NGF ينظم استقلاب الكوليسترول ويحفز إفراز ApoE في الخلايا الدبقية مما يمنح الحماية العصبية ضد الإجهاد التأكسدي الجزء 2

2.6. إفراز NGF بوساطة ApoE بواسطة U373 يحمي الخلايا العصبية من الأكسدة

تسلط الأدلة المتراكمة الضوء على أن ApoE يزيد من مرونة الخلايا العصبية في مواجهة الإهانات المؤكسدة، وبالتالي يمنع موت الخلايا المبرمج والتنكس العصبي [17،18،37]. في هذا السياق، قمنا بتقييم ما إذا كان إفراز ApoE الناجم عن NGF بواسطة خلايا U373 يمكن أن يحمي الخلايا العصبية N1E-115 من الإجهاد التأكسدي. تمت معالجة N1E -115 المتمايزة بالكامل مسبقًا بالروتينون، الذي يحفز الإجهاد التأكسدي عن طريق تثبيط مركب الميتوكوندريا I.

موت الخلايا المبرمج هو عملية تدمير ذاتي، وهو وسيلة مهمة للخلايا للحفاظ على توازن الجسم من خلال التدمير الذاتي المبرمج في ظل ظروف معينة. يلعب موت الخلايا المبرمج أدوارًا مختلفة في مراحل مختلفة من الحياة.

أظهرت الدراسات الحديثة أن هناك علاقة معينة بين موت الخلايا المبرمج والذاكرة. نحن نعلم بالفعل أن الذاكرة هي عملية عصبية معقدة في الدماغ، تتضمن اتصالات وتنسيقًا بين مناطق متعددة في الدماغ. قد يلعب موت الخلايا المبرمج دورًا في هذه العملية العصبية.

من ناحية، يمكن أن يؤدي موت الخلايا المبرمج إلى استقرار بنية شبكة الخلايا العصبية عن طريق إزالة الخلايا العصبية والمشابك العصبية غير الضرورية، مما يجعل اتصالات الخلايا العصبية أكثر دقة، وبالتالي تحسين جودة وكفاءة الذاكرة. من ناحية أخرى، قد يؤدي الإفراط في موت الخلايا المبرمج أيضًا إلى انخفاض عدد خلايا الدماغ، مما قد يؤثر سلبًا على تخزين الذكريات والتقاطها.

لذلك، مع الحفاظ على مستويات مناسبة من موت الخلايا المبرمج، يمكننا تحسين الذاكرة من خلال سلسلة من السلوكيات والمهارات، مثل القراءة والتعلم وممارسة الرياضة وضبط عقليتنا. يمكن لهذه السلوكيات والمهارات أن تعزز نمو واتصال خلايا الدماغ وتحسين جودة وكفاءة الذاكرة عن طريق تحفيز الاتصالات والتنسيق بين الخلايا العصبية في الدماغ.

في الختام، العلاقة بين موت الخلايا المبرمج والذاكرة معقدة. فقط مع الحفاظ على موت الخلايا المبرمج السليم يمكننا تحفيز أدمغتنا وتحسين ذاكرتنا من خلال مجموعة من السلوكيات والمهارات. ومن هذا المنطلق، نحن بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن أن يساعدنا Cistanche deserticola بشكل كبير على تحسين ذاكرتنا، لأن Cistanche deserticola يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو. هذه المواد مهمة للذاكرة. ومن المهم جدا للتعلم والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعمل اللحوم من اللحوم أيضًا على تحسين سيولة الدم وتعزيز نقل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على ما يكفي من العناصر الغذائية والطاقة، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.

انقر فوق معرفة المكملات الغذائية لتحسين الذاكرة

بعد 16 ساعة من التعرض للروتينون، تمت زراعة الخلايا العصبية N1E-115 في وسط جديد (Ctrl)، وسط مكيف من خلايا U373 (U373-Ctrl)، وسط مكيف من U373 تم معالجته مسبقًا بـ NGF لمدة 48 ساعة (U373-NGF)، أو وسيط مكيف من ApoE-silenced U373 تم معالجته مسبقًا بـ NGF لمدة 48 ساعة (U373-NGF ApoE siRNA). أدت المعالجة المسبقة بالروتينون إلى انخفاض كبير في عدد N1E-115 المزروع في وسط التحكم، مما يشير إلى أن استخدام هذا المبيد الحشري يؤثر بشدة على بقاء N1E-115 على قيد الحياة.

حددت السمية الخلوية للروتينون أيضًا تراجعًا شديدًا في الخلايا العصبية، كما لوحظ من خلال طول الخلايا العصبية. كان الضرر العصبي الناتج عن علاج الروتينون واضحًا بشكل خاص عند تقييم الخلايا الحاملة للعصبونات، حيث انخفض عدد N1E-115 مع الخلايا العصبية إلى 50%. تم الحصول على نتائج مماثلة عندما تم استزراع خلايا N1E-115 في وسط مشروط U373- Ctrl، مما يشير إلى أن وجود طاف مشتق من الخلايا النجمية غير المحفزة لا يكفي لحماية الخلايا العصبية من السمية بوساطة الروتينون. على المنسحقين، فإن تطبيق n من الوسط المكيف المشتق من U373 المعالج بـ NGF يمنع بشكل فعال موت الخلايا العصبية، بالإضافة إلى انخفاض الخلايا الحاملة للنوريت وطول النوريت الناجم عن إعطاء الروتينون (الشكل 5).

