الحمض النووي لتحديد الاختلافات المرتبطة بالعمر. أظهر ملف تعريف cf-miRNAs اختلافات ملحوظة بين الفئران الشابة وكبار السن ، أي تم الكشف عن cf-miRNAs المنحازة نحو دم الفأر الصغير وكبار السن (الجدول 1). من بين هذه الجزيئات المجهرية ، كانت miRNAs عضلية المنشأ (على سبيل المثال ، miR -1 و miR -133) 1833 موجودة في مجموعة miRNA المتوافرة بكثرة في الدم الصغير. بمعنى آخر ، كانت miRNAs العضلية أقل بشكل ملحوظ في الدم المسن (الجدول 1).cistanche هيرباتم تأكيد الاختلاف في miRNAs بين الدم الصغير وكبار السن عن طريق النسخ العكسي الكمي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (qRT-PCR ؛ الشكل لا) ، وتم إعادة إنتاجه باستخدام مصادر الحمض النووي الريبي المستخرجة من الحويصلات الصغيرة ، ما يسمى exosomes ، المعزولة من البلازما ( الشكل التكميلي 1).

من ناحية أخرى ، كشفت تجارب زراعة الخلايا أن مصل الفأر الصغير لديه القدرة على إحداث التمايز العضلي ، وكانت القدرة أقوى من تلك الموجودة في الفئران المسنة (الشكل 1 ب). تم فحص عامل النمو الشبيه بالأنسولين I (IGF-I) ، وهو عامل رئيسي قادر على إحداث التمايز العضلي في الدم. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي فرق كبير بين الدم الشباب وكبار السن (الشكل 1 ج). وبالتالي ، فإن عوامل أخرى غير عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF-I) في الدم الصغير قد تكون متورطة في التمايز العضلي.

miR -199-3 p قادر على إحداث تباين عضلي المنشأ بقوة. لقد بحثنا في آثار miRNAs الوفيرة في الدم الصغير على التمايز العضلي. تم إدخال محاكيات miRNA الاصطناعية في خلايا C2C12 ، وخط خلية الخلايا العضلية العضلية للماوس ، وتم فحص التعبير عن علامات التمايز العضلي ، وجينات الميوجينين (Myog) وسلسلة الميوسين الثقيلة 1 (Myh1). كانت النتائج غير متوقعة وجذبت اهتمامنا: miR -199-3 p ، الذي تم توقعه باعتباره ميرنا سلبيًا بسبب قلة المعلومات حول التمايز العضلي ، تسبب بشكل ملحوظ في التعبير عن Myog و Myh1 (الشكل 2 أ ، ب). بالإضافة إلى ذلك ، كان تحريض miR -199-3 p أقوى من تحريض miRNAs العضلي المنشأ التقليدي: كان التعبير عن السلسلة الثقيلة للميوسين في وجود miR -199-3 p ملحوظًا بشكل خاص (الشكل 2 ب ، ج).

لتوضيح العلاقة بين miR -199-3 p والتمايز العضلي ، درسنا الخلوي وخارج الخلية (exoso-mal) miR -199-3 p أثناء التمايز العضلي ، وكذلك تأثيرات مثبطات miR -199-3 p على التفاضل. تم تنظيم التعبير الداخلي (الخلوي) miR -199-3 p بعد بدء التمايز. تمت زيادة exosomal miR -19-3 p مرة واحدة وانخفض بعد ذلك (الشكل التكميلي 2 أ). قمع العلاج المثبط التعبير عن علامات التمايز العضلي ، Myog ، Myh1 ، والكرياتين كيناز (Ckm) (الشكل التكميلي 2 ب).cistanche نمو القضيبوبالتالي ، تشير النتائج إلى أن miR -199-3 p يشارك في التمايز العضلي.

