هيدروجيل النانو لتوليد جذري ألكيل معزز وعلاج قوي مضاد للأورام †

جذور ألكيل (R.c) ، والتي لا تعتمد على توليد الأكسجين للتسببالإجهاد الخلوي، تم تطبيقها فيعلاج الورم، ولكن كمية كبيرة من الجلوتاثيون (GSH) في الخلايا السرطانية تتفاعل مع جذور الألكيل ، وبالتاليتقليل تأثيرها المضاد للورم. في هذه الدراسة ، يستجيب نظام توليد جذري ألكيل محسن لـضوء الأشعة تحت الحمراء القريبةتم تصميمه. الزناد الجذر الألكيل 2،20 -azobis [2- (2- إيميدازولين -2- بروبان] - ثنائي هيدروكلوريد (AIPH) وإنزيم البايرايت (FeS2) تم تغليفهما في هيدروجيل الاغاروز لتحضير AIPH–FeS2–نظام الهيدروجيل (AFH). يمكن استخدام FeS2 كعامل ضوئي حراري لتحويل الطاقة الضوئية القريبة من الأشعة تحت الحمراء إلى طاقة حرارية ، مما يؤدي إلى انحلال الهيدروجيل. يتم تحفيز AIPH في نفس الوقت لإنتاج جذور ألكيل. يمكن أيضًا استخدام FeS2 كملفمكبر الاكسدةلتقليل محتوى GSH داخل الخلايا ، وبالتالي تعزيز التأثير العلاجي لجذور الألكيل. في نهاية المطاف ، يمكن للجذور الحرة المستقلة عن الأكسجين الناتجة عن نظام AFH تحت إشعاع الليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء والمعالجة الضوئيةقتل الخلايا السرطانيةمن خلال التآزرأكسدة/ تأثير ضوئي. يوفر نظام AFH الذي تم تطويره هنا رؤى جديدة لتعزيز التأثير العلاجي لجذور الألكيل.

انقر هنا لمعرفة كيفية علاج مرض السرطان

مقدمة

في السنوات الأخيرة ، أصبحت العلاجات القائمة على الجذور الحرة مثل العلاج الضوئي الديناميكي والعلاج غير الديناميكي والعلاج الكهروديناميكي خيارات شائعة لعلاج سرطان الثدي. من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تحفز موت الخلايا عن طريق التسبب في تلف مؤكسد شديد أو خلل في التمثيل الغذائي للخلايا. علاج الأورام الصلبة .7-10 جذور ألكيل هي نوع جديد من الجذور الحرة التي لا تعتمد على توليد الأكسجين لقتل الخلايا وقد ثبت أنها فعالة في علاج الأورام في البيئات السامة ونقص الأكسجة. يمكن للجذور أن تحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية عن طريق زيادة الإجهاد التأكسدي ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا الدهنية والحمض النووي. كبادئ نموذجي للجذور الحرة ، 2 ، 20 - أزوبيس [2- (2- إيميدازولين -2- يل) بروبان] - ثنائي هيدروكلوريد (AIPH) يمكن أن يولد جذور ألكيل في درجات حرارة عالية. 12 يفعل ذلك حتى في حالة عدم وجود الأكسجين. الجذور الحرة المتولدة سامة للخلايا وستؤكسد على الفور عناصر الخلية أو تتفاعل مع الأكسجين لإنتاج مواد سامة ثانوية .13 حتى في البيئة الدقيقة للورم الناقص التأكسج ، يمكن لـ AIPH إنتاج جذور ألكيل لزيادة هيدروبيروكسيد الدهون داخل الخلايا وزيادة تحفيز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية. كل هذا يشير إلى أن Rc هو دواء واعد لعلاج السرطان.