الأهم من ذلك هو أن الوسط المكيف المشتق من خلايا U373 الصامتة لـ ApoE فقد تمامًا التأثيرات المفيدة الناجمة عن d بواسطة الوسط المكيف U373- NGF، مما يشير إلى أن الحماية العصبية مدفوعة بإطلاق ApoE بوساطة NGF في وسط الثقافة. والجدير بالذكر أن الوسط المكيف من U373 المعالج بـ NGF والذي تم نقله بواسطة siRNA المخفوق احتفظ تمامًا بالتأثيرات الوقائية التي يمارسها U 373- NGF المتوسط ​​المكيف، مما يدل على أن فقدان الحماية العصبية الذي لوحظ في الوسط المكيف من الخلايا الصامتة ApoE يعتمد بشكل فعال على ApoE تقليل التنظيم (الشكل S3C).

الشكل 5. آثار المتوسطة U373 مكيفة على الإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية. صور تمثيلية في مجال مشرق وتقييم كمي لمورفولوجيا الخلايا العصبية لـ N1E -115. تمت معالجة الخلايا سابقًا (+) أو لا (-) باستخدام روتينون (0.1 ميكرومتر) لمدة 16 ساعة، ثم تم تربيتها في DMEM (Ctrl) جديد، في وسط مكيف مشتق من التحكم U373 (U{{ 9}}Ctrl)، وU373 NGF- المعالج مسبقًا (U373-NGF)، وU373- NGF المعالج مسبقًا والمسكت لـ apoE (U373-NGF ApoE siRNA) لمدة 48 ساعة. ن=5 تجارب مختلفة. تمثل البيانات وسائل ± SD. تم تقييم التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعًا باختبار توكي اللاحق. ** ع < 0.01، *** ع < 0.001.

لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها من المتوسطة مكيفة، أجرينا الثقافات المشتركة U373 / N1E115. للبدء، تمت معالجة خلايا U373 مسبقًا أم لا باستخدام NGF لمدة 48 ساعة. علاوة على ذلك، تمت معالجة خلايا N1E -115 المتمايزة مسبقًا أو لم يتم معالجتها بالروتينون لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، تم استبدال وسيط U373 بوسيط جديد يحتوي على 0.5% FBS، وتم نقل الأغطية المصنفة بـ N1E -115 إلى طبقة U373 لإعداد الثقافات المشتركة (الشكل 6A).

أثر الضرر التأكسدي الناجم عن علاج الروتينون بشكل كبير على الخلايا الحاملة للفايبيلينوريت وطول التحكم العصبي N1E -115 و N1E -115 الذي تمت زراعته مع الخلايا النجمية U 373- Ctrl (الشكل 6B). تمشيًا مع تجارب الوسط المكيف، تمت حماية خلايا N1E-115 المزروعة بشكل مشترك مع خلايا U373- NGF من الأضرار التأكسدية، في حين ألغى إسكات ApoE في U373 الحماية العصبية التي يدعمها NGF.

الشكل 6. يوفر إفراز ApoE بواسطة خلايا U373 المعالجة بـ NGF الحماية العصبية من الإجهاد التأكسدي. (أ) مخطط تمثيلي للثقافات المشتركة للخلايا العصبية النجمية التي تم إعدادها كما هو موضح في قسم المواد والأساليب. تم تقييم الخلايا الحاملة للعصب، وطول العصب، وعدد الخلايا بعد ساعات من إنشاء الثقافة المشتركة. (ب) صور تمثيلية في مجال مشرق وتقييم كمي لمورفولوجيا الخلايا العصبية لخلايا N1E -115، المعالجة مسبقًا (+) أو لا (-) مع روتينون (0.1 ميكرومتر) لمدة 16 ساعة.

تم بعد ذلك الاحتفاظ بـ N1E-115 في DMEM (Ctrl) جديد، أو تمت زراعته بشكل مشترك مع عنصر التحكم U373 (U373-Ctrl)، وU373 المعالج مسبقًا بـ NGF (U373-NGF)، و تم إسكات U373 المعالج مسبقًا بـ NGF لـ ApoE (U373- NGF ApoE siRNA) لمدة 48 ساعة. ن=5 تجارب مختلفة. تمثل البيانات وسائل ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعًا باختبار توكي اللاحق. * ع < 0.05، ** ع < 0.01، *** ع < 0.001.