تصميم محاكيات miR -199. لقد صممنا محاكيات miR -199 بحيث يمكن للمحاكاة إنتاج miR -199-3 p بكفاءة كوسيط وظيفي (خيط إرشادي) في إسكات الجينات. تم فحص محاكيات miRNA المصممة وتم اختيار miR199 # 4 كمحاكاة miR مختصة -199 (الشكل التكميلي 3). بعد ذلك ، تم استخدام miR199 # 4 في كل من التجارب في الجسم الحي وفي المختبر.

الجينات المستهدفة لـ miR -199-3 p في التمايز العضلي المنشأ. لتحديد الجينات المستهدفة لـ miR -199-3 p تحت إشراف الاختلاف العضلي ، بحثنا عن الجينات المرشحة من قاعدة بيانات TargetScan وركزنا على جينات Lin28b و Suz12 ، وكلاهما معبر عنه في الخلايا العضلية C2C12. يمتلك كل من Lin28b و Suz12 متواليات ربط miR مفترضة -199-3 p في منطقتهم غير المترجمة 3 (UTR ؛ الشكل 3 أ). لقد أوضحنا أن التسلسلات المفترضة هي مواقع ربط أصلية لـ miR -19-3 p ، باستخدام جينات مراسل Luciferase التي تحمل تسلسلات الربط والتسلسلات غير المتطابقة المقابلة (الشكل 3 أ ، ب). تم قمع جينات Luciferase التي تحمل تسلسلات الربط المفترضة بشكل كبير بواسطة miR -199-3 p [pLin28b- (81) و pLin 28- (983) و pSuz 12- (973)] ، بينما المتواليات غير المتطابقة ، والتي تمتلك طفرات استبدال أساسية في البذرة [pLin28b- (81) mut، region ، ألغت تأثير القمع [pSuz 12- (973) mut]. pLin 28- (983) mut ، وعندما تم إدخال تقليد miR -199 لخلايا C2Cl2 ، تم قمع تعبير Lin28b و Suz12 باستمرار (الشكل 3 ج). لتقييم ما إذا كان قمع Lin28b و / أو Suz12 يساهم بشكل مباشر في التمايز العضلي ، تم إجراء تثبيط محدد لـ Lin28b و Suz12 عن طريق إسكات الجينات ، باستخدام RNA inter-ference (RNAi ؛ الشكل 3d ، هـ). كما هو متوقع ، تم تنظيم التعبير عن علامات التمايز العضلي الجيني ، مثل Ckm و Myh1 و Myog وفقًا لإسكات الجينات Lin28b و Suz12 (الشكل 3f ، g).

نظرًا لأن Lin28b عبارة عن بروتين مرتبط بـ RNA يشارك في معالجة miRNAs3637 ، فقد بحثنا في تأثيرات تقليد miR -19 عبر Lin28b على معالجة miRNA العضلي المنشأ. تم فحص مستوى miR -1 ، وهو ميرنا رئيسي عضلي المنشأ ، لأن معالجة سلائفه يتم تنظيمها بواسطة Lin28b. تمت زيادة miR الناضج -1 بشكل كبير بواسطة معالجة محاكاة mi -199 (الشكل 3 ح) ، مما يشير إلى أن miR -199-3 p يمكن أن ينظم العرض الوظيفي لـ miR -1 من خلال الكبت من هدفها Lin28b. مجتمعة ، تشير النتائج إلى أن miR -199-3 p متورط في التمايز العضلي من خلال قمع الجينات المستهدفة ، Lin28b و Suz12.

تعزيز تجديد العضلات بواسطة miR199 # 4 في الفئران المصابة بالعضلات.فوائد الصلصا cistancheدرسنا تأثيرات محاكاة miR -199 (miR199 # 4) في الجسم الحي باستخدام نماذج إصابة العضلات (الشكل 4 أ ، ب). تم حقن الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع مع BaClz إلى الظنبوب الأمامي (TA) للحث على إصابة العضلات ، وتم إعطاء miR19 # 4 إلى المواقع المتضررة بعد 24 ساعة. بعد يومين من إدارة miR199 # 4 ، تم فحص التعبير عن جينات العلامة العضلية. تم زيادة تعبير Myog بشكل كبير وتم أيضًا تنظيم التمايز العضلي 1 (Myod1) والعامل العضلي 5 (Myf5) عن طريق إدارة miR199 # 4 (الشكل 4 ج). تتوافق البيانات مع النتائج المختبرية الموضحة أعلاه (الشكل 2).