يستخدم الضوء أو الحرارة كمحفز خارجي في العلاج الضوئي. يعتمد على التأثيرات الحرارية الموضعية لإزالة الأورام .18-20 العديد من العوامل الحرارية الضوئية (PTAs) مثل بلورات الذهب النانوية وثاني كبريتيد الموليبدينوم تُستخدم مع AIPH لإطلاق جذور الألكيل استجابةً لإشعاع الليزر تحت الأحمر. عادةً ما تحتوي البيئة الدقيقة للورم (TME) على مستوى عالٍ من تعبير الجلوتاثيون (GSH) في الأورام الصلبة لأن GSH يلعب دورًا مهمًا في مقاومة العلاج الإشعاعي من خلال تفاعل تلقائي أو تفاعل محفز GSH S transferase مع xenogenic. كعامل مختزل ، يمكن لـ GSH إزالة جذور الألكيل مباشرة. 21،26 وهذا يقلل من فعالية العلاجات القائمة على جذور الألكيل. إنزيم البايرايت (FeS2) النانوي ، باعتباره مادة نانوية حرارية ضوئية جديدة ، ليس فقط له تأثير حراري ضوئي جيد تحت ضوء NIR ولكن له أيضًا نشاط إنزيم نانوي. GSH إلى الجلوتاثيون المؤكسد.

أصبحت الهلاميات المائية طفيفة التوغل مؤخرًا شائعة كمنصة إطلاق خاضعة للرقابة. حقنة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل المعلمات مثل طاقة الليزر ووقت التشعيع لتغيير معدل إطلاق الدواء ، وبالتالي توسيع قابلية تطبيق طريقة العلاج هذه. و AIPH إلى TME من شأنه تحسين فعالية العلاجات القائمة على الجذور الحرة.

في هذه الدراسة ، تم تصميم طريقة تستخدم التوصيل داخل الورم لهيدروجيل قابل للحقن يحتوي على إنزيم FeS2 وبادئ الجذور الحرة AIPH. أولاً ، تم تحضير نظام هجين من AIPH-FeS 2- هيدروجيل (AFH) عن طريق تحميل جزيئات FeS2 النانوية و AIPH في هيدروجيل الاغاروز. يكون الهيدروجيل صلبًا في درجة حرارة الغرفة ، ويتم تغليف FeS2 و AIPH داخل مصفوفة. بمجرد تشعيعه بضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) ، يحول FeS2 طاقة ضوء NIR إلى طاقة حرارية ، مما يؤدي إلى تسخين نظام AFH ، ثم يذوب الهيدروجيل ويطلق FeS2 و AIPH. في درجات حرارة عالية ، يتحلل AIPH لإنتاج جذور ألكيل. بعد ذلك ، يقلل إنزيم FeS2 ، الذي يحاكي نشاط GSH-OXD ، محتوى GSH داخل الخلايا. سيؤدي تدمير GSH إلى تعزيز تأثير قتل جذور الألكيل. نظرًا لأن AFH يمكن أن يبقى في موقع الورم لفترة طويلة ، يمكن لنظام AFH أن يسمح بالتحكم الدقيق في إطلاق جذور الألكيل عن طريق تغيير شدة الليزر ووقت الإشعاع. أخيرًا ، يمكن للجذور الحرة المستقلة عن الأكسجين التي تم إنشاؤها بواسطة نظام AFH تحت إشعاع NIR وعلاج Pho-tothermal أن تقتل الخلايا السرطانية بشكل تآزري من خلال الأكسدة التآزرية / التأثير الحراري الضوئي ، كما أن نمو الورم أثناء دورة العلاج مأهول جيدًا. باختصار ، يعمل نظام AFH المصمم هنا على تضخيم التأثير العلاجي لـ AIPH عن طريق تغيير توازن الأكسدة والاختزال (المخطط 1).