3. المناقشة

ترتبط الاختلالات في مسارات إشارات التغذية العصبية، وكذلك التغيرات في استقلاب الكوليسترول في الدماغ، بقوة بالأمراض العصبية والتنكسية العصبية، مثل متلازمة ريت، وHD، ومرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD) [2،38،39] . في هذا السياق، يعد البحث الأساسي حول النشاط البيولوجي للبروتينات العصبية أمرًا محوريًا لتشريح الآليات الجزيئية التي تربط استقلاب الكوليسترول وعلم وظائف الأعضاء في الدماغ. خلال السنوات القليلة الماضية، أفادت دراسة مثيرة للاهتمام عن دور BDNF في تنظيم استقلاب الكوليسترول في الخلايا النجمية [38].

على الرغم من هذه الفكرة، لا توجد معلومات متاحة حول المشاركة المفترضة لـ NGF في تنظيم الكولسترول النجمي. لذلك، في هذا العمل، ركزنا على الدور المحتمل الذي يلعبه NGF في تنظيم استقلاب الكوليسترول، مع إشارة خاصة إلى تأثير إفراز ApoE على تمايز الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة. يحتفظ U373، وهو خط خلايا الورم النجمي المستخدم كنموذج تجريبي للخلايا النجمية البشرية، بالقدرة على الاستجابة الكاملة لـ NGF، لأنه يعبر عن مستويات ملحوظة من كل من TrkA وp75NTR.

أشارت النتائج الرئيسية إلى أن NGF ينظم مستويات البروتينات الرئيسية المشاركة في التخليق الحيوي للكوليسترول (HMGCR)، والاتجار داخل الخلايا (NPC1)، والإفراز (ABCA1). تصاحب هذه الأحداث زيادة متزامنة في ApoE ولين الكوليسترول في وسط الثقافة، مما يشير إلى أن NGF يزيد من تخليق الكوليسترول الحيوي وقذفه من الخلايا الدبقية. تم الإبلاغ عن أن NGF يحفز تعبير بروتين ApoE عن طريق زيادة نسخه [40]. ومع ذلك، لم نلاحظ أي تغيير كبير في التعبير ApoE داخل الخلايا. يمكن تفسير هذا التناقض الواضح نظرًا لأنه لا يمكن تقدير تراكم ApoE بسبب زيادة تدفقه من UIn المعالج بـ NGF
في محاولة لتشريح الآليات الجزيئية بشكل أفضل، تعاملنا مع U373 باستخدام LM11A -31 ووجدنا أن مُعدِّل p75NTR كان قادرًا فقط على محاكاة الارتفاع في تعبير HMGCR بوساطة NGF. إن مشاركة p75NTR في تعديل مستويات HMGCR يتوافق مع البيانات السابقة التي تم الحصول عليها في أنواع الخلايا الأخرى، مما يدل على أن هذا المستقبل يتحكم في نسخ الإنزيمات الكولسترولية [41]. ومع ذلك، لم يُحدث LM11A-31 أي تغييرات سواء في البروتينات الأخرى التي تم تحليلها في هذه الدراسة، بما في ذلك ABCA1، أو في مستويات الكوليسترول وApoE في وسط المزرعة، مما يشير إلى أن التعديل الانتقائي لـ p75NTR ليس كافيًا لتعزيز الكوليسترول. قذف من خلال جزيئات غنية بـ ApoE لوحظت في الخلايا المعالجة بـ NGF. تقودنا هذه النتائج إلى افتراض أن NGF يتحكم في استقلاب الكوليسترول في الخلايا الدبقية من خلال مشاركة مستقبلات p75NTR وTrkA.

من المعروف أن الارتباط العصبي بمستقبلات Trk ينشط ERK1/2، وبالتالي ينظم العديد من المسارات المشاركة في تمايز الخلايا وانتشارها وبقائها [2،38]. ومن المثير للاهتمام أنه لوحظ أن تنشيط ERK1/2 ينظم أيضًا تعبير ABCA1 وApoE في أنواع مختلفة من الخلايا [38،42،43]. تشير هذه النتائج، بالإضافة إلى الأدلة على أن محور BDNF/TrkB/ERK يعزز بثق ApoE وتعبير ABCA1 في الخلايا الدبقية [38]، إلى أن مسار نقل الإشارة الذي يتضمن محور TrkA/ERK قد يفسر جزءًا من التأثيرات التي تمارسها NGF. في دراستنا.

على الرغم من عدم ملاحظة أي تغييرات في نمو الخلايا العصبية، فإن استخدام الوسط المكيف U373- وإنشاء تجارب الثقافة المشتركة يشير إلى أن زيادة إفراز ApoE من الخلايا الدبقية بوساطة NGF يعد عاملًا محددًا لمنع النتائج الضارة الناجمة عن الأكسدة. الإجهاد في الخلايا العصبية. للحث على السمية الخلوية، استخدمنا روتينون، وهو مبيد حشري شائع الاستخدام في الأبحاث قبل السريرية للحث على أنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الميتوكوندريا (ROS) وموت الخلايا المبرمج اللاحق [44].