تم إجراء التحليل المناعي للعضلات المجددة بعد 9 أيام من إعطاء miR199 # 4. تم فحص مناطق المقطع العرضي لتجديد ألياف العضلات (myofibers) ، والتي تتميز بنوى مركزية (الشكل 4 ب). كان متوسط ​​مساحة المقطع العرضي لتجديد الألياف العضلية المعالجة بـ miR199 # 4 أكبر من تلك الخاصة بالألياف العضلية الضابطة التي تمت معالجتها باستخدام عنصر تحكم RNA مزدوج غير صامت (nsCont ؛ الشكل 4 د) ، مع اقتراب الاختلاف من الأهمية الإحصائية. بالإضافة إلى متوسط ​​مساحة المقطع العرضي ، أظهر الرسم البياني المقسم بالحجم لمنطقة المقطع العرضي زيادة في الألياف العضلية الموسعة في وجود miR199 # 4 (الشكل 4 هـ).

التأثير الضخامي لـ miR199 # 4 على ألياف العضلات المسنة. قمنا بفحص تأثيرات miR199 # 4 على الفئران المسنة (حوالي 24 شهرًا). أظهرت الفئران المسنة انخفاضًا ملحوظًا في miR العضلي -199-3 ص (الشكل 5 أ) ، كما هو الحال في الدورة الدموية cf-miR -19-3 p ، مقارنة بالفئران الصغيرة. قمنا بإدارة miR199 # 4 لعضلات TA للفئران المسنة ، وبعد يومين تم فحص عضلات TA عن طريق التحليل الكيميائي المناعي (الشكل 5 ب). كان متوسط ​​مساحة المقطع العرضي للألياف العضلية المعالجة بـ miR199 # 4 أكبر بكثير من منطقة الألياف العضلية الضابطة المعالجة بـ nsCont (الشكل 5 ج). تمشيا مع هذا ، كشف تحليل الرسم البياني المقسم بالحجم عن زيادة ملحوظة في الألياف العضلية المتضخمة في وجود miR199 # 4 (الشكل 5 د).

نظرًا لانخفاض الدورة الدموية cf-miR -199-3 p في الفئران المسنة ، أدخلنا miR199 # 4 في الدم المنتشر للفئران المسنة عن طريق عبث الذيل. بعد إعطاء miR19 # 4 في الوريد ، تم فحص وتحليل منطقة المقطع العرضي للألياف العضلية ، كما هو موضح أعلاه. تتوافق النتائج ، كما هو موضح في الشكل 5 هـ ، مع نتائج الإدارة المحلية لـ miR199 # 4 للعضلات المسنة (الشكل 5 ج ، د).

وتجدر الإشارة إلى أن هناك اختلافًا في تضخم ألياف العضلات بين نموذج إصابة العضلات والفئران المسنة. تُرى النوى المركزية في تجديد ألياف العضلات (الشكل 4 ب) ، ولكن لم يتم اكتشاف مثل هذه الألياف العضلية في الفئران المسنة التي عولجت بـ miR199 # 4 (الشكل 5 ب). يشير هذا إلى أن ألياف العضلات الموجودة مسبقًا قد تتضخم في الفئران المسنة بعد العلاج miR199 # 4. افترضنا أن آلية أخرى مختلفة عن تجديد العضلات قد تكون متورطة في تضخم الألياف العضلية في الفئران المسنة ، واقترحنا إشراك مسار ضمور العضلات.cistanche tubulosa جرعة redditترتبط جينات Atroginl و MuRFI ارتباطًا وثيقًا بضمور العضلات ، ومستويات تعبيرها مرتفعة بشكل ملحوظ في العضلات المسنة مقارنة بالعضلات الشابة (الشكل 6 أ). قمنا بفحص مستوى Atroginl و MuRFI في عضلات الفئران المسنة بعد الإعطاء النظامي لـ miR199 # 4. تم تقليل Atroginl و MuRFI بشكل ملحوظ في عضلات مختلفة عن طريق إدارة miR19 # 4 (الشكل 6 ب) ، مما يشير إلى أن قمع مسار ضمور العضلات بواسطة miR199 # 4 قد يتسبب في توسع ليف عضلي في الفئران المسنة.