النتائج والمناقشة

تم استخدام هيدروجيل الاغاروز منخفض نقطة الانصهار لتحضير هيدروجيل مركب يحتوي على FeS2 و AIPH. تم خلط FeS2 مع محلول agarose مائي عند 6 0 C ثم تحميله بمحفز شق الألكيل AIPH ، متبوعًا بتبريد سريع لدرجة حرارة الغرفة. وهكذا ، تم تشكيل مصفوفة AFH هيدروجيل. تم استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال لتوصيف مورفولوجيا FeS2 (الشكل 1 أ). أظهر FeS2 nano zyme شكلًا شبيهًا بالكرة بمتوسط ​​حجم جسيم يبلغ حوالي 148 نانومتر (الشكل S1 †). أظهرت أطياف امتصاص UV-vis لـ FeS2 (الشكل 1 ب) أنه تم امتصاص FeS2 بقوة في نطاق NIR عند 8 0 8 نانومتر. هذه الخاصية تجعل FeS2 منطقة جيدة للمرضى بعد إنتهاء التجربة. تمت دراسة الأداء الحراري الضوئي لإنزيم FeS2 بتركيزات مختلفة (0 ، 25 ، 50 ، 100 مجم مل 1) عن طريق تشعيع المحلول بنظام ليزر 0.5 وات سم 2 808 نانومتر (الشكل 1 ج). كان تأثير التسخين للمحلول متناسبًا طرديًا مع تركيز FeS2. زادت درجة حرارة محلول 100 مجم مل 1 FeS2 بحوالي 17.5 درجة مئوية في 5 دقائق فقط من تشعيع الليزر ، مما يدل على الأداء الحراري الضوئي الجيد لـ FeS2. أظهر الفحص المجهري الإلكتروني أيضًا أن هيدروجيل AFH لديه شبكة معقدة من بنية المسام وتوزيع حجم المسام (الشكل 1 د) ، مما يجعل الهيدروجيل مناسبًا لتحميل الدواء للتسليم. يعد الثبات الحراري الضوئي أيضًا معيارًا مهمًا لتقييم جودة PTA. تم تسخين محلول PTA.36 A 200 مجم مل 1 FeS2 باستخدام ليزر 808 نانومتر NIR لمدة 5 دقائق ، ثم تم إيقاف تشغيل الليزر ، وتم السماح لمحلول FeS2 بالتبريد بشكل طبيعي لدرجة حرارة الغرفة. تكررت هذه العملية عدة مرات لتقييم الاستقرار الحراري الضوئي لـ FeS2 (الشكل 1E). لم يكن هناك تغيير واضح في منحنى التسخين لكل دورة ضوئية حرارية ، ولم يلاحظ سوى اختلاف طفيف في درجة حرارة الذروة التي تحققت بعد 5 دقائق من التشعيع ، للتحقق من الاستقرار الحراري الضوئي لـ FeS2. كشف التحليل الريولوجي أيضًا عن معامل تخزين مرتفع للهيدروجيل المحضر في الحالة الصلبة عند درجة حرارة الغرفة (الشكل 1F). مع ارتفاع درجة الحرارة ، يتجمع الهيدروجيل تدريجياً ويذوب ، وينخفض ​​معامل التخزين تدريجياً. بعد ذلك ، تم إجراء تجربة الانحلال الحراري الضوئي على هيدروجيل FeS2. تم وضع AFH المتصلب (FeS2 الموجود في الهيدروجيل) في طبق زجاجي يحتوي على ماء منزوع الأيونات. في درجة حرارة الغرفة ، حافظ هيدروجيل AFH المحضر على شكله الصلب ، ولكن بعد 10 دقائق من التشعيع باستخدام ليزر 808 نانومتر ، تم إذابة الهيدروجيل بالكامل تقريبًا ، وتم إطلاق مادة FeS2 النانوية وحلها في الماء في الطبق الزجاجي (الشكل . 1G). أكد مصور الأشعة تحت الحمراء الحراري أيضًا الزيادة الكبيرة في درجة حرارة AFH أثناء التشعيع (الشكل 1H). أظهر طيف التحليل الطيفي الكهروضوئي للأشعة السينية (XPS) لـ FeS2 بعد التفاعل مع الهيدروجيل أن FeS2 يحتوي على عناصر Fe و S (الشكل S2 †). كما هو مبين في الشكل S3 ، انخفض محتوى GSH بشكل كبير بعد الحضانة المشتركة لـ FeS2 و GSH ، وله منحنى ارتباط إيجابي مع الوقت والتركيز. علاوة على ذلك ، كان النشاط الشبيه بـ POD لـ FeS2 يعتمد على الحجم. أظهرت الإنزيمات النانوية بحجم 150 نانومتر نشاطًا أعلى من تلك ذات الأحجام 280 و 687 نانومتر (الشكل S4 †).