تسلط نتائجنا الضوء على أن NGF يحفز إفراز ApoE بواسطة الخلايا الدبقية، وهو أمر ضروري لضمان التأثيرات الوقائية للأعصاب ضد إعطاء الروتينون في خلايا N1E-115 المتمايزة. إن دور ApoE في الوقاية من الإجهاد التأكسدي موثق جيدًا. على سبيل المثال، يؤدي استنفاد ApoE في نماذج الفئران إلى تفاقم الإصابة التأكسدية في أنسجة المخ [45،46]. وبناءً على ذلك، فإن إعطاء ApoE خارجي المنشأ يحمي من الضرر التأكسدي الذي لا رجعة فيه الناتج عن معالجة بيروكسيد الهيدروجين عن طريق مقاومة سمية الغلوتامات الثانوية [18]. بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتينات الدهنية المحتوية على ApoE فعالة في تخفيف موت الخلايا المبرمج الناجم عن سحب الدعم الغذائي في الخلايا العصبية العقدية في شبكية العين [47].

في دراستنا، يشير استخدام الروتينون إلى أن الحماية العصبية بوساطة ApoE، والتي تروج لها الخلايا الدبقية المحفزة بـ NGF، قد تكون ذات صلة في سياق حالات التنكس العصبي مثل PD. والجدير بالذكر أن الروتينون يعيد إنتاج تنكس الخلايا العصبية الدوبامينية المشابه لذلك الذي لوحظ في PD، سواء في النماذج الحيوانية أو مزارع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية المشتقة من N1E -115- [48-50]. بشكل متماسك، تدعم نتائجنا الأدلة السابقة التي توضح أن ApoE يثير الحماية العصبية عند إعطاء 6- هيدروكسي دوبامين (6- OHDA)، وهو سم عصبي آخر قادر على تحفيز النمط الظاهري الشبيه بـ PD [51]. بشكل جماعي، توضح دراستنا أن NGF هو مُعدِّل مهم لاستقلاب الكوليسترول وقذف ApoE من الخلايا الدبقية. الأهم من ذلك هو أن تعزيز إفراز ApoE الذي يروج له هذا البروتين العصبي مطلوب لضمان الحماية العصبية ضد السمية الخلوية للروتينون.

BDNF هو البروتين العصبي الأكثر وفرة في الدماغ البالغ. على الرغم من هذه الأدلة، فقد ثبت أن NGF قد يلعب دورًا حاسمًا ليس فقط أثناء النمو ولكن أيضًا في الجهاز العصبي المركزي للبالغين. على سبيل المثال، يؤثر NGF على نشاط الحصين، ونتيجة لذلك، على الذاكرة المكانية والتعلم [52]. تشير النتائج الأخرى إلى أن NGF يظهر تأثيرًا وقائيًا عصبيًا على الخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية المخططية وأن هذا النشاط قد يضع الأساس لأساليب علاجية جديدة تعتمد على NGF لـ PD [53].

وفقًا لهذه الفكرة، فقد ثبت أن إنتاج NGF يتم تنظيمه بعمق في الخلايا النجمية خلال مرحلة البلوغ ويمارس إجراءات تعديلية على الالتهاب العصبي وإصابة الدماغ والتنكس العصبي [54-56]. في هذا السياق، سيكون من المثير للاهتمام تقييم، في الدراسات المستقبلية، ما إذا كان من الممكن التوسط في هذه التأثيرات، جزئيًا على الأقل، عن طريق تعديل الكوليسترول الدبقي الذي يروج له NGF. ويعرض العمل الحالي بعض القيود التي ينبغي التغلب عليها في التحقيقات التجريبية القادمة؛ على سبيل المثال، سيكون من المهم تشريح الآليات الجزيئية التي تربط علاج NGF واستقلاب الكوليسترول في الخلايا الدبقية بشكل أفضل.

إن الفهم الواسع مفيد لتحديد أهداف جزيئية محددة قابلة للتلاعب الدوائي والتي يمكن استخدامها في سياقات التنكس العصبي. علاوة على ذلك، على الرغم من استخدام خلايا U373 وN1E-115 على نطاق واسع كخطوط خلايا يمكن التحكم فيها لإعادة إنتاج السمات النجمية والعصبية على التوالي [27-29,57]، إلا أنه يجب تأكيد هذه النتائج بشكل أكبر في مزارع الخلايا الأولية. على الرغم من أنه ينبغي بذل المزيد من الجهود لتعزيز مشاركة إشارات التغذية العصبية في توازن الكوليسترول في الدماغ، فإن هذا العمل يوضح لأول مرة أن NGF قد يمارس بشكل غير مباشر الحماية العصبية عن طريق التأثير على استقلاب الكوليسترول الدبقي.

4. المواد والأساليب

4.1. زراعة الخلايا

تم استزراع خلايا الورم الأرومي العصبي N1E -115 وخلايا U373 بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في DMEM عند نسبة الجلوكوز المرتفعة (Merck Life Science، ميلانو، إيطاليا)، مع 10٪ (v / v) من مصل الأبقار الجنيني (FBS) (Merck Life Science ، ميلانو، إيطاليا)، وأضيف بمحلول البنسلين/الستربتوميسين.