يؤخر MiR199 # 4 فقدان قوة العضلات لدى الفئران المسنة. إن تأثير miR199 # 4 على وظيفة العضلات في الفئران المسنة أمر مهم. تم إجراء اختبار قوة القبضة على الفئران المسنة قبل وبعد الإعطاء النظامي لـ miR199 # 4. تم إجراء التجربة بطريقة مزدوجة التعمية ؛ تم إجراء حقن الحمض النووي الريبي واختبار القبضة بنسبة 100 في المائة بواسطة مجربين مختلفين دون مشاركة المعلومات. تم اختبار قبض الفئران C57BL / 6 (80- أسبوع) من الذكور ، ثم بعد أسبوع واحد ، تم حقنها داخل الفم باستخدام miR199 # 4 و nsCont ، وتم اختبار القبضة مرة أخرى. التغيير في قوة العضلات بعد حقن miR199 # 4 كان MiR199 # 4 يحسن قوة عضلات فئران mdx. نظرًا لأن miR199 # 4 له تأثير إيجابي على العضلات ، فقد أجرينا تجربة لتقييم تأثير إدارة miR199 # 4 في الفئران mdx ، وهو نموذج حيواني معروف DMD. تم حقن فئران mdx عمرها ثمانية أسابيع عن طريق الوريد باستخدام miR199 # 4 (1.6 مجم / كجم) مرتين (فترة أسبوع واحد) ، وتم إجراء اختبار القبضة بعد أسبوع واحد من الإدارة الأخيرة. تم إجراء التجربة بطريقة مزدوجة التعمية كما هو موضح في الشكل 7. تظهر النتائج (الشكل 8 أ) تحسنًا كبيرًا في قوة العضلات في الفئران mdx المعالجة بـ miR199 # 4 مقارنة بفئران mdx المعالجة بـ nsCont. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في نشاط الكرياتين كيناز (CK) و miR الخالي من الخلايا -1 في دم فئران mdx التي عولجت بـ miR199 # 4 (الشكل 8 ب ، ج) ، وهي علامات محتملة للمرض تحسين.

بصفته كاشفًا لتوصيل الدواء ، يكون atelocollagen لزجًا ويصعب التعامل معه ، ويبدو أن الفئران التي عولجت بـ Atelocollagen تعاني من آثار سلبية بسبب السيارة. وبالتالي ، بحثنا عن بدائل لـ atelocollagen لتحسين نظام توصيل الأدوية لدينا (DDS) ووجدنا الجسيمات الشحمية الموجبة DC-CHOL / DOPE ككاشف DDS جديد يساوي أو متفوقًا على atelocollagen (الشكل التكميلي 4). أظهر توزيع الدواء من miR199 # 4 مع الجسيمات الشحمية الموجبة أن miR19 # 4 المُدار تم توصيله إلى العضلات وتم تناوله باستمرار بكميات كبيرة في الكبد (الشكل التكميلي 5). قد يعمل miR199 # 4 خارج الخلية الذي يتم توصيله إلى العضلات كوسيط في إسكات الجينات ويساهم في تنظيم الجينات الذي ينطوي على تحسين قوة العضلات.