بناءً على الخصائص عالية الأداء لـ AFH ، تم تقييم آثاره المضادة للورم. في البداية ، تم استخدام مجموعة تلطيخ الخلايا الحية / الميتة الفلوريسين ثنائي الأسيتات / بروبيديوم يوديد لاستكشاف تأثير القتل لهيدروجيل AFH المحضر جنبًا إلى جنب مع تشعيع NIR. أظهرت مجموعة PBS plus NIR ومجموعة AFH فقط تألقًا أخضر قويًا ، بينما AIPH بالكاد أظهر أي تأثير قتل (الشكل 2 أ). قمنا بإعداد هيدروجيل يحتوي فقط على FeS2 (FH) للتحقق من نتائج التجارب النسبية. هيدروجيل المحضر المحتوي فقط على FeS2 (FH) مع NIR كان له تأثير قتل معتدل. والجدير بالذكر أن علاج AFH plus NIR كان له أفضل تأثير سام للخلايا.

تم استخدام مسبار ثنائي كلورو فلورسين ثنائي الأسيتات للكشف عن قدرة AIPH على إنتاج ROS. أظهر AIPH قدرة أضعف على إحداث ROS في غياب إشعاع الليزر ، بينما أظهر FH المحمل بـ FeS2 درجة معتدلة من إنتاج ROS بعد تشعيع NIR (الشكل 2 ب). يمكن أن يُعزى التألق الأخضر اللامع الذي لوحظ في مجموعة العلاج AFH plus NIR إلى إطلاق FeS2 و AIPH بعد إشعاع الليزر (الشكل 2C). علاوة على ذلك ، أظهرت مجموعات AIPH و AIPH بالإضافة إلى NIR القليل جدًا من التألق الأخضر (الشكل S5 †). كما أظهر اختبار CCK -8 نفس النتائج. كانت قابلية بقاء الخلية لمجموعة AFH plus NIR حوالي 8.5 بالمائة ، والتي كانت مختلفة بشكل كبير عن المجموعات الأخرى (الشكل 2D). ستعمل درجة الحرارة المرتفعة على تعزيز تحلل AIPH لإنتاج جذور الألكيل. في الوقت نفسه ، يمكن لـ FeS2 ممارسة نشاط GSH-OXD لتقليل GSH داخل الخلايا. يتم تصنيع GSH ، باعتباره ثلاثي الببتيد في كل مكان يحتوي على الثيول ، من الأحماض الأمينية المكونة له (حمض الجلوتاميك والسيستين والجليسين) في العديد من الخلايا. يتم إنتاج GSH بكثرة في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. يوجد GSH في الخلايا بشكل عام في الشكل المختزل ، والذي يمكن أن يتفاعل مع المواد المؤكسدة مثل مجموعات الألكيل أثناء التأكسد إلى شكله المؤكسد الجلوتاثيون ثنائي القطب (GSSG) ، وبالتالي تقليل التأثير المضاد للورم على أساس الجذور الحرة .37 استنفاد GSH سيعطل توازن الأكسدة والاختزال في الخلايا ، ويسبب الإجهاد التأكسدي ، ويؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج. 38 تم استخدام كاشف Ellman لاختبار قدرة كل مجموعة على استنفاد GSH. أظهرت مجموعة AFH مجتمعة NIR أفضل قدرة على استنفاد GSH (الشكل 2E).

مخطط 1 هيدروجيل النانو لتوليد جذري ألكيل محسن وعلاج قوي مضاد للأورام

الشكل 1 (أ) صورة TEM لـ FeS2. (ب) طيف امتصاص UV-Vis-NIR لمحلول FeS2. (ج) منحنيات التسخين للتركيزات المختلفة لمحاليل الجسيمات النانوية FeS2 عند التشعيع بالليزر عند 8 0 8 نانومتر (0. 5 وات سم 2) لمدة 5 دقائق. (د) صورة SEM للهيدروجيل. (هـ) تغير درجة الحرارة لمحلول FeS2 تحت إشعاع الليزر الدوري. (F) منحنيات الريولوجيا ودرجة الحرارة (الأحمر والأسود ، على التوالي) لـ AFH المحضر استجابةً لإشعاع الليزر 0. 5 واط سم 2 808 نانومتر. (G) مورفولوجيا AFH المحضر قبل وبعد إشعاع الليزر 0.5 واط سم 2 808 نانومتر لمدة 10 دقائق وصور حرارية بالأشعة تحت الحمراء (H) لـ AFH المحضر بعد التشعيع.