للحث على تمايز الخلايا العصبية، تم زرع خلايا N1E -115 عند التقاء 3 0٪ وتم تحويلها إلى DMEM مع 0.5٪ FBS لمدة 96 ساعة.

للحث على تمايز الخلايا العصبية، تم زرع خلايا N1E -115 عند التقاء 3 0٪ وتم تحويلها إلى DMEM مع 0.5٪ FBS لمدة 96 ساعة.

تم إعداد الثقافات المشتركة للخلايا النجمية والخلايا العصبية وفقًا للبروتوكول الذي وصفه إيوانو وزملاؤه، مع بعض التعديلات [59]. تم الضغط على الفواصل البارافين على ساترة لضمان الالتزام؛ استخدمنا الفواصل على ساترة الخلايا العصبية لمنع الضرر الميكانيكي بكفاءة عندما يتم وضع الخلايا في مواجهة بعضها البعض. تم بعد ذلك تعقيم Coverslips في الإيثانول ومغلفة بـ poly-D-lysine (Merck Life Science، Milan، Italy). تم زرع بذور N1E -115 على ساترة المغلفة بالكثافة المطلوبة، وبمجرد أن تصبح جاهزة للثقافة المشتركة، تم استخدام ملقط معقم لرفع ساترة مع الخلايا العصبية N1E -115 ووضعها وجهًا للأسفل في {{ {10}}آبار مزروعة بالخلايا النجمية U373.

تم إجراء المعالجات المسبقة على خلايا N1E -115 عن طريق إعطاء 0.1 ميكرومتر من الروتينون (Sigma-Aldrich، Milan، Italy، R8875) لمدة 16 ساعة. تلقت خلايا التحكم DMSO (التخفيف 1:1000 في وسط زراعة الخلايا) كوسيلة. تمت معالجة خلايا U373 باستخدام NGF (Alomone Labs، القدس، إسرائيل، N -245) بجرعة 100 نانوغرام / مل لمدة 48 ساعة في جميع التجارب.

4.2. إعداد المحللة وتحليل لطخة غربية

تم صوتنة خلايا U373 (دورة العمل 20%، الإخراج 3) في المخزن المؤقت للعينة (0.1Tris-HClisHCl الذي يحتوي على 10% SDS، كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني، درجة الحموضة 6.8) للحصول على محلول إجمالي، كما هو موضح سابقًا [ 60،61]. تمت إضافة محلول Laemmli وتم تغيير طبيعة العينات عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم حل مستخلصات البروتين (عشرون ميكروغرامًا من البروتينات) على SDS-PAGE، وتم إجراء النقل إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام نظام نقل توربو عبر اللطخة (Biorad Laboratories، Milan، Italy)، كما ورد سابقًا [62].

بعد ذلك، تم تحضين الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع 5٪ حليب جاف خالي من الدهون في محلول ملحي تريس (25 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك، 138 ملي مول كلوريد الصوديوم، 27 ملي مول كلوريد كلوريد، 0.05% توين{ {10}}، درجة الحموضة 6.8) وتم فحصها طوال الليل عند 4 ◦ مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc-271708، التخفيف 1:500)، anti- TrkA (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، sc-118، التخفيف 1:500)، مضاد SREBP -1 (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، sc-8984 ، التخفيف 1:1000)، مضاد SREBP -2 (أبكام، كامبريدج، المملكة المتحدة، ab30682، التخفيف 1:1 000)، مضاد HMGCR (أبكام، كامبريدج، المملكة المتحدة، ab242315، التخفيف 1:1000)، مضاد LDLr (Abcam، Cambridge، UK، ab30532، تخفيف 1:500)، مضاد NPC1 (Novus Biologicals، Centennial، CO، USA، NB400-148، تخفيف 1:3000) ) ، antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc-58219، التخفيف 1:400)، anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc-53570، التخفيف 1 :400)، مضاد الفينكولين (سيجما ألدريتش، ميلانو، إيطاليا، V9264، التخفيف 1:10,000)، ومضاد- -الأكتين (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، SC-47778، التخفيف 1 :10,000).

تم تحضين الأغشية على التوالي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر أو الأرانب المرتبطة بـ HRP (مختبرات Bio-Rad ، ميلانو ، إيطاليا). تم تصور الأجسام المضادة المرتبطة بالبروتين من خلال النشاف ECL الغربي الواضح (Bio-Rad Laboratories، ميلانو، إيطاليا، # 1705061)، وتم تسجيل اللمعان الكيميائي من خلال نظام ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories، ميلانو، إيطاليا). تم بعد ذلك إجراء تحليل قياس الكثافة المشتق من اللطخات الغربية باستخدام برنامج ImageJ الإصدار 1.52t (المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) لنظام التشغيل Windows. تم استخدام الفينكولين أو الأكتين كبروتينات للتدبير المنزلي، والتي كانت بمثابة ضوابط داخلية لتحميل البروتين. تم الحصول على حسابات قياس الكثافة كوحدات عشوائية، مستمدة من النسبة بين شدة نطاق البروتين وبروتين التدبير المنزلي المعني.