حاولنا تحديد الجزيئات الحيوية المتعلقة بالتحسين بعد إدارة miR199 # 4. تم فحص العديد من الببتيدات المتعددة المرتبطة بـ DMD بواسطة النشاف الغربي ؛ ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن إشارات مميزة تتعلق بالتحسن في هذه الدراسة (الشكل التكميلي 6). سنناقش هذه النقطة بمزيد من التفصيل في القسم التالي.

مناقشة

تتغير الجزيئات الحيوية نوعًا وكميًا مع تقدم العمر --3. إن التعرف على مثل هذه التغييرات ودراستها أمر حيوي لفهم الشيخوخة ، وقد يكشف عن استراتيجيات للتعامل مع المشاكل في المجتمعات المتقدمة بالشيخوخة. إن دراسات البارابيوسيس التي اجتمعت فيها الحيوانات الصغيرة والكبيرة في السن لتتشارك في نظام وعائي مشترك ، قدمت رؤى مهمة حول الشيخوخة وتجديد الشباب 9- 2. تشير النتائج بقوة إلى أن هناك عوامل تجديد وعوامل تقدم في السن في الدورة الدموية للشباب وكبار السن ، على التوالي. أفادت دراسات سابقة عن جزيئات مختلفة كمرشحة تتعلق بالتجديد والشيخوخة ، لكن النتائج مثيرة للجدل 3.

تجارب زراعة الخلايا في المختبر التي تستخدم الأمصال الصغيرة والكبيرة في السن مشابهة لتجارب التعايش (الشكل رطل) ، ووجدنا miR -199-3 p ، الذي يتغير مع تقدم العمر ، في الدورة الدموية ؛ تم التعرف على أن الحمض النووي الريبي (miRNA) ينخفض ​​بشكل ملحوظ في الدم المسن (الجدول 1 والشكل la). بالإضافة إلى ذلك ، ينخفض ​​التعبير العضلي (الخلوي) miR -199-3 p بشكل ملحوظ في العضلات المتقدمة في السن بالإضافة إلى العضلات الشابة (الشكل 1). 5 أ) ؛ وهكذا ، قد يرتبط cf-miR -199-3 p في الدم مع العضلة miR -199-3 p. لوحظ أيضًا انخفاض في التعبير عن miR -199-3 p مع تقدم العمر في الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع عظم المكاك الريسوسي. لذلك ، قد يكون التعبير عن miR -19-3 p تحت التحكم المرتبط بالعمر. على عكس miR -19-3 p ، فإن تعبير miRNAs الخلوي العضلي المنشأ ، مثل miR -1 و miR -133 ، يظل دون تغيير في العضلات الشابة وكبار السن (الشكل 5 أ) ، ولكن المستوى من الجزيئات المجهرية خارج الخلية في الدم تنخفض بشكل ملحوظ في الفئران المسنة (الشكل لا). قد يعكس الاختلاف بين miR -199-3 p و miRNAs عضلي المنشأ (miR -1 و -133) الاختلاف في معالجة cf-miRNA و / أو في التحكم المرتبط بالعمر في cf-miRNAs بينهما . لتوضيح هذا الاختلاف ، يجب إجراء مزيد من الدراسات في المستقبل.

اقترحت الدراسات السابقة أن miR -199-3 p تشارك في وظائف خلوية مختلفة وظواهر حيوية عن طريق قمع الجينات المستهدفة ؛ على سبيل المثال ، قد تعزز miRNA تكاثر خلايا الطرف البطاني وترحيلها وتعديل بداية سن البلوغ ، على التوالي ، من خلال تقليل تنظيم السيمافورين المستهدف -3 الجين 40 ومن خلال قمع الجينات المستهدفة (Cdc42 و Map3k2 و Map3k4 و Taok1) تشارك في مسار p38MAPK. وجدت الدراسة الحالية أن miR -19-3 p متورط في التمايز العضلي من خلال قمع الجينات المستهدفة ، Lin28b و Suz12 (الشكل 3). Lin28b هو بروتين مرتبط بالـ RNA ويمنع نضوج miRNAs ، بما في ذلك miR -1 ، وهو عبارة عن miRNA خاص بالعضلات وتكوين عضلي pro-motes. يؤدي إخماد Lin28b بواسطة miR -19-3 p إلى زيادة miR الناضج -1 (الشكل 3) ، مما قد يسمح بمواصلة التمايز العضلي المنشأ.