نظرًا لأدائه الجيد في المختبر باعتباره إنزيم PTA و GSH OXD الذي يحاكي إنزيم ، تمت دراسة تأثير AFH على تحويل الضوء إلى الحرارة NIR في الجسم الحي. تم حقن الفئران BALB / c تحت الجلد بخلايا 4T1 لتشكيل الأورام. يوضح الشكل 3 أ منحنى تغير درجة الحرارة لمجموعة PBS ومجموعة AFH بعد 8 0 8 نانومتر ليزر NIR 0.5 واط سم 2 لمدة 10 دقائق. زادت درجة حرارة مجموعة AFH بنحو 17.6 درجة مئوية بعد التشعيع ، بينما زادت درجة حرارة مجموعة PBS بصعوبة. يمكن أن تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى تغيير رطوبة غشاء الخلية السرطانية ، وبالتالي زيادة نفاذية غشاء الخلية ، والذي بدوره يتسبب في تلف حراري للبروتينات. 39،40 في النهاية ، تفقد الخلايا السرطانية القدرة على التكاثر. بعد ذلك ، تم تقييم نشاط مضاد الأورام بوساطة AFH في الفئران الحاملة للورم 4T1. تم تقسيم الفئران الحاملة للورم بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات. زاد حجم الورم لدى الفئران في مجموعة PBS plus NIR ومجموعة AIPH بسرعة خلال فترة العلاج التي استمرت أسبوعين ، وأظهرت مجموعة AFH تأثيرًا طفيفًا في تثبيط الورم (الشكل 3C). كان هذا بسبب استقلاب الاغاروز ببطء ، وتم إطلاق بعض الأدوية ببطء. كان لمجموعة AFH plus NIR أقوى تأثير على نمو الورم. أثناء العلاج ، تم قمع حجم الورم لدى الفئران بشكل كبير. بعد فترة العلاج ، تم التضحية بالفئران وعزل الأورام ووزنها. كانت نتائج وزن الورم متوافقة مع نتائج حجم الورم (الشكل ثلاثي الأبعاد).

الأهم من ذلك ، خلال الدراسة بأكملها ، لم يلاحظ أي تغييرات في وزن الجسم في مجموعة العلاج ، مما يشير إلى أن العلاج لم يسبب أي سمية جهازية كبيرة للفئران (الشكل S6). هذه النتيجة مشجعة للغاية لأنه على الرغم من أن العديد من المواد أظهرت نتائج تجريبية جيدة ، إلا أنها تسببت أيضًا في آثار جانبية خطيرة ، مما أعاق بشكل خطير آفاقها السريرية. 41 ، 42 20 ، 70 - تم استخدام ثنائي أسيتات ثنائي كلورووريسين لقياس البُطن - جيل ROS الورمي في الفئران المعالجة. تم تحسين التلوين بشكل كبير في الأورام الخاضعة للعلاج المركب لـ AFH بالإضافة إلى NIR (الشكل 3E). أدى إنتاج الجذور الحرة المعزز إلى تأثير علاجي محسن في النموذج الحيواني. تم استخدام تحليلات تلطيخ TUNEL و Ki -67 للتحقق من موت الخلايا المبرمج وانتشارها (الشكل 3E). كانت أنسجة الورم في مجموعة AFH plus NIR نخرية على نطاق واسع دون تكاثر ملحوظ.