4.3. زيت أحمر يا تلطيخ

تم زرع خلايا U373 على poly-L-lysine (Sigma-Aldrich، P6282-5 MG) المغلفة بألواح جيدة 6-، وتم إجراء تلطيخ الزيت الأحمر O كما ورد سابقًا [60]. باختصار، تم إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (محلول 4٪) لمدة 10 دقائق وشطفها بلطف ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تحضين الخلايا الثابتة بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق ثم غسلها بالماء المقطر. بعد ذلك، تم فحص الخلايا باستخدام 1 مل من محلول العمل Oil Red O (Sigma-Aldrich، O1391-250ML) لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع لوحة البئر 6- على شاكر دوار مداري. بعد الحضانة بمحلول التلوين، تم غسل الآبار ثلاث مرات بالماء المقطر لإزالة البقع الزائدة.

تم تركيب Coverslips أخيرًا باستخدام وسط تركيب Fluoroshield (Sigma-Aldrich، F6182)، وتم تصور التألق الذاتي للزيت الأحمر O عبر الفحص المجهري متحد البؤر (TCS SP8؛ Leica، Wetzlar، ألمانيا). تم التقاط الصور باستخدام Leica TCS SP8 المجهز بتكبير 63 × وبرنامج Leica LAS X (ميلان، إيطاليا). تم إجراء القياس الكمي لتلطيخ O الزيت الأحمر من خلال برنامج ImageJ لنظام التشغيل Windows وتم حسابه ككثافة مضان متوسطة لكل مساحة خلية.
4.4. صباغة فلبينية

تم إجراء تلطيخ فلبيني باستخدام مجمع فلبيني (Sigma-Aldrich، F9765). يتم تحضير محلول المخزون الفلبيني (1 0 ملغم / مل في برنامج تلفزيوني) دائمًا قبل الاستخدام مباشرة. تم إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (محلول 4٪) لمدة 10 دقائق وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني. تم بعد ذلك صبغ U373 بمحلول عمل فلبيني 1 مل (0.05 مجم/مل في برنامج تلفزيوني) لمدة ساعة واحدة في الظلام، عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، وتم تركيب الأغطية باستخدام وسط تركيب Fluoroshield وتم تحليلها على الفور من خلال الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام مجموعة مرشح الأشعة فوق البنفسجية (340-380 نانومتر الإثارة). تم الحصول على الصور بتكبير 40X. تم حساب القياس الكمي الفلبيني على أنه متوسط ​​كثافة التألق لكل مساحة خلية باستخدام برنامج ImageJ لنظام التشغيل Windows.

4.5. قياس نسبة الكولسترول

تم إجراء تقدير كمية الكوليسترول باستخدام مقايسة اللونية (Cholesterol Quantitation Kit، MAK043، Sigma-Aldrich، Milan، Italy) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

4.6. إليسا
تم تقييم مستويات ApoE في وسط الاستزراع باستخدام مجموعة Human Apolipoprotein E ELISA (Abcam، Cambridge، UK، ab108813)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

4.7. التألق المناعي

تم تنفيذ التألق المناعي للخلايا U373 كما هو موضح سابقًا [60]. تم إصلاح U373 في بارافورمالدهيد (4٪ في PBS) وتم فحصه طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة الأولية: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc-271708، التخفيف 1:100)، وanti-TrkA ( سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، SC-118، التخفيف 1:100). بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific، Waltham، MA، USA، A28180) ومع الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرنب Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific، Waltham، MA، USA) ، A27034). تم إجراء تلطيخ DAPI لتصور النوى، وتم تركيب الأغطية أخيرًا باستخدام وسط تصاعد Fluoroshield. وقد تم تحليل العينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، كما هو موضح أعلاه.

4.8. إسكات ApoE

تم إجراء إسكات ApoE mRNA على خلايا U373 باستخدام ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc-29708) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إعداد الترنسفكأيشن في 6- لوحة زراعة أنسجة البئر حيث تم زرع 100،000 خلية لكل بئر في وسط نمو خالٍ من المضادات الحيوية DMEM مكمل بـ 10٪ من FBS لمدة 24 ساعة. لكل بئر ، تمت إضافة siRNA Transfection Medium (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، USA، sc -36868) ​​إلى محلول siRNA Transfection Reaction، الذي تم إعداده باستخدام siRNA duplex و siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz Biotechnology، Dallas، TX، الولايات المتحدة الأمريكية، sc29528). تم بعد ذلك غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام siRNA Transfection Medium ومغطاة بخليط ترنسفكأيشن المصنوع مسبقًا. بعد ذلك، تم تحضين طبق الاستزراع لمدة 7 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة 5% CO2.

