يتعارض نارينجين وهيسبيريدين مع السمية الكبدية المستحثة بالديكلوفيناك في ذكور فئران ويستار من خلال أنشطتها المضادة للأكسدة والالتهابات ومضادات التبول ، الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

1 المقدمة

العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية) لها آثار جانبية مختلفة [1]. يعتبر الديكلوفيناك ، كواحد من هذه الفئة من الأدوية ، أحد مشتقات حمض فينيل أسيتيك الذي يستخدم منذ فترة طويلة كعقار مسكن ومضاد للالتهابات لعلاج حالات معينة [2]. ) إنزيمان بقوة أكبر من تأثيرهما على COX -1 [3]. على الرغم من أن للديكلوفيناك تأثيرات علاجية قوية ، فإن استخدامه المستمر يرتبط بآثار ضائرة خطيرة مرتبطة بالجرعة [3]. زيادة فيمؤكسدتم الإبلاغ عن الإجهاد وقمع أنظمة الدفاع المضادة للأكسدة من خلال المنشورات المختلفة التي تورطت في إحداث السمية والآثار الجانبية للدواء [4،5]. قد يؤدي استخدام مضادات الأكسدة مثل فلافونويد الحمضيات مع الديكلوفيناك إلى مقاومة الإجهاد التأكسدي الناجم عن الديكلوفيناك وبالتالي قد يمنع الآثار الجانبية للأدوية والسمية.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

النارينجين المسؤول عن النكهة الحامضة والمذاق المر لثمار أنواع الحمضيات له خصائص دوائية وعلاجية واسعة النطاق مثل خافض للدهون ومضاد للالتهابات وإزالة الجذور الحرة ومضادات الأكسدة ومضادات فرط شحميات الدم.

خصائص مضادة للالتهاب ، ومضاد للهرمون [6،7. Hesperidin هو نوع آخر من الفلافونويد المعزول من أنواع الحمضيات التي لها العديد من الخصائص البيولوجية ، وخاصة مضادات الأكسدة ومضادات الالتهابات [8]. تم الإبلاغ عن أن هسبريدين يحسن إصابة أنسجة الكبد التي يسببها السيتوكروم والتي لوحظتالأنسجةالفحص [9]. كما تم الكشف عن أن هسبريدين كان فعالاً في القمعاشتعالوأعراض الحساسية وعلاج التهاب الأنف التحسسي [10]. لذلك ، أجريت هذه الدراسة لتقييم الآثار الوقائية المحتملة للنارينجين والهسبريدين على تسمم الكبد الناجم عن الديكلوفيناك ولاستكشاف دور تعديل الالتهاب والإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج في الإجراء الوقائي.

2. المواد والأساليب

2.1. الكيماويات والأطقم. تم الحصول على ديكلوفيناك الصوديوم من شركة النصر للكيماويات الدوائية ، مصر.

تم إنتاج Naringin و hesperidin بواسطة شركة Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). جميع المواد الكيميائية المستخدمة الأخرى ذات درجة تحليلية وتم الحصول عليها من شركات الكيماويات المحلية. تم الحصول على مجموعات Alanine transaminase (ALT) و aspartate trans-aminase (AST) من Spinreact ، Ctra Sta Coloma ، 7.17176 St. ، Esteve de Bas ، جيرونا ، إسبانيا. تم الحصول على اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) و y-glutamyltransferase (GGT) من شركة Spectrum ، الشركة المصرية للتكنولوجيا الحيوية ، المنطقة الصناعية بمدينة العبور ، القاهرة ، مصر. تم الحصول على طقم الفوسفاتيز القلوي (ALP) من Biodiagnostic ، 29 شارع التحرير ، الدقي ، الجيزة ، مصر. تم الحصول على أطقم الألبومين والبيليروبين من دياموند ، شارع المنصة ، مصر الجديدة ، القاهرة ، مصر.

يمكن أن يحسن cistanche المناعة

2.2 الحيوانات التجريبية. تم استخدام ذكور الفئران البالغة من سلالة Wistar التي تزن 100-130 جم (9-1 أسبوعًا) كحيوانات تجريبية في العمل الحالي.