Suzl2 هي وحدة فرعية أساسية من المركب القمعي متعدد الخلايا 2 (PRC2) ، والذي يشارك في قمع الكروماتين. يشارك التنظيم الجيني لـ PRC2 في صيانة الخلايا الجذعية ، وتطور الجنين ، وتكاثر الخلايا والتمايز ، بما في ذلك التمايز العضلي .42 يوجد PRC2 في مواضع صامتة خاصة بالعضلات ، مثل Myog وعضلات الكرياتين كيناز (MCK) في الخلايا العضلية غير المتمايزة ، ولكنها منفصلة من هذه المواقع في myotubes متباينة. يؤدي إسكات الجينات ضد Suz12 بواسطة RNAi إلى تعزيز التعبير الجيني العضلي (الشكل 3). يؤدي قمع محسن بروتين zeste homolog 2 (Ezh2) ، وهو وحدة فرعية أساسية أخرى لـ PRC2 ، أيضًا إلى التمايز العضلي. تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط تكوين PRC2 بسبب قمع وحداته الفرعية الأساسية قد يؤدي إلى إنشاء حالة جينومية لتمايز العضلات. وبالتالي ، فإن قمع Suz12 بواسطة miR -199-3 p قد يؤدي إلى تمايز عضلي المنشأ. مجتمعة ، قد تلعب miR -19-3 p دورًا مهمًا في التمايز العضلي من خلال تثبيط مسارين مستقلين يشتملان على Lin28b و Suzl2 ، ويشارك كل منهما في الحفاظ على الحالة غير المتمايزة للخلايا العضلية.

تم عرض تأثير miR -199-3 p على التمايز العضلي أيضًا في الجسم الحي (الشكل 4). يؤدي تلف العضلات إلى تنشيط الخلية وتمايزها بسبب تجديد العضلات. أدى إدخال miR199 # 4 ، الذي يوفر miR -199-3 p ، إلى المواقع التالفة ، إلى تعزيز تجديد العضلات وتوسيع الأنسجة العضلية المتجددة (الشكل 4). تم تنظيم التعبير الجيني Myogenic باستمرار تحت علاج miR199 # 4 (الشكل 4). من وجهة نظر عملية ، قد يكون miR199 # 4 فعالًا ومفيدًا للعلاجات الجراحية.

عندما تم إعطاء miR199 # 4 للفئران المسنة التي تفتقر إلى دوران الدم miR -199-3 p ، أظهرت الفئران أليافًا عضلية موسعة بشكل ملحوظ (الشكل 5) وتأخرت في فقدان قوة العضلات مع تقدم العمر (الشكل 7). تختلف الألياف العضلية الموسعة في الفئران المسنة عن تجديد الألياف العضلية ، والتي تتضخم في وجود miR199 # 4 ؛ الأول مشتق من ألياف عضلية موجودة مسبقًا ، والأخير من ألياف عضلية جديدة (ألياف عضلية حديثي الولادة). وبالتالي ، هناك آليات مختلفة ومستقلة في تضخم الألياف العضلية. تشير دراستنا إلى أنه (1) في الحالة السابقة ، يؤدي تثبيط ضمور العضلات بسبب قمع Atroginl و MuRFI بواسطة علاج miR199 # 4 إلى تضخم الألياف العضلية القديمة ، و (2) في الحالة الأخيرة ، قمع الجينات المستهدفة ، Lin28b و Suz12 ، يؤدي إلى تضخم تجديد الأنسجة العضلية. إجمالاً ، قد تشارك جينات مختلفة (متعددة) تنظمها miR -19-3 p في تضخم العضلات في مواقف مختلفة. تشير النتائج أيضًا إلى أن miR -199-3 p قد يكون له على الأقل تأثير مضاد للشيخوخة على العضلات ، وأن miR199 # 4 الذي يوفر miR -199-3 p قد يكون له إمكانات كدواء جديد للحمض النووي الريبي لأمراض العضلات المرتبطة بالعمر ، مثل ساركوبينيا.