تمت إضافة وسط نمو DMEM مع 20% من FBS والمضادات الحيوية (2- أضعاف التركيز الطبيعي) إلى خليط ترنسفكأيشن في كل بئر بنسبة 1:1. تم تحضين الخلايا لمدة 18 ساعة، ثم تم تفريغ الوسط واستبداله بوسيط نمو طبيعي جديد؛ بعد 24 ساعة من هذه الخطوة الأخيرة، كانت الخلايا جاهزة للاستخدام لإجراء المزيد من التجارب. تم تقييم كفاءة إسكات ApoE بواسطة RT-qPCR في خلايا U373 وبواسطة ELISA في طاف الخلية؛ منع ApoE siRNA بكفاءة تحريض ApoE بواسطة NGF إذا ما قورن بسيرنا التدافع (ApoE mRNA: انخفاض بنسبة 83٪؛ ApoE ELISA: انخفاض بنسبة 78٪). والجدير بالذكر أن تعبير ApoE عند إسكات siRNA كان أقل من مستويات التعبير القاعدي التي لوحظت في التحكم U373 (ApoE mRNA: انخفاض بنسبة 72٪؛ ApoE ELISA: انخفاض بنسبة 58٪) (الشكل S 3A، B).

4.9. استخراج الحمض النووي الريبي وPCR في الوقت الحقيقي

تم إجراء تحليل مرنا كما ورد سابقا [22،63]. باختصار، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من خلايا U373 باستخدام TRI Reagent (Merck Life Science، ميلانو، إيطاليا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء علاج DNAse (Ambion، Thermo Fisher Scientific، Milan، Italy) ثم تمت تنقية RNA باستخدام مجموعة تنظيف RNA (Zymo، إيطاليا). تم نسخ RNA على التوالي إلى [كدنا] من خلال مجموعة خلايا النسخ العكسي عالية السعة [كدنا] (النظام الحيوي التطبيقي ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) واستخدمت لتحليل qPCR.

الاشعال المستخدمة في qRT-PCR لـ apoE هي: الأمام 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 والعكس 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0 . الاشعال المستخدمة في qRT-PCR لـ Gapdh (تم اختيارها كجينات مرجعية) هي: الأمام 50 - GTCTCCCTTGACTTCAACAGCG-30 والعكس 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. تم تقييم إنتاج الأمبليكون الصحيح من خلال تقييم منحنى الانصهار. تم تشغيل كل عينة بيولوجية في ثلاث نسخ باستخدام كاشف SYBR Green IQ (مختبرات Bio-Rad، ميلانو، إيطاليا) وباستخدام نظام الكشف CFX Connect (مختبرات Bio-Rad، ميلانو، إيطاليا).

4.10. التقييم الكمي لمورفولوجيا الخلايا العصبية

تم تقدير مورفولوجيا الخلايا العصبية في خلايا N1E -115 من خلال التقاط الصور باستخدام المجهر المقلوب. تم إجراء التحليل المورفومتري من خلال برنامج ImageJ لنظام التشغيل Windows، وتم تقدير عدد الخلايا الإجمالية (معبراً عنها كنسبة مئوية من التباين في عنصر التحكم)، ومتوسط ​​طول العصب (معبراً عنه كنسبة مئوية من عنصر التحكم)، والخلايا الحاملة للعصب. بالنسبة للخلايا الحاملة للنوريت، تم حساب النسبة المئوية عن طريق قسمة عدد الخلايا المتمايزة على العدد الإجمالي للخلايا لكل حقل. تم تمييز N1E-115 من الديفاس عندما كان لديهم على الأقل خلية عصبية واحدة بطول يساوي أو أكبر من قطر السوما. تم إجراء التقييم المورفولوجي على خمس تجارب مستقلة على الأقل، حيث تم تحليل ثلاث صور على الأقل.

4.11. تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع النتائج المقدمة في هذه الدراسة على أنها متوسط ​​± SD (تم فحص التوزيع الطبيعي للانحراف المعياري للبيانات باستخدام اختبار شابيرو ويلك. عندما تمت مقارنة مجموعتين تجريبيتين، تم تطبيق اختبارات غير مقترنة. ومع ذلك، عند ثلاث مجموعات أو أكثر تمت مقارنتها، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار توكي اللاحق. وفيما يتعلق بالتجارب مع الروتينون، حيث كان هناك متغيران، تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار Bonferroni اللاحق. تم اعتبار p <0.05 مختلفة إحصائيًا. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism 5 (GraphPad، La Jolla، CA، USA) لنظام التشغيل Windows.

الكاتب الاشتراكات:

التصور، MS؛ المنهجية، MS وMC؛ التحقق من الصحة، MS وMC؛ التحليل الرسمي، MS، MC، DP، وMP؛ التحقيق، MC، NM، LL، MP، وDP؛ الموارد، MS ونائب الرئيس؛ تنظيم البيانات، MS وMC؛ الكتابة - إعداد المسودة الأصلية، MS وMC؛ الكتابة - المراجعة والتحرير، MP، LL، DP، NM و VP؛ التصور، MS، MC، وMP؛ الإشراف، مرض التصلب العصبي المتعدد؛ إدارة المشاريع، ماجستير؛ الحصول على التمويل، MS لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل:

تم تمويل هذا البحث من قبل صناديق أبحاث الأقسام 2021 (جامعة موليز) لمرض التصلب العصبي المتعدد، ومن خلال دعوة مؤسسة جيروم ليجون لجلسة المنح 2021أ، رقم 2043 لمرض التصلب العصبي المتعدد

بيان مجلس المراجعة المؤسسية:

غير قابل للتطبيق.

بيان الموافقة المستنيرة:

غير قابل للتطبيق.

بيان توفر البيانات:

غير قابل للتطبيق.

شكر وتقدير:

نشكر كلوديا تونيني للمساعدة في فحص الكولسترول

تضارب المصالح:

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

مراجع

1. بيوركيم، أنا؛ ميني ، س. فوغلمان، AM Brain Cholesterol: حياة سرية طويلة خلف حاجز. تصلب الشرايين. تخثر. فاسك. بيول. 2004، 24، 806-815. [CrossRef] [مجلات]

2. كولاردو، م.؛ مارتيلا، ن.؛ بينسابين، د.؛ سيتيني، س.؛ دي بارتولوميو، س.؛ بالوتيني، V.؛ Segatto، M. Neurotropins كمنظمين رئيسيين لاستقلاب الخلايا: الآثار المترتبة على توازن الكوليسترول. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2021، 22، 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. جوريتز، سي. ماوخ، د. Pfrieger، FW تتوسط الآليات المتعددة في تكوين التشابك الناجم عن الكوليسترول في الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي. مول. خلية. علم الأعصاب. 2005، 29، 190-201. [CrossRef] [مجلات]

4. Pfenninger، KH توسع غشاء البلازما: مهمة الخلايا العصبية الشاقة. نات. القس نيوروسكي. 2009، 10، 251-261. [المرجع المتقاطع]

5. تاكاموري، س. هولت، م. ستينيوس، ك.؛ ليمكي، EA؛ جرونبورج، م.؛ ريدل، د.؛ أورلوب، ه.؛ شينك، S .؛ بروجر، ب. رينجلر، ب. وآخرون. التشريح الجزيئي لعضية الاتجار. خلية 2006، 127، 831-846. [CrossRef] [مجلات]

6. سوزوكي، إس. كيوسو، ك.؛ حزامة، س.؛ أوجورا، أ.؛ كاشيهارا، م.؛ هارا، ت.؛ كوشيميزو، ه.؛ Kojima، M. عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ ينظم استقلاب الكوليسترول لتطوير المشبك. جيه نيوروسي. 2007، 27، 6417-6427. [المرجع المتقاطع]

7. سيجاتو، م. ليبوفي، L.؛ تراباني، L.؛ Pallottini، V. فشل توازن الكوليسترول في الدماغ: الآثار المترتبة على الخلل التشابكي والتدهور المعرفي. العملة. ميد. الكيمياء. 2014، 21، 2788-2802. [CrossRef] [مجلات]

8. جيسكي، دي جي؛ Dietschy، JM تنظيم معدلات تخليق الكوليسترول في الجسم الحي في الكبد وجثة الفئران المقاسة باستخدام [3H] ماء. J. الدهون الدقة. 1980، 21، 364-376. [المرجع المتقاطع]

9. بفريجر، مهاجم؛ Ungerer، N. استقلاب الكوليسترول في الخلايا العصبية والخلايا النجمية. بروغ. الدقة الدهون. 2011، 50، 357-371. [المرجع المتقاطع]

10. نيويغ، ك.؛ شالر، ه.؛ Pfrieger، FW اختلافات ملحوظة في تخليق الكوليسترول بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الفئران بعد الولادة. جي نيوروكيم. 2009، 109، 125-134. [المرجع المتقاطع]

11. أورام، ج.ف. Heinecke، JW ATP- ملزمة كاسيت الناقل A1: مصدر الكولسترول في الخلية الذي يحمي من أمراض القلب والأوعية الدموية. فيزيول. القس 2005، 85، 1343-1372. [المرجع المتقاطع]

12. Pfrieger، FW الاستعانة بمصادر خارجية في الدماغ: هل تعتمد الخلايا العصبية على توصيل الكولسترول عن طريق الخلايا النجمية؟ BioEssays 2003، 25، 72-78. [المرجع المتقاطع]

13. كريستوفرسون، كانساس؛ أوليان، م. ستوكس، التقييم القطري المشترك؛ مولوني، CE؛ الجحيم، جي دبليو؛ آغا، أ. لولر، J.؛ موشر، مدافع؛ بورنشتاين، ص. Barres، BA Thrombospondins هي بروتينات تفرز الخلايا النجمية والتي تعزز تكوين التشابك العصبي المركزي. خلية 2005، 120، 421-433. [المرجع المتقاطع]

For more information:1950477648nn@gmail.com