تم الحصول عليها من Ani-mal House of Ophthalmology Research Institute، Giza، Egypt. تم إيواء الحيوانات في أقفاص جيدة التهوية لمدة 12 ساعة يوميًا من دورات الضوء والظلام ودرجة حرارة بين 20 و 25 درجة. تم تكميل الفئران يوميًا بنظام غذائي معياري على شكل حبيبات وماء للشهرة. تم الحفاظ على الحيوانات لمدة أسبوعين تحت الملاحظة قبل بدء التجربة للتكيف واستبعاد أي إصابة متداخلة. تتوافق جميع منهجيات الحيوانات مع إرشادات وتعليمات لجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية بكلية العلوم لرعاية واستخدام الحيوانات ، جامعة بني سويف ، مصر. رقم الموافقة الأخلاقية هو BSU / FS / 2015/15. تم بذل كل الجهود للحد من معاناة الحيوانات وضيقها.

2.3 التجميع الحيواني. تم استخدام ثلاثين من ذكور الفئران Wistar في هذه التجربة وتم توزيعها على خمس مجموعات (الشكل 1).

تلقت جرذان المجموعة 1 (العادية) حجمًا مكافئًا من المحلول الملحي (السيارة التي تم فيها حل ديكلوفيناك) عن طريق الحقن داخل الصفاق وأيضًا بالحجم المكافئ البالغ 1 في المائةكاربوكسيميثيلالسليلوز (CMC ؛ الوسيلة التي تم فيها إذابة النارينجين والهسبريدين) بالتزقيم الفموي يوميًا لمدة 4 أسابيع. تم حقن المجموعة 2 (المجموعة المحقونة بالديكلوفيناك) بالديكلوفيناك (المذاب في محلول ملحي) عن طريق الإعطاء داخل الصفاق بجرعة 3 مجم / كجم من وزن الجسم (كجم / كجم) / يوم [11] وتم إعطاؤها أيضًا الحجم المعادل بنسبة 1 في المائة CMC عن طريق الفم يوميا لمدة 4 أسابيع. المجموعة 3 (المجموعة المحقونة بالديكلوفيناك والمعاملة بالنارينجين) أعطيت ديكلوفيناك كما في المجموعة 2 وعولجت بالفم بالنارينجين (مذاب في 1٪ CMC) بمستوى جرعة 20 مجم / كجم. وزن / يوم بالتزقيم الفموي [12] لمدة 4 أسابيع. المجموعة 4 (المجموعة المحقونة بالديكلوفيناك والتي عولجت بهسبريدين) تم إعطاؤها ديكلوفيناك كما في المجموعة 2 وعولجت عن طريق الفم مع هيسبيريدين (تم حلها في 1 بالمائة من CMC) بجرعة 20 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم [13] لمدة 4 أسابيع. المجموعة 5 (المجموعة المحقونة بالديكلوفيناك والمعاملة بالنارينجين والهسبريدين) تمت تكميلها بالديكلوفيناك كما في المجموعة 2 وعولجت عن طريق الفم بالنارينجين وهسبريدين(مذاب في 1 بالمائة CMC) بجرعة 20 مجم / كجم ب. بالوزن / يوم لمدة 4 أسابيع.

2.4 أخذ عينات الدم والكبد.

في نهاية التجربة حُرمت الفئران من الطعام ، وتم جمع عينات الدم من الأوردة الوداجية. تركت عينات الدم لتتخثر في درجة حرارة الغرفة ثم طردت عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. تم تجزئة مصل كل عينة دم إلى ثلاث قوارير تم حفظها عند درجة -30 حتى استخدامها للتحليل الكيميائي الحيوي.

بعد أخذ عينات الدم من الوريد الوداجي ، تم قتل الفئران وتشريحها. تم استئصال الكبد من كل فأر سريعًا وغسله في محلول ملحي معقم ({0}}. 9 بالمائة من كلوريد الصوديوم. تم تثبيت أجزاء من الكبد في 10 بالمائة من الفورمالين المحايد المحايد للفحص النسيجي. ديب فريزر بدرجة -30 في انتظار التجانس في محلول ملحي معقم متساوي التوتر (0.9 بالمائة كلوريد الصوديوم) لتحديد الإجهاد التأكسدي وعلامات دفاع مضادات الأكسدة. تم الاحتفاظ بالجزء الثالث من الكبد عند درجة -30 في أنابيب إيبندورف المعقمة من أجل تحليل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR).

2.5 الكشف عن معلمات وظائف الكبد في مصل الدم.