استنادًا إلى الفعالية العالية لـ miR199 # 4 على العضلات ، قمنا بإعطاء miR199 # 4 لفئران mdx ، وهو نموذج DMD مشهور ، وحصلنا على نتائج ملحوظة: الإدارة النظامية لـ miR199 # 4 أدت إلى تحسين قوة العضلات في الفئران بنسبة حوالي 20 بالمائة ( الشكل 8 أ). لفهم آلية استعادة قوة العضلات ، حاولنا تحديد الجزيئات الحيوية التي تم تحسينها (أو تأثرها) بواسطة miR -199-3 ص. ومع ذلك ، باستثناء التحسينات في الدم CK و cf-miR -1 (الشكل 8 ب ، ج) ، لم نتمكن من اكتشاف مثل هذه التحسينات على المستوى الجزيئي. قد تكون هذه الصعوبة في الاكتشاف ناتجة عن مجموعة الخلايا المعقدة ، والتي تتكون من مزيج من الخلايا العضلية المجددة وتمزيقها في فئران mdx. حتى لو أدى miR199 # 4 إلى التحسن ، فإن الضوضاء المرتفعة في الخلفية الناتجة عن مجموعة الخلايا المعقدة ستخفي دليلاً على التحسن. لحل هذه المشكلة ، يجب إجراء دراسات أكثر شمولاً باستخدام مجموعة خلايا عضلية متجانسة مشتقة من فئران mdx أو التركيز على أنسجة مختلفة ، بما في ذلك العضلات.

على الرغم من أن الآلية الجزيئية لاستعادة قوة العضلات بواسطة miR199 # 4 لا تزال غير معروفة ، فإن جرعة miR19 # 4 لتحسين قوة العضلات جديرة بالملاحظة. تحسن الإدارة مرتين من ~ 1.6 مجم / كجم miR199 # 4 قوة العضلات في الفئران mdx. يبدو أن الجرعة الفعالة أقل من تلك الموجودة في أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى لتخطي exon ضد جينات dystrophin الطافرة في الجسم الحي 45-47. قد يرجع السبب في قدرة miR199 # 4 على تحسين قوة العضلات في مثل هذه الجرعات المنخفضة إلى آلية عملها المختلفة مقارنةً بالقليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية. آلية عمل miR19 # 4 هي إسكات الجينات cata-lytic. على النقيض من ذلك ، فإن آلية مضادات الغونوكليوتيدات أولي المعنى تعتمد على التهجين الفيزيائي. لذلك ، قد تُعزى الاختلافات في الجرعات المناسبة لإظهار فعالية الدواء إلى آليات العمل المختلفة.

إن الآلية التي تقوم بها الأعضاء أو الأنسجة أو الخلايا بإطلاق الجزيئات المجهرية في الدم لم يتم فهمها بالكامل بعد ، كما أن التنظيم المرتبط بالعمر بشأن إطلاق هذه الجزيئات غير واضح. أظهرت الدراسة الحالية أن cf-miR-NAs العضلية المنشأ ، بما في ذلك cf-miR -199-3 p تنتشر مع الدم في نظام الأوعية الدموية وتقل مع تقدم العمر. قد توجد مثل هذه الجزيئات cf-miRNA في exosomes ، أي أنها جزيئات miRNA خارجية.