الشكل 3 (أ) صور حرارية بالأشعة تحت الحمراء للأورام بعد التشعيع باستخدام 8 0 ليزر 8 نانومتر (0. 5 واط سم 2) لمدة 1 0 دقيقة في مجموعات العلاج المحددة. (ب) زيادة درجة الحرارة في الفئران المزروعة بأورام 4T1 بعد 8 0 8 نانومتر تشعيع بالليزر (0.5 واط سم 2) لمدة 10 دقائق في مجموعات العلاج المشار إليها. (ج) يتغير حجم الورم بمرور الوقت في المجموعات المعالجة كما هو محدد. (د) متوسط ​​قيم وزن الورم المرتبطة بالعلاجات المشار إليها. (E) ROS و Ki {13}} وأقسام الأورام المصبوغة من مجموعات العلاج المحددة. ** P <0.01 ، *** P <0.005 ؛ اختبار الطالب.

بعد العلاج ، لم يكن للأعضاء الحيوية (القلب ، الكبد ، الطحال ، الرئة ، الكلى) أي التهاب أو تلف. كانت مؤشرات الكبد والكلى طبيعية (الشكل 4A-D و S7). تُظهر البيانات التجريبية الشاملة في الجسم الحي أن العلاج التآزري AFH و PTT له تأثيرات علاجية جيدة وتوافق مع الحياة. لديها احتمالات جيدة للتطبيقات الطبية السريرية في المستقبل.

الشكل 4 نتيجة تجارب السلامة في الجسم الحي. بيانات الكيمياء الحيوية للدم بما في ذلك علامات وظائف الكلى: (أ) علامات وظائف الكبد: CRE و (B) BUN و (C) ALT بعد العلاجات المختلفة. (د) نتائج تحليل الأنسجة المرضية (صور ملطخة H & E) للأعضاء الرئيسية والقلب والرئة والكبد والكلى والطحال للفئران التي تعرضت لعلاجات مختلفة بعد 16 يومًا من الحقن. قضبان النطاق: 100 مم.

خاتمة

لقد صممنا هيدروجيل قابل للحقن مستجيب للصور يمكنه في وقت واحد تحقيق علاج الجذور الحرة و PTT من خلال تغليف إنزيم FeS2 ومصدر جذري الألكيل AIPH في هيدروجيل agarose. تحت إشعاع ليزر 808 نانومتر ، يعزز PTA FeS2 تسخين نظام AFH ويؤدي إلى إطلاق AIPH وتحللها لإنتاج جذور الألكيل. في الوقت نفسه ، يمكن لـ FeS2 تقليل محتوى GSH داخل الخلايا ، وبالتالي تدمير توازن الأكسدة والاختزال. يمكن تغيير معدل انحلال الهيدروجيل بواسطة معلمات مثل كثافة طاقة الليزر وحجم البقعة. أظهرت كل من الدراسات التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر أن الجمع بين AFH مع تشعيع NIR يمكن أن يحقق آثارًا قوية لقتل الورم مع تأثيرات ضارة ضئيلة. يوفر نظام الهيدروجيل المصمم في هذه الدراسة استراتيجية لتعزيز الأنظمة العلاجية القائمة على جذور الألكيل.

مراجع

1 D. Zhu و J. Zhang و G. Luo و Y. Duo و BZ Tang ،حال. علوم., 2021, e2004769.

2 سي هوانغ ، إس. دينغ ، دبليو جيانغ ، إف. وانغ ،مقياس النانو, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu، Y. Qu، K. Shi، B. Chu، Y. Jia، X. Xiao، Q. He and Z. Qian،ذقن. تشيم. بادئة رسالة., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning، Y. Zheng، K. Qiao، G. Li، Q. Bai and S. Xu،J. Nanobiotechnol., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu، T. Zhang، Y. Li، C. Huang، M. Suo، L. Xia، Y. Xu، G. Li and BZ Tang،المواد الحيوية, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu و R. Ling و H. Chen و M. Lyu و H. Qian و K. Wu و G. Li و X. Wang،الدقة نانو.، 2022 ، DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu و M. Lyu و W. Jiang و M. Suo و Q. Huang و K. Li ،جيه ماتر. تشيم. ب, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo، PA Gurr، DE Dunstan and GG Qiao،ACS نانو, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu و Z. Liu و Y. Li و Q. Huang و L. Xia و K. Li ،المواد الحيوية, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li، R. Luo، X. Liang، Q. Wu and C. Gong،ذقن. تشيم. بادئة رسالة.، 2021 ، DOI:10.1016 / j.cclet.2021.11.048.