تم تقدير أنشطة ALT و AST باستخدام طريقة أكسدة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الهيدروجين (NADH) وفقًا لطرق موراي [14] وموراي [15] ، على التوالي ، باستخدام مجموعات الكاشف المشتراة من Spinreact ، إسبانيا. باختصار ، يحفز ALT تحويل الألانين إلى بيروفات ، والذي يتم تقليله إلى اللاكتات بواسطة LDH ، ويتأكسد NADH إلى نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD). معدل الانخفاض في تركيز NADH ، المقاس ضوئيًا عند 340 نانومتر ، يتناسب مع التركيز التحفيزي لـ ALT الموجود في عينة المصل. من ناحية أخرى ، يحفز AST تحويل الأسبارتات إلى oxaloacetate ، والذي يتم تقليله إلى malate بواسطة malate dehydrogenase (MDH) ، ويتأكسد NADH إلى NAD. معدل الانخفاض في تركيز NADH ، المقاس ضوئيًا عند 340 نانومتر ، يتناسب مع التركيز التحفيزي لـ AST الموجود في عينة المصل. تم الكشف عن نشاط المصل LDH وفقًا لطريقة Van der Heiden et al. [16]. في هذه الطريقة ، يحفز LDH التفاعل بين البيروفات و NADH لإنتاج NAD * و L-lactate. معدل الانخفاض في تركيز NADH ، المقاس ضوئيًا عند 340 نانومتر ، يتناسب مع التركيز التحفيزي لـ LDH الموجود في العينة. تم تحديد نشاط مصل ALP وفقًا لطريقة Belfield و Goldberg [17] باستخدام مجموعات تم الحصول عليها من Biodiagnostic ، مصر. بإضافة عينة مصل إلى فوسفات فينيل (5 مليمول / لتر) عند الرقم الهيدروجيني 10 ،

يؤدي ALP إلى تكوين الفينول والفوسفات. يتم قياس الفينول المحرر بطريقة القياس اللوني عند 51 0 نانومتر في وجود 4- أمينوفينازون وبوتاسيوم فيريسيانيد. تم تحديد نشاط GGT وفقًا لطريقة Szasz و Persijn [18] باستخدام مجموعات تم الحصول عليها من Spectrum Diagnostic ، الشركة المصرية للتكنولوجيا الحيوية ، مصر. ينقل GGT مجموعة هم-جلوتاميل من الركيزة L - - الجلوتاميل-ف-نيتروانيليد ، مما يحرر الكروموجين p-nitroanilide (PNA) الذي يقاس عند 418 نانومتر ويتناسب تكوينه مع نشاط GGT. تم تحديد مستوى الألبومين في الدم وفقًا لطريقة Doumas et al. [19] باستخدام مجموعات كاشف تم شراؤها من Diamond ، مصر. تم تنفيذ الطريقة ، باختصار ، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المصل إلى 2 مل من المصل الأخضر (0.12 ملمول / لتر) في محلول السترات درجة الحموضة 3.8. الألبومين /بروموكريسولتم قياس المعقد الأخضر ، المتكون من التفاعل ، عند 630 نانومتر. تم تقييم مستوى البيليروبين في الدم وفقًا لطرق مالوي وإيفلين [20] باستخدام مجموعات الكاشف التي تم شراؤها من Diamond ، مصر. تعتمد طريقة تقدير البيليروبين هذه على تفاعل فان دن بيرغ. في هذا التفاعل ، يتفاعل البيليروبين مع حمض السلفانيليك ديازوتيزيد لإنتاج أزوبيليروبين وهو أرجواني اللون وتم قياسه ضوئيًا عند 578 نانومتر. شدة اللون تتناسب طرديا مع كمية البيليروبين في المصل.

2.6. تقييم عوامل الإجهاد التأكسدي للكبد ونظام الدفاع المضاد للأكسدة.

تم تحديد بيروكسيد الدهون في الكبد (LPO) وفقًا لطريقة Preuss et al. [21]. باختصار ، تم ترسيب البروتين عن طريق إضافة 0. 15mL 76٪ trichloroacetic acid (TCA) إلى 1 mL متجانس الكبد. بعد ذلك ، 0 تمت إضافة 35 مل من حمض الثيوباربيتوريك (TBA) ، كعامل لتكوين اللون ، إلى المادة الطافية المنفصلة. تم قياس اللون الوردي الباهت المتطور عند 532 نانومتر بعد الحضانة في حمام مائي عند 8 0 درجة لمدة 30 دقيقة. تم استخدام MDA (malondialdehyde أو 1،1،3 ، 3- رباعي ميثوكسي بروبان) كمعيار. تم تحديد محتوى الجلوتاثيون المنخفض (GSH) في الكبد بإضافة 0.5 مل 5،5'-dithiobis (2- حمض النيتروجين-zoic) ، وكاشف Ellman (كعامل تطوير اللون) ، ومحلول منظم الفوسفات (pH 7 ) لتجانس مادة فائقة الصغر بعد ترسيب البروتين بناءً على إجراء Beutler et al. [22]. تم قياس الألوان الصفراء المطورة في العينات ومعايير GSH عند 412 نانومتر مقابل الفراغ. تم قياس نشاط الكبد GPx وفقًا لإجراء ماتكوفيكس وآخرون. [23] مع بعض التعديلات. تعتمد هذه الطريقة على اكتشاف GSH الذي يتم تحويله إلى الجلوتاثيون المؤكسد (GSSG) بواسطة الإنزيم من خلال الكشف عن GSH المتبقي وطرحه من الإجمالي. باختصار ، تمت إضافة 50 ميكرولتر من المادة الطافية المتجانس إلى أنبوب Wasserman الذي يحتوي على 350 ميكرولتر من محلول Tris （الأس الهيدروجيني 7.6 ، ومحلول GSH 50 ميكرولتر （2 ملي مولار ، و 50 ميكرولتر H ، O ، (3.38 ملي مول). بعد ذلك ، بعد 10 دقائق من الحضانة ، تم قياس محتوى GSH المتبقي بالطريقة الموصوفة سابقًا لتحديد GSH عند 430 نانومتر. تم تحضير الاختبار القياسي بإضافة 50 ميكرولتر من الماء المقطر بدلاً من عينة 50 ميكرولتر وتم تحضير الاختبار الفارغ بإضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر بدلاً من عينة 50 ميكرولتر ومحلول GSH 50 ميكرولتر. بعد الكشف عن محتوى GSH المتبقي في العينة ، يتم تحويل GSH إلى شكل مؤكسد (GSSG) ويمكن حساب نشاط الإنزيم. تم الكشف عن نشاط ديسموتاز الكبد الفائق (SOD) وفقًا لطريقة Marklund و Marklund [24]. يعتمد التفاعل على تثبيط الأكسدة الذاتية للبيروجالول بواسطة SOD. تعتمد العملية على وجود أيونات الأكسيد الفائق. كمية الإنزيم الذي يسبب تثبيطًا بنسبة 50 بالمائة في الانقراض يتغير في دقيقة واحدة مقارنةً بالتحكم على أنه وحدة واحدة من الإنزيم.

2.7.تحديد مستويات مصل TNF- و IL -17 و IL -4.

تم تقدير مستويات مصل TNF- و -17 وأنا -4 وفقًا لمجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم الحصول على مجموعة أدوات ELISA الخاصة بـ Rat TNF-alpha (رقم الكتالوج: MBS355371) و IL -17 مجموعة ELISA (رقم الكتالوج MBS5203506) ومجموعة ELISA -4 (رقم الكتالوج: MBS494192) من MyBioSource، Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. تستخدم مجموعات ELISA شطيرة ELISA. باختصار ، تم تغليف لوحات ELISA الدقيقة المتوفرة في هذه المجموعات بجسم مضاد خاص بالسيتوكين المعني. يتم إضافة المعايير أو العينات إلى آبار لوحة ELISA الدقيقة المناسبة ويتم دمجها مع الأجسام المضادة المحددة. بعد ذلك ، يتم إضافة جسم مضاد للكشف عن البيوتينيل خاص بالسيتوكين المعنى واتحاد بيروكسيداز أفيدين-الفجل (HRP) إلى كل صفيحة ميكروية جيدًا وحضانة على التوالي. يتم غسل المكونات المجانية. يضاف محلول الركيزة إلى كل بئر. فقط تلك الآبار التي تحتوي على السيتوكين ، والأجسام المضادة للكشف الحيوي ، ومتقارن avidin-HRP ستظهر باللون الأزرق. يتم إنهاء تفاعل الركيزة الإنزيمية بإضافة محلول حمض الكبريتيك ويتحول اللون إلى اللون الأصفر. تُقاس الكثافة الضوئية (OD) بالطيف الضوئي بطول موجة 450 نانومتر. تتناسب قيمة OD مع تركيز السيتوكين المختبَر ويمكن تحديد تركيزه في العينات من خلال مقارنة OD للعينات بالمنحنى القياسي.

2.8 الكشف عن تعبير mRNA لـ p53

2.8.1. عزل الحمض النووي الريبي.

تم عزل RNA الكلي من أنسجة الكبد وفقًا لطريقة Chomzynski و Sacchi [25] و Boom et al. [26] باستخدام مجموعة تنقية Thermo Scientific GeneJET RNA تم الحصول عليها من شركة Thermo Fisher Scientific Inc. ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية. باختصار ، يتم تحليل عينات الكبد وتجانسها في محلول تحلل ، والذي يحتوي على ثيوسيانات الغوانيدين كملح شوتروبيك و- مركابتوإيثانول قادر على حماية الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي الداخلي المنشأ. ثم يتم خلط المحللة مع الإيثانول وتحميلها على عمود تنقية. يتسبب الملح والإيثانول في ربط الحمض النووي الريبي بغشاء السيليكا بينما يتم لف المحلول خلال العمود. بعد ذلك ، تتم إزالة الشوائب بشكل فعال من الغشاء عن طريق غسل العمود بمخازن الغسيل. يتم بعد ذلك التصفية من الحمض النووي الريبي النقي تحت ظروف منخفضة القوة الأيونية بمياه خالية من نوكلياز. تم تحديد مستويات الحمض النووي الريبي المعزول وقياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي فوق البنفسجي وأخذ الامتصاص عند الكثافات الضوئية (OD) عند 26 0 نانومتر و 280 نانومتر. تم تحديد كمية الحمض النووي الريبي وتأهيله بناءً على صيغة Sambrook و Russell [27] （RNA （ug / μL）=ODat 260nm × التخفيف × 40ug / mL / 1000）. لكل عينة RNA مستخرجة ، النسبة بين OD عند 260 نانومتر و OD عند 280 نانومتر وتراوحت النسبة بين 1.7 و 2.0 تضمن نقاء عالي من الحمض النووي الريبي المستخرج.

2.8.2. تم تطبيق اختبار RT-PCR Assay.RT-PCR باستخدام Thermo Scientific Verso 1- Step RT-PCR Reddy Mix Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.،

روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) للكشف عن تعبير الرنا المرسال للكبد p53 باختصار ، في رد فعل من خطوة واحدة ، تم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي إلى (كدنا) وتم تضخيم الحمض النووي الريبي الناتج بواسطة Techne 32 Ther-mocycler. يتكون خليط التفاعل من Veso Enzyme Mix （1μL ، 2X One-Step PCR ReadyMix （25μL） ، RT محسن （25μL） ، تمهيدي أمامي （10μM ؛ 1 ميكرولتر） ، التمهيدي العكسي （10 ميكرومتر ؛ 1 ميكرومتر ، قالب RNA 1 نانوغرام ؛ 1.5 ميكرولتر） ، وخالي من نوكلياز الماء لإكمال الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر. يتضمن برنامج التدوير الحراري تخليق cDNA (درجة الحرارة 50 درجة ، 15 دقيقة ، دورة واحدة) ، تعطيل العكس (درجة الحرارة 95 درجة ، دقيقتان ، دورة واحدة) ، التمسخ (درجة الحرارة 95 درجة ، 20 ثانية) ، التلدين (درجة الحرارة. 55 درجة مئوية ، 30 ثانية) ، التمديد (درجة الحرارة 72 درجة ، دقيقة واحدة) ، والتمديد النهائي (درجة الحرارة 72 درجة ، 5 دقائق ، دورة واحدة). عدد دورات التمسخ متبوعًا بالتلدين والتمديد هو 35 دورة. بعد النسخ العكسي والتضخيم ، تم تحليل 10 ميكرولتر من منتجات PCR على هلام agarose بنسبة 1.5 بالمائة ملطخ ببروميد الإيثيديوم في 1 × Tris Borate EDTA buffer (TBE) pH 8. {{39} }.5. تم تصور الصورة الكهربي وتحليلها بواسطة نظام التوثيق الهلامي (GelDocu Advanced) ، وتم تطبيع القيم مع كمية -actin. كانت متواليات زوج التمهيدي p53 عبارة عن 5-CAGCGTGATGATGGTAAGGA 3 '(للأمام) و 5-GCGTTGCTCTGGGTGA 3' (عكسيًا) وفقًا لعسيري [28].

2.9 التحقيقات النسيجية المرضية. بعد التضحية والتشريح ، تم استئصال الكبد من كل فأر بسرعة ثم ترويه في محلول ملحي.

تم أخذ قطع من كبد كل فأر 3 مم² وتثبيتها في 1 0 بالمائة من الفورمالين المحايد لمدة أربع وعشرين ساعة. تم إرسال الكبد الثابت إلى قسم علم الأمراض ، كلية الطب البيطري ، جامعة بني سويف ، لمزيد من المعالجة ، والحجب في الشمع ، والتقطيع ، والتلطيخ بالهيموكسيلين والأيوزين (H&E) [29]. تم فحص أقسام الكبد الملطخة للكشف عن درجات الأنسجة المرضية. في ثلاثة حقول تم اختيارها عشوائيًا من كل قسم (× 1 0 0) ، تم تصنيف الآفات أو الإصابات على أنها غائبة (0) ، معتدلة (I) ، متوسطة () ، وحادة (II) للتغييرات ، 0 بالمائة ، أقل من 30 بالمائة و 30-50 بالمائة وأكثر من 50 بالمائة على التوالي [30]. تضمنت الآفات المتدرجة التنكس المائي والفجوي ، تسلل الخلايا الالتهابية ، النخر ، موت الخلايا المبرمج ، تكاثر خلايا كوبفر ، التغيرات الدهنية والتنكس الدهني ، احتقان الأوعية الدموية والجيوب الأنفية ، وتضخم البطانة الظهارية للقناة الصفراوية.

2.10. الكشف الكيميائي الهيستولوجي المناعي عن Caspase -3.

تم نقل عينات الكبد المضمنة بالبارافين إلى قسم علم الأمراض ، المعهد الوطني للسرطان ، لتقسيمها إلى أقسام بسمك 5um تم تركيبها على شرائح مشحونة موجبة (Fisher Scientific ، Pittsburgh ، PA). تمت معالجة تفاعل Caspase -3 وفقًا لطرق Galaly et al. [31] وأحمد وأحمد [32]. باختصار ، بعد استرجاع المستضد ، تم تحضين الجسم المضاد الأولي المخفف لـ caspase -3 (Santa Cruz Biotechnology ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع أقسام الكبد لمدة ساعة واحدة. تمت إضافة الجسم المضاد الثانوي المخفف بيولوجيًا (مجموعة داكو للخلايا) ، وتم الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة. بعد ذلك ، تم تطبيق بيروكسيداز الفجل المترافق مع الستربتافيدين (مجموعة داكو سيتوميشن) لمدة 15 دقيقة أخرى من الحضانة. تم تصور مجمع الجسم المضاد المرتبط من خلال تفاعل الركيزة 3،3'-diaminobenzidine (DAB) والمقاومة مع الهيماتوكسيلين. تم تحضين جميع أقسام الكبد تحت نفس الظروف وبنفس التخفيفات للأجسام المضادة وفي نفس الفترة ، لذلك كان التلقيح المناعي قابلاً للمقارنة بين مجموعات الدراسة المختلفة. لكل تحضير ، تم إجراء تحكم سلبي (شريحة بدون جسم مضاد أولي). تم تصور المقاطع تحت المجهر الضوئي ، وتم تقييم مدى الإيجابية المناعية للخلايا. تم التقاط صور لأجزاء من الكبد باستخدام كاميرا رقمية (Leica ، DM2500M Leica ، Wetzlar ، ألمانيا). تم إجراء فحص وتحليل الملصقات باستخدام إصدار البرنامج المجاني ImageJ (1.51d) [33]. تم استخدام برنامج ImageJ لقياس الكثافة المتكاملة (بالبكسل) للتفاعل الإيجابي لـ caspase -3.

2.11. تحليل احصائي.

Results were represented in tables and graphs as the mean±standarderror(SE). The data were analyzed by LSD analysis to discern the main effects and to compare various groups with each other using PC-STAT, University of Georgia(USA)[34]. Values of p>0. 05 تم اعتبار أنها مختلفة إحصائيًا بشكل غير معنوي ، بينما تم اعتبار قيم p<0.05 were="" significantly="" and="" highly="" significantly="">

3. النتائج

3.1. التأثير على معلمات المصل المتعلقة بوظيفة الكبد.

أدى الحقن اليومي للديكلوفيناك داخل الصفاق لمدة 4 أسابيع إلى حدوث ارتفاع كبير (ص<0.05)in serum="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" and="" ggt="" activities="" as="" well="" as="" serum="" total="" bilirubin="" level.="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" ani-mals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" decrease="" in="" these="" elevated="" levels.="" while="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" rats="" with="" naringin="" induced="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in the="" elevated="" serum="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels,="" it="" produced="" a="" nonsignificant="" effect="" (p="">0. 05) في نشاط ALT. أحدثت المعالجة التكميلية للحيوانات المحقونة بالديكلوفيناك مع هيسبيريدين تأثيرًا معنويًا (p<0.05)on the="" elevated="" alt,="" ast,="" ldh,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels="" while="" it="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" effect="" in="" serum="" alp=""><0.05). the="" cotreatment="" with="" naringin="" and="" hesperidin="" in="" combination="" successfully="" caused="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in all="" elevated="" parameters="" related="" to="" liver="" function="" including="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels.="" moreover,="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" appeared="" to="" be="" the="" most="" effective="" in="" improving="" the="" elevated="" ast,="" alp,="" and="" ggt="" activities(table="" 1).="" serum="" albumin="" level,="" on="" the="" other="" hand,="" exhibited="" a="" nonsignificant="" change="" (p="">0. 05) في كل المجموعات.

3.2.التأثير على نظام الدفاع ضد الإجهاد التأكسدي ومضادات الأكسدة.

أدى الحقن اليومي للديكلوفيناك داخل الصفاق لمدة 4 أسابيع إلى حدوث ارتفاع كبير (ص<0.05)in liver="" lpo="" and="" a="" significant=""><0.05) in="" liver="" gsh="" con-tent="" and="" gpx="" and="" sod="" activities.="" the="" treatment="" of="" diclofenac-injected="" animals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" significant=""><0.05)in liver="" lpo.="" narin-gin="" and="" its="" combination="" with="" hesperidin="" were="" more="" potent="" than="" hesperidin="" alone="" in="" decreasing="" the="" elevated="" liver="" lpo="" product.="" while="" the="" treatment="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" produced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gpx="" and="" sod="" activities,="" only="" naringin,="" and="" hesperidin="" in="" combination="" induced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gsh="" content="" (table="">

3.3 التأثير على تعبير الكبد p53 مرنا.

كما هو مبين في الشكل 2 ، زاد تعبير البروتين p53 mRNA بشكل ملحوظ (ص<0.05)in the="" liver="" of="" diclofenac-injected="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" the="" treatment="" with="" naringin,="" hesperidin,="" and="" their="" combination="" produced="" a="" significant=""><0.05)decrease in="" p53="" mrna="" expression="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control.="" there="" is="" no="" significant="" difference="" between="" the="" three="" treatments="" when="" compared="" with="" each="">

3.4. تأثير على مستويات مصل TNF- و IL -17 و -4. في الجدول 3 ، أدى الحقن اليومي داخل الصفاق من ديكلوفيناك لمدة 4 أسابيع إلى زيادة ملحوظة (p<0.05)in serum="" tnf-αand="" il-17="" levels="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" serum="" il-4="">

أدى العلاج التكميلي للفئران المحقونة بالديكلوفيناك بالنارينجين و / أو الهسبريدين إلى تحسن كبير (p<0.05)of altered="" serum="" tnf-a,="" il-17,="" and="" i-4="" levels.="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" both="" flavonoids="" was="" the="" most="" potent="" in="" increasing="" the="" lowered="" il-4level;="" the="" effect="" of="" the="" combination="" was="" more="" significantly="" potent=""><0.05)as compared="" with="" the="" effect="" of="" either="" naringin="" or="">

3.5 نتائج نسيج الكبد.

الشكل 3 يصور تأثير النارينجين و / أو الهسبريدين على التغيرات النسيجية للكبد للفئران المحقونة بالديكلوفيناك. يوضح الشكل 3 (أ) الكبد بالتركيب النسيجي الطبيعي للفصيص الكبدي. من ناحية أخرى ، أظهر كبد الفئران المحقونة بالديكلوفيناك تغيرات نسيجية ضارة ملحوظة مثل التنكس المائي لخلايا الكبد ، والخلايا الأبوطوزية ، وتسلل البوابة مع الخلايا أحادية النواة (الشكل 3 (ب)) بالإضافة إلى التجويف السيتوبلازمي للخلايا الكبدية والنخر الكبدي البؤري المرتبطة تسلل الخلايا الالتهابية البؤرية (الشكل 3 (ج)). تم تعديل هذه التعديلات إلى حد ما في الفئران المحقونة بالديكلوفيناك والتي عولجت بالنارينجين والتي تظهر التغيير الدهني الوحيد لخلايا الكبد المتفرقة (الشكل 3 (د)). أنتج علاج الجرذان المحقونة بالديكلوفيناك بهسبريدين تحسنًا في التغيرات النسيجية للكبد مقارنةً بالتحكم بالديكلوفيناك ولكن لا يزال يظهر تغيرًا دهنيًا في خلايا الكبد المتفرقة ، وتنشيطًا طفيفًا لخلايا كوبفر ، ووجود عدد قليل من خلايا موت الخلايا المبرمج (الشكل 3 (هـ)). وبالمثل ، فإن علاج الجرذان المحقونة بالديكلوفيناك بمزيج من النارينجين والهسبريدين أدى إلى تحسين التغيرات النسيجية للكبد مقارنة بالتحكم بالديكلوفيناك المحقون. ومع ذلك ، أظهر كبد الفئران المحقونة بالديكلوفيناك مع مزيج من كل من مركبات الفلافونويد تكاثرًا طفيفًا لخلايا كوبفر وتفريغًا طفيفًا في السيتوبلازم (الشكل 3 (و)). يبدو أن التأثير التوليفي للنارينجين والهسبريدين كان الأكثر فاعلية في تحسين البنية النسيجية للكبد.

تم تسجيل درجات التغير في الأنسجة المرضية لجميع المجموعات في الجدول 4. وأظهر قسم الكبد من السيطرة الطبيعية صفرًا من الدرجات لجميع الآفات النسيجية. أظهرت الفئران المحقونة بديكلوفيناك الكبد درجات مختلفة من درجات الآفة النسيجية تتراوح من الدرجة الثالثة إلى الدرجة 0. أدى إعطاء هسبريدين ونارينجين للفئران المحقونة بالديكلوفيناك إلى تحسينات ملحوظة في الآفات النسيجية بما في ذلك التنكس المائي والفجوي ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، والنخر ، والاستماتة ، وتكاثر خلايا كوبفر ، والتغيرات الدهنية ، والتنكس الدهني ، والاحتقان.

FcuRE 2: تأثير النارينجين والهسبريدين وتوليفتهما على تعبير p53 mRNA في كبد الجرذان التي تدار بالديكلوفيناك. الوسائل ، التي تشترك في رموز مختلفة ، تختلف اختلافًا كبيرًا في p<0.05. blood="" vessels="" and="" sinusoids,="" and="" hyperplasia="" of="" the="" epithelial="" lining="" of="" the="" bile="" duct;="" thereby,="" the="" liver="" exhibited="" lower="" grades="" of="" histopathological="" change="" scores="" in="" the="" diclofenac-injected="" groups="" treated="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control="" rats.="" the="" combinatory="" effect="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" was="" the="" most="" potent="" in="" decreasing="" the="" histopathological="" lesion="">

3.6 الفحص المناعي

يتم وصف أقسام الكبد الملطخة المناعية في الشكل 4 وتظهر نتائج تحليل الصور في الشكل 5.

كشفت الصور المجهرية في الشكل 4 والبيانات في الشكل 5 أن تعبير caspase -3 قد زاد بشكل كبير في الفئران المحقونة بالديكلوفيناك. أدى علاج الجرذان المحقونة بالديكلوفيناك بالنارينجين والهسبريدين ومزيجهما إلى انخفاض كبير في تعبير الكاسباس المرتفع -3 في الكبد. كان التأثير التجميعي للنارينجين والهسبريدين هو الأكثر فاعلية في خفض محتوى الكاسبيز المرتفع -3. أدى العلاج بالمجموعة إلى تسوية تعبير كاسباس الكبد -3.

تم استخلاص هذه المقالة من الطب التأكسدي وحجم طول العمر الخلوي 2021 ، معرف المقالة 9990091 ، 14 صفحة https://doi.org/10.1155/2021/9990091