تشارك miRNAs عضلي المنشأ في التمايز العضلي ، وتجديد العضلات ، والحفاظ على التوازن العضلي. أفادت الدراسات السابقة أن miRNAs العضلي المنشأ ، مثل miR -1 و miR -133 ، لوحظ زيادة في الدم استجابة للتمرين البدني. بناءً على هذه التقارير ، قد تُطلق الفئران الصغيرة النشيطة المزيد من الجزيئات الجزيئية في الدم أكثر من الفئران بطيئة الحركة المسنة ، وقد تساهم هذه الجزيئات الجزيئية خارج الخلية ، بما في ذلك cf-miR -199-3 p في الحفاظ على التوازن العضلي في الفئران الصغيرة من خلال الإجراء التلقائي. . ومع ذلك ، لا يرتبط مستوى miRNA خارج الخلية (exosomal) دائمًا بمستوى miRNA الخلوي ، وقد لوحظت اختلافات في miRNAs العضلي المنشأ و miR -199-3 p بين الفئران الشابة وكبار السن (الشكلان la و 5 أ) وأثناء التمايز العضلي (الشكل التكميلي 2 أ). وبالتالي ، كاحتمال آخر ، من المعقول أن التنظيم المرتبط بالعمر والمتعلق بالتمايز لتشكيل الجسيمات الخارجية قد يؤثر على إنتاج cf-miRNA ؛ على وجه التحديد ، قد تكون هناك اختلافات في تكوين الجسيمات الخارجية بين الفئران الصغيرة وكبار السن. في سياق هذه الفرضيات ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لتوضيح الإطلاق المرتبط بالعمر للـ miRNAs العضلي المنشأ في الدم.

بصرف النظر عن آلية الإطلاق ، عندما تتدفق cf-miRNAs الشابة العضلية المنشأ التي تحتوي على cf-miR -199-3 p إلى نظام الدورة الدموية القديم من نظام الأوعية الدموية الشاب عن طريق التعايش ، يمكن أن تحفز cf-miRNAs تنشيط العضلات وتثبيط العضلات ضمور على جانب الشيخوخة. هذا المفهوم مدعوم بأدلة من فئران مسنة تم حقنها عن طريق الوريد بـ miR19 # 4 في هذه الدراسة (الأشكال. 5-7). قد تكون Cf-miRNAs في الدم مرتبطة بوظيفة التماثل الساكن المرتبطة بالعمر ويمكن أن تمثل توازنًا متغيرًا. عندما تكون cf-miRNAs موجودة خارج الرحم ، على سبيل المثال ، عندما يتم نقل cf-miRNAs في الدم الصغير إلى نظام الدورة الدموية المسن ، قد تظهر بعض cf-miRNAs آثارًا متجددة على الجانب المتقدم في السن ، أي أنها قد تنتج آثارًا مضادة للشيخوخة. في المقابل ، قد تمثل cf-miRNAs في الدم المسن تغيرًا في التوازن مع تقدم العمر. عندما يتم نقل هذه الجزيئات cf-miRNAs إلى نظام الدورة الدموية الشاب ، فإن بعض cf-miRNAs قد تؤدي إلى تدهور مرتبط بالشيخوخة وقد تتسبب في شيخوخة مبكرة على الجانب الشاب. تمثل Cf-miRNAs التي تزداد بشكل كبير في الدم المتقدم في العمر مرشحين سيتطلبون تحليلًا ميكانيكيًا مفصلاً لفهم ومنع الشيخوخة.

في الختام ، قدمت دراستنا الحالية رؤى جديدة حول cf-miRNAs كجزيئات مرتبطة بالعمر ، وكشفت عن اتجاه بحثي جديد لتوضيح العلاقة بين الشيخوخة والـ RNAs الوظيفية الخالية من الخلايا ، بما في ذلك cf-miRNAs.

تم استخراج هذه المقالة من COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4: 427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio