فيروس نيوكاسل المأشوب الجديد القائم على فيروس في لقاحات Ovo تجاوز مناعة الأمهات لتوفير الحماية الكاملة من التحدي الخبيث المبكر الجزء 1

خلاصة:

يعد مرض نيوكاسل (ND) أحد أهم أمراض الدواجن اقتصاديًا. على الرغم من الجهود المكثفة في برامج التطعيم الحالية ، لا يزال هذا المرض يحدث في جميع أنحاء العالم ، مما يتسبب في نفوق كبير حتى في القطعان المحصنة. يُعزى ذلك جزئيًا إلى وجود فجوة في المناعة خلال فترة ما بعد الفقس بسبب وجود الأجسام المضادة للأم التي تؤثر سلبًا على تكرار اللقاحات الحية الشائعة الاستخدام. لقاحات البويضات مزايا متعددة وتوفر فرصة لمعالجة هذه المشكلة.

تستخدم حاليًا في لقاحات البويضات ND لقاحات فيروس الهربس المأشوب للديك الرومي (HVT) التي تعبر عن مستضدات فيروس مرض نيوكاسل (NDV). على الرغم من إثبات فعاليتها ، إلا أن هذه اللقاحات لها بعض القيود ، مثل تأخر المناعة وعدم القدرة على إعطاء لقاح HVT ثانٍ بعد الفقس. استخدام لقاحات ND الحية للتلقيح في البويضات غير قابل للتطبيق حاليًا ، لأنها مرتبطة بارتفاع معدل وفيات الأجنة. في هذه الدراسة ، تم إعطاء اللقاحات التجريبية الموجهة لـ NDV المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل مضاد للحساسية من إنترلوكين الطيور 4 (IL4R) وعمودها الفقري في البويضات بجرعات مختلفة في 18- بيض تجاري عمره يوم يحتوي على نسبة عالية من التتر من الأجسام المضادة للأم. تم تحدي الطيور التي تم فقسها باستخدام NDV الخبيث في عمر أسبوعين. تم تقييم إفراز لقاح ما بعد الفقس ، والبقاء على قيد الحياة بعد التحدي ، وتحدي سفك الفيروس ، والاستجابات المناعية الخلطية في نقاط زمنية متعددة. أدت الطيور المحصنة على NDV المؤتلف (rNDV) إلى خفض معدل الوفيات بعد الفقس بشكل ملحوظ مقارنة بلقاح LaSota من النوع البري.

كانت جميع لقاحات rNDV قادرة على اختراق مناعة الأم والحث على استجابة مناعية خلطية قوية مبكرة. علاوة على ذلك ، فإن لقاحات rNDV محمية من الأمراض السريرية وتقلل بشكل كبير من إفراز الفيروس بعد تحدي NDV الخبيث المبكر بعد أسبوعين من الفقس. ظلت عيارات الجسم المضاد لتثبيط التراص الدموي بعد التحدي في المجموعات الملقحة قابلة للمقارنة مع التتر قبل التحدي ، مما يشير إلى قدرة اللقاحات المدروسة على منع التكرار الفعال لفيروس التحدي. كان البقاء على قيد الحياة بعد الفقس بعد التطعيم بلقاحات rNDV-IL4R يعتمد على الجرعة ، مع زيادة البقاء على قيد الحياة مع انخفاض الجرعة. يشير هذا التحسن في البقاء على قيد الحياة وبيانات الاعتماد على الجرعة إلى أن اللقاحات الجديدة الموهنة في اللقاحات القائمة على ovo rNDV والتي يمكن أن تخترق مناعة الأمهات لاستنباط استجابة مناعية قوية في وقت مبكر بعد 14 يومًا من الفقس ، مما يؤدي إلى حماية عالية أو كاملة من التحدي الضاري ، كما هو موضح. الوعد كمساهم في السيطرة على مرض نيوكاسل.

بالإضافة إلى التطعيم البشري ، يمكن للناس أيضًا تناول الطعام والمكملات الغذائية. يحتوي الكستانش على مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية ، مثل السكريات ، والستيرويدات ، والقلويدات ، والفلافونويدات ، وما إلى ذلك ، ولهذه المواد دور مهم في تنظيم جهاز المناعة. من بينها ، يمكن أن تعزز السكريات تنشيط وانتشار الخلايا المناعية وزيادة مناعة الجسم ؛ الستيرويدات يمكن أن تنظم وظيفة الخلايا المناعية وتعزز الاستجابة المناعية ؛ قلويدات وفلافونويدات يمكن أن تقاوم الأكسدة ومضادات الالتهابات ومضادات الجراثيم وتقوي المناعة بشكل أكبر. لذلك ، فإن Cistanche له تأثير كبير في تنظيم المناعة ويمكن استخدامه كغذاء صحي ودواء لتحسين المناعة.

انقر فوق الفوائد الصحية من cistanche

1 المقدمة

مرض نيوكاسل (ND) ، وهو مرض مدمر يصيب الدواجن يمكن أن يصل معدل وفيات الطيور الساذجة إلى 100٪ ، سببه سلالات خبيثة من فيروس مرض نيوكاسل (NDV) [1]. هذه الأنواع من الفيروسات التي أعيدت تسميتها مؤخرًا بفيروس orthoavulavirus 1 ، هي عضو في عائلة Paramyxoviridae [2،3]. تحتوي فيروسات مرض نيوكاسل على ترميز جينوم RNA أحادي السلسلة وغير مجزأ وسلبي الاتجاه لستة بروتينات هيكلية على الأقل (30 - بروتين نووي [NP] - بروتين فوسفوري [P] - بروتين مصفوفة [M] - بروتين اندماج [F] - هيماجلوتينين - نورامينيداز [HN] - وبوليميراز RNA كبير [L] - 50) ويتألف من واحد من ثلاثة أحجام للجينوم (15،186 ، 15،192 ، 15،198 نيوكليوتيد) [4،5]. يعتبر مرض نيوكاسل ثالث أهم أمراض الدواجن على مستوى العالم [6] ولا يزال مستوطنًا في العديد من البلدان في جميع أنحاء آسيا وأفريقيا والأمريكتين [7].

تشمل السيطرة على ND الأمن البيولوجي الصارم لمنع إدخال NDV الضار (vNDV) في مزارع الدواجن [8،9] والإدارة السليمة للقاحات [10]. ومع ذلك ، فإن فاشيات ND المتعددة التي تحدث في جميع أنحاء العالم [11] توحي بأن اللقاحات وإجراءات التطعيم الحالية ليست فعالة بشكل كامل. بالإضافة إلى اللقاحات التقليدية الحية والمعطلة ، تم استكشاف مفاهيم متعددة للتلقيح ND في العقدين الماضيين ، بما في ذلك اللقاحات الموجهة ، ومركب الأجسام المضادة ، والجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، ولقاحات لجند مستقبلات شبيهة بالحصيلة ، من بين أمور أخرى [1 ، 8،9]. تم اقتراح العديد من لقاحات الطيور ، المصممة خصيصًا للمشاركة في التعبير عن السيتوكينات المناعية ، لتحسين المناعة الوقائية [12]. هناك طريقة أخرى تم استكشافها وهي استخدام اللقاحات المتطابقة مع المستضدات. على الرغم من اعتبار جميع NDVs كأعضاء في نمط مصلي واحد [3،13] ، هناك تباين مستضدي بين السلالات [14]. أظهرت الدراسات السابقة التي أجريت على الدجاج من مختلف الأعمار أن الدجاج الملقح بسلالات مطابقة مستضديًا لفيروس التحدي يلقي بكمية أقل بكثير من التحدي VNDV من الكمية التي يفرزها الدجاج الملقح بلقاحات غير متجانسة [15-17]. من الجدير بالملاحظة أن الأجسام المضادة الأم المضادة لـ NDV المنقولة بشكل سلبي ، على الرغم من حماية الدجاج خلال الأسابيع الأولى الحاسمة من الحياة ، تتداخل مع تطور مناعة المضيف بعد التطعيم [18].

التطعيم في البيض هو نهج يوفر مزايا متعددة - على سبيل المثال ، خفض التكلفة بشكل كبير ، والتوحيد القياسي ، وتطبيق اللقاح الشامل ، والتلقيح الآلي في المفرخ ، والتوصيل المنتظم للقاح في كل بيضة ، وعدم وجود إجهاد للطيور [19-21] - وهي طريقة تحصين جذابة لصناعة الدواجن [22]. يتم حاليًا تلقيح ما بين 80 بالمائة و 90 بالمائة من دجاج التسمين المزروع في الولايات المتحدة بالبيض قبل يومين إلى ثلاثة أيام من الفقس [23،24] ، وتسمح أتمتة العملية لما يصل إلى 70 ، 000 بيضة يتم تطعيمهم بالساعة [23].

على الصعيد العالمي ، يتم استخدام طريقة إعطاء اللقاح هذه في 26 من أصل 30 دولة رائدة في إنتاج الدواجن في العالم [23]. يتوفر حاليًا عدد قليل من لقاحات ND ضد ND ، ولكن يتم إنتاجها جميعًا باستخدام ناقلات غير NDV. لقد ثبت أن اللقاحات القائمة على ناقلات فيروس Fowlpox (FPV) التي تعبر عن بروتينات NDV F و HN المطبقة في البويضات تحمي الدواجن من تحدي VNDV [25،26].

ومع ذلك ، لا يتم استخدام لقاحات FPV-ND المؤتلفة على نطاق واسع بسبب التداخل المناعي من لقاحات FPV أو حالات التعرض السابقة (FPV موجود بشكل شائع في البيئة) ونقص التحسين للتطبيق من خلال الطرق الجماعية [9]. أكثر النواقل استخدامًا على نطاق واسع ل ND المؤتلف في إنتاج لقاح البيض هو Meleagrid alphaherpesvirus 1 ، المعروف باسم herpesvirus of turkeys (HVT) أو النمط المصلي 3 Marek's disease [12،23]. في الولايات المتحدة وحدها ، تم إنتاج 8.2 مليار جرعة من لقاحات HVT المؤتلف (rHVT) - ND في عام 2018 مقارنة بـ 3.6 مليار جرعة من لقاحات ND التقليدية [27].

بالإضافة إلى ميزة استخدامها في البويضات ، فإن لقاحات rHVT التي تعبر عن بروتينات NDV تنتج مناعة قوية وطويلة الأمد بعد تطبيق واحد [28]. علاوة على ذلك ، فإنها تتأثر بشكل عابر بوجود الأجسام المضادة المشتقة من الأم المضادة لـ NDV [8]. ومع ذلك ، فإن لقاحات rHVT-ND لها بعض القيود ، مثل تأخر المناعة ، ويبدو أن لقاح HVT سابقًا مقاومًا لاستخدام لقاحات HVT المعززة في نفس الطيور [9،29]. لقاحات HV مرتبطة بالخلايا ويجب تخزينها ونقلها في نيتروجين سائل ، وهو ما يعد قيدًا على استخدامها في العديد من البلدان.

آفاق لقاحات جديدة في البويضات آخذ في الازدياد [23]. تم استكشاف نواقل مختلفة لطريق الإعطاء داخل البويضات ، وتم الإبلاغ عن نتائج واعدة مع لقاحات الفيروس الغدي البشري غير المتكاثر [30] واللقاحات الموجهة لفيروس ألفا [31]. على الرغم من عدم وجود تطورات في الاستخدام التجاري الروتيني ، فقد بُذلت جهود أيضًا لتطوير لقاحات جديدة في لقاحات موجهة للبيض لا تحتوي على HVT NDV [32-35]. يعد استخدام لقاحات ND الحية في البويضات تحديًا. في حين أن لقاحات ND الحية ، مثل LaSota و B1 و Clone 30 و Ulster ، على سبيل المثال لا الحصر ، تمنح استجابة مناعية قوية وتستخدم بشكل شائع لتحصين الدجاج الذي لا يتجاوز عمره يومًا واحدًا ، إلا أنها ترتبط بارتفاع معدل وفيات الأجنة عندما تدار في 18 يومًا من الأمة الجنينية. تم الإبلاغ عن معدل وفيات يصل إلى 100 في المائة باستخدام فيروسات منخفضة الضراوة من النوع البري و 80 في المائة باستخدام فيروسات حية موهنة وراثيًا بعد استخدام البيض ، ولا يتم حاليًا استخدام لقاحات ND حية لهذه الطريقة في إعطاء اللقاح [36،37] .

تم مؤخرًا إثبات أن لقاحًا تجريبيًا متجددًا جديدًا NDV (rNDV) يحتوي على مادة إنترلوكين الطيور 4 المضادة للحساسية (IL4) ، المسمى ZJ1 * l-IL4R ، كان واعدًا في لقاح البويضات بعد التقييم في خالٍ من مسببات الأمراض (SPF). ) بيض الدجاج المُضغي (ECE) [38]. هدفت هذه الدراسة إلى إجراء مزيد من التقييم لإمكانية تطبيق هذا اللقاح الموجه لفيروس NDV المؤتلف والعمود الفقري المؤتلف (موقع الانقسام الموهن من فيروس من النوع البري) وفيروس LaSota-IL4R المؤتلف للتحصين داخل البويضات من عمر يوم واحد 18- البيض التجاري الذي يحتوي على نسبة عالية من الأجسام المضادة للأم. تم تضمين اللقاحات المتوفرة تجارياً LaSota و rHVT-ND كعناصر تحكم. بالإضافة إلى ذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم الفعالية الوقائية للقاحات المدروسة ضد التحديات المبكرة مع vNDV. هنا ، يتم إثبات قدرة هذه اللقاحات المؤتلفة على التغلب بكفاءة على مناعة الأم ، حتى في الجرعات المنخفضة ، والحث على استجابة مناعية قوية. أظهرت لقاحات rNDV التجريبية حماية بنسبة 100 في المائة بعد التحديات المبكرة مع vNDV.

2. المواد والأساليب

2.1. الفيروسات

تم استخدام أوزة خبيثة / China / ZJ1 / 2000 (ZJ1 ، رقم انضمام GenBank AF431744) NDV ، عضو في النمط الجيني الفرعي VII.1.1 (VIId سابقًا) ، كفيروس تحدي في هذه الدراسة. تم استخدام فيروس ZJ1 المؤتلف (نسخة موهنة من ZJ1) مع موقع انقسام خبيث منخفض (ZJ1 * L) تم إنشاؤه مسبقًا في مختبرنا من خلال علم الوراثة العكسية [39] كعمود فقري لإنشاء لقاحات ZJ1 * L المؤتلفة وكقاح الفيروس. تم استخدام سلالة لقاح LaSota (LS) منخفضة الضراوة كعنصر تحكم للقاح وكعمود فقري لتوليد لقاح LS-IL4R المؤتلف. تم الحصول على جميع الفيروسات من مستودع مختبر أبحاث الدواجن في جنوب شرق الولايات المتحدة (SEPRL) التابع لمركز أبحاث الدواجن الوطني بالولايات المتحدة (USNPRC) ، وزارة الزراعة الأمريكية (USDA). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام لقاح rHVT-ND المتاح تجاريًا (إدراج الجينات الاندماجية) كعنصر تحكم.

تم إنشاء لقاحات NDV التجريبية المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة باستخدام علم الوراثة العكسي ، كما هو موضح سابقًا [38،39]. باختصار ، تم استنساخ تسلسل ترميز الطيور IL4 في العمود الفقري لـ ZJ1 * L و LS في الاتجاه العكسي (IL4R) بين جينات P و M ، مما أدى إلى توليد اثنين من الفيروسات الحية الموهنة المؤتلفة - وهما ZJ1 * L-IL4R و LS- IL4R (أرقام الانضمام إلى GenBank MM680659 و MM680665 ، على التوالي). تم إنقاذ الفيروسات المؤتلفة باستخدام فيروس اللقاح المعدل في أنقرة الذي يعبر عن بوليميريز T7 (MVA / T7) ، باتباع البروتوكولات المنشورة سابقًا [38-41]. يتم توفير تمثيل تخطيطي للبنى في الشكل التكميلي S1A. لغرض هذا العمل ، يشير المصطلح "لقاحات DV" المستخدم فيما بعد إلى ZJ1 * L و ZJ1 * L-IL4R و LS-IL4R.

تم نشر المخزونات العاملة لجميع NDVs في {{0} إلى 11- بيض الدجاج المضغي (ECE) الذي يبلغ عمره يوم واحد (ECE) [42]. تم تخفيف المخزونات الفيروسية المستخدمة لتلقيح البيض في هذه الدراسة في مرق ضخ قلب الدماغ (BD Biosciences ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي يحتوي على 2 0 0 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، 2 {{22} } 0 0 U / mL بنسلين ، و 4 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين B ، إلى ثلاثة عيارات مستهدفة مختلفة ، 105.5 / 0.1 مل ، 104.5 / 0.1 مل ، و 103.5 / 0.1 مل جرعة معدية للجنين (EID50) ، باستثناء LS ، والذي تم تخفيفه إلى 105.5 / 0.1 مل و 104.5 / 0.1 مل EID. تم تأكيد عيارات مخزون العمل المخفف للقاحات الحية من خلال المعايرة الخلفية في 9- إلى 11- يوم واحد من SPF ECEs باتباع الإجراءات القياسية ، على النحو المشار إليه أعلاه. تم تخفيف لقاح rHVT-ND مباشرة باستخدام مخفف الزلال الجلوتامات والسكروز والفوسفات للقاحات rHVT الموصوفة في بروتوكول اختبار البيولوجيا البيطرية التابع لمركز وزارة الزراعة الأمريكية [43].

2.2. بيض

تم التبرع بمئتين وستين بيضة تجارية (غير مزودة بمعامل حماية من الشمس) من قطيع طبقة سلالة Hy-Line Rockside W -36 (مانسفيلد ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لهذه التجربة. تم تحصين قطيع الطبقة بشكل روتيني بلقاح LaSota. تم اختبار مناعة القطيع بانتظام بواسطة ELISA ، وعلى الرغم من أن هذه النتائج لا يمكن ترجمتها بشكل مباشر إلى عيار تثبيط التراص الدموي (HI) ، كان متوسط ​​مستويات الأجسام المضادة لـ NDV للقطيع الأبوي مرتفعًا جدًا (أي 15،534 مع قطع للإيجابية عينات 1159). كان مصدر SPF ECEs (42 بيضة) قطيع SEPRL SPF White Leghorn. تم تحضين جميع البيض عند درجة حرارة 37.5 درجة مئوية ورطوبة نسبية 55-60٪ لمدة 18 يومًا.

2.3 تلقيح

تم فصل البيض التجاري ({{{1 0}}}) وعامل الحماية من الشمس (ن=42) ، في عمر 18 يومًا من تكوين الجنين (DOE) ، إلى 14 مجموعة بها 21 بيضة في كل منها المجموعة (باستثناء مجموعات التحكم BHI و Hatch ، والتي كان كل منها يحتوي على 26 بيضة). باستخدام 1 مل ، 24 جم × 1/2 محاقن ، تم تلقيح كل بيضة في التجويف السقائي باستخدام 0. 1 مل من اللقاح المخفف أو BHI ، باستثناء مجموعة التحكم Hatch ، حيث لم يتم التلاعب بالبيض في الجميع. كانت هناك ثلاث عشرة مجموعة من البويضات الملقحة ، مقسمة إلى سبع مجموعات تجريبية وست مجموعات ضابطة. كانت المجموعات التجريبية السبع كالتالي: ZJ1 * L-IL4R 104.5 ، ZJ1 * L-IL4R 105.5 ، LS-IL4R 103.5 ، LS-IL4R 104.5 ، LS-IL4R 105.5 ، ZJ1 * L 104.5 ، و ZJ1 * L 105.5 ، كل منها يتلقى جرعة EID50 ذات الصلة من اللقاح لكل 0.1 مل كما هو مذكور في اسم المجموعة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء ست مجموعات تحكم. تم تلقيح مجموعتي تحكم من البيض التجاري كما هو موضح أعلاه باستخدام BHI و rHVT-ND ، على التوالي. تم تلقيح مجموعتي تحكم من البيض التجاري كما هو موضح أعلاه بجرعة LS 104.5 و LS 105.5 EID50 من اللقاح لكل 0.1 مل. تم تلقيح مجموعتين تحكم من بيض SPF بـ ZJ1 * L 103.5 و ZJ1 * L-IL4R 103.5. يتم توفير تمثيل تخطيطي لتصميم الدراسة في الشكل التكميلي S1B ، C.

بعد التلقيح ، تم وضع البيض داخل حاضنات Turbofan Hova-Bator Incubators (GQF Manufacturing Company Inc. ، GA ، الولايات المتحدة الأمريكية) والتي تم وضعها لاحقًا في عوازل في منشأة مستوى الأمن الحيوي للحيوان 2 (ABSL {2}}). تم تنظيم الحاضنات بثرموستات للحفاظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37.5 درجة مئوية ورطوبة نسبية بين 55 في المائة و 60 في المائة.

2.4 التفريخ ، أخذ العينات ، الوفيات

بعد الفقس في 21 DOE ، تم إيواء الكتاكيت في عوازل ضغط سالب (ABSL -2) وتم توفير الطعام والماء مع إمكانية الوصول إلى الإعلانات. تم التضحية بخمس دجاجات لا تحتوي على SPF من كل من مجموعة Hatch ومجموعة BHI ونزف الدم فورًا بعد الفقس لإنشاء عيار أساسي للأجسام المضادة للأمهات المضادة لـ NDV HI. تم وزن جميع الدجاج بعد 1 و 8 و 13 يومًا بعد الفقس (DPH). تم جمع مسحات من الفم والبلعوم والمذرق في BHI من كل طائر عند 2 و 4 DPH. تم تسجيل العلامات السريرية والوفيات مرتين يوميًا طوال فترة ما بعد الفقس ، وتم جمع عينات الدم عند 13 DPH.

2.5 تحدي

تم نقل اثني عشر طائرًا من كل مجموعة (باستثناء LS 1 {{1 0} 5.5 ، حيث ماتت جميع الطيور بمقدار 6 DPH) إلى منشأة ABSL -3 E عند 13 DPH. تم وضع الطيور في عوازل ذات ضغط سلبي وسمح لها بالتأقلم لمدة 24 ساعة قبل التحدي. تم تحدي جميع الطيور عند 14 DPH باستخدام ZJ1 NDV الخبيث عند 106 EID 50 / 0.1 مل بواسطة طريق العين والأنف. لوحظت الطيور يوميًا بحثًا عن العلامات السريرية ونفوقها. تم جمع مسحات من الفم والبلعوم والمذرق من كل طائر في 2 و 4 أيام بعد التحدي (DPC). تم وزن ونزف جميع الطيور الباقية على قيد الحياة عند 14 DPC وتم التخلص منها بشكل رحيم عن طريق خلع عنق الرحم بعد التخدير باستخدام 0.2 مل من محلول الكيتامين / زيلازين (66 ملجم / مل كيتامين و 6.6 ملجم / مل من زيلازين) في العضل باستخدام إبرة قياس 25-.

2.6. الوقت الحقيقي RT-PCR

تم استخراج الحمض النووي الريبي من جميع وسائط المسحة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي MagMAX 96 AI / ND (Ambion ، Inc. Austin ، TX ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع معالج الجسيمات المغناطيسية KingFisher (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع إرشادات الشركة المصنعة ، مع تعديل إزالة المانع الموصوف بواسطة Das et al. [44]. تم إجراء RT-PCR (rRT-PCR) الكمي في الوقت الحقيقي لاكتشاف NDV الذي يستهدف جين المصفوفة (M) باستخدام مجموعة RT-PCR ذات الخطوة الواحدة من AgPath-ID (Ambion) و ABI 75 0 {{31 }} نظام PCR السريع في الوقت الحقيقي (Applied Biosystems، Waltham، MA، USA) يستخدم البادئات والمسبار الموصوف سابقًا بواسطة Wise et al. [45]. كانت شروط الفحص عبارة عن نسخ عكسي لمدة 1 0 دقيقة عند 45 درجة مئوية ؛ تمسخ أولي لمدة 1 0 دقيقة عند 95 درجة مئوية ؛ 4 0 دورات من التمسخ لمدة 10 ثوانٍ عند 94 درجة مئوية ، التلدين التمهيدي لمدة 30 ثانية عند 56 درجة مئوية ، واستطالة التمهيدي لمدة 10 ثوانٍ عند 72 درجة مئوية. يتكون حجم التفاعل الكلي البالغ 25 ميكرولتر لكل عينة من ماء من الدرجة الجزيئية - 2.5 ميكرولتر ؛ 2X عازلة - 12.5 ميكرولتر ؛ التمهيدي الأمامي - 0.25 ميكرولتر (20 ميكرولتر / ميكرولتر) ؛ التمهيدي العكسي - 0.25 ميكرولتر (20 بيكومول / ميكرولتر) ؛ مسبار - 0.50 ميكرولتر (6 pmol / L) ؛ مزيج إنزيم 25X - 1.0 ميكرولتر ؛ وقالب RNA— 8.0 ميكرولتر. لتقدير حجم الفيروس ، تم إنشاء منحنى قياسي لكل فيروس ، مع استخراج الحمض النووي الريبي من نفس المخزون المعاير للفيروسات المستخدمة لتلقيح البيض (لعينات المسحة التي تم جمعها بعد الفقس) أو فيروس التحدي (لعينات المسحة التي تم جمعها بعد -تحدي).

تم الإبلاغ عن النتائج على أنها EID50 / مل. كان الحد الأدنى المحسوب للكشف عن المقايسات بين 101.7 و 101.9 EID50 / مل. من المهم ملاحظة أن rRTPCR يكتشف الأحماض النووية الفيروسية وأن القيم المقدرة لا تمثل بالضرورة الفيروسات المعدية. لا تهدف قيم EID50 / mL إلى تقديم العدوى وتستخدم لتوفير وسائل للمقارنة النسبية لتساقط الفيروس بين المجموعات. على الرغم من استخدام بروتوكول استخراج الأحماض النووية لإزالة المانع ، فقد يكون الحجم الكبير لقالب الحمض النووي الريبي قد أثر على الحسابات من المنحنى القياسي. تجدر الإشارة إلى أنه تم استخدام نفس الكمية من قالب الحمض النووي الريبي في جميع التفاعلات ، وستؤثر مثبطات المخلفات المحتملة على جميع النتائج بالتساوي.

2.7. مرحبا الفحص

تم استخدام مقايسة تثبيط التراص الدموي (HI) لتقييم وجود وتتر من الأجسام المضادة في عينات المصل التي تم جمعها خلال التجربة. باتباع الإجراءات المعيارية [46] ، تم استخدام الفيروس المستخدم باعتباره العمود الفقري لكل لقاح كمستضد لكل مجموعة من الأمصال (ZJ1 * L لجميع مجموعات ZJ1 و LS لجميع مجموعات LS). بالنسبة لعينات المصل التي تم جمعها بعد التحدي ، تم استخدام فيروس ZJ1 الخبيث كمستضد في اختبار HI. تم حساب التتر على أنه المعاملة بالمثل لآخر تخفيف مصل إيجابي عالي الارتفاع ، واعتبرت العينات التي تحتوي على عيار HI من السجل 2 3 وأقل سلبية.

2.8 تحاليل احصائية

تم استخدام برنامج Prism v.7. 0 3 (GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA، USA) لتحليل البيانات ، وتم تحديد القيم المتطرفة باستخدام اختبار ROUT. تم إجراء اختبار الوضع الطبيعي D'Agostino-Pearson لتقدير ما إذا كانت القيم في كل مجموعة جاءت من توزيع غاوسي. بناءً على التوزيع الطبيعي ، تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis غير المعياري مع الاختبار اللاحق لـ Dunn لإجراء مقارنات متعددة بين المجموعات. لأغراض إحصائية ، تم إعطاء جميع عينات المسحات التي لم يتم اكتشاف الفيروسات منها قيمة رقمية تبلغ 1 سجل أقل من حد الكشف لكل فيروس. تم تحليل منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار رتبة اللوغاريتم (Mantel-Cox). تم تعيين الدلالة الإحصائية عند قيمة p <0.05.

3. النتائج

3.1. قابلية الفقس ، البقاء على قيد الحياة بعد الفقس ، وأوزان الجسم

تم تصوير البقاء على قيد الحياة بعد الفقس لجميع المجموعات التي تم فقسها من البيض التجاري كمنحنيات للبقاء في الشكل 1 (مفصولة في الشكلين 1 أ و ب من أجل الوضوح ولتجنب ازدحام الرسومات). يتوفر رسم بياني مدمج في الشكل التكميلي S2. تم تضمين مجموعة التحكم Hatch (غير الملقحة) في التصميم للتأكد من عدم وجود قابلية فقس غير طبيعية أو نفوق ما بعد الفقس لم يكن له علاقة بتلقيح البيض.

كما هو متوقع ، لوحظ معدل وفيات منخفض جدًا (rHVT-ND) إلى معدوم (Hatch و BHI) بعد الفقس في ثلاث من مجموعات التحكم. في المقابل ، نجحت مجموعات التحكم في LS بنسبة 57.1 بالمائة و 0 بالمائة عند استخدام الجرعات 104.5 و 105.5 على التوالي ، والتي تم الإبلاغ عنها سابقًا للقاحات الحية التقليدية ND. لم تفقس بيضتان في مجموعة LS-IL4R 105.5 ولم تفقس بيضة واحدة في مجموعة LS 104.5. لوحظ معدل وفيات متغير في المجموعات الأخرى حسب اللقاح وجرعة التلقيح. كان لدى مجموعتي ZJ1 * L-IL4R 104.5 و 105.5 90.5 في المائة و 71.4 في المائة على التوالي ، وكانت نسبة البقاء على قيد الحياة المسجلة في مجموعات ZJ1 * L 104.5 و 105.5 80.9 في المائة و 76.2 في المائة على التوالي (الشكل 1 أ) ، لكن الاختلافات كانت ليست ذات دلالة إحصائية. كانت نسبة البقاء على قيد الحياة في مجموعة LS-IL4R 103.5 95.2 بالمائة. كانت معدلات البقاء على قيد الحياة التي لوحظت في مجموعتي LS-IL4R 104.5 و 105.5 85.7 بالمائة و 66.7 بالمائة على التوالي (الشكل 1 ب).

لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في البقاء على قيد الحياة بين مجموعات اللقاح التجريبية ZJ1 * L و ZJ1 * L-IL4R و LS-IL4R ومجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND ، لكن النسبة المئوية للبقاء في هذه المجموعات الضابطة كانت أعلى عدديًا. ، مع وجود ارتباط سلبي بين جرعة اللقاح والبقاء على قيد الحياة بعد الفقس لوحظ (زيادة البقاء على قيد الحياة مع انخفاض جرعة اللقاح). كان للمجموعة الضابطة LS 1 {{1 0} 5.5 اختلافات معنوية في البقاء على قيد الحياة مقارنة بالمجموعات التجريبية (قيم p بين 0. 0 001 و 0.02). كانت مجموعة LS 104.5 الضابطة ، على الرغم من عدم اختلافها إحصائيًا ، لديها معدلات بقاء أقل بكثير مقارنة بالمجموعات التجريبية بنفس الجرعة. كان لمجموعتي التحكم LS اختلافات كبيرة في البقاء على قيد الحياة مقارنة بمجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND (قيم p بين 0.0001 و 0.04). لم تلاحظ العلامات السريرية في أي من المجموعات بعد الفقس. في المجموعات التي يوجد فيها نفوق بعد الفقس ، تم العثور على الطيور ميتة عند الفحوصات اليومية.

تم وزن جميع الطيور في الأيام 1 و 8 و 13 بعد الفقس (الجدول 1). عند 1 DPH ، كان متوسط ​​وزن الجسم لكل طائر في معظم المجموعات بين 38.5 و 42.6 جرامًا (جم). كانت هناك اختلافات كبيرة في وزن الجسم فقط بين rHVT-ND و ZJ1 * L-IL4R 1 0 4.5 مجموعات من جانب واحد و ZJ1 * L 1 0 4.5 والتحكم LS 1 {{4 {{42} }}} 4.5 من الأخرى (وزن الطيور في المجموعتين الأوليين أكثر من الطيور في المجموعة الضابطة) (قيم p بين 0. 0 001 و 0.017 على التوالي). عند 8 DPH ، كانت المجموعتان ZJ1 * L و LS-IL4R 104.5 ، ومجموعة LS-IL4R 105.5 ، ومجموعة LS الضابطة (متوسط ​​الوزن 50-63 جم) أقل وزنًا بشكل ملحوظ مقارنةً بالطيور من الفتحة ، مجموعات التحكم BHI و rHVT-ND (متوسط ​​الوزن 77-82 جم) (قيم p بين 0.0001 و 0.03). كانت نفس المجموعات التي كانت مختلفة بشكل كبير عن عناصر التحكم عند 8 DPH (باستثناء LS-IL4R 104.5) ذات أوزان جسم أقل بكثير من مجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND عند 13 DPH أيضًا (قيم p بين 0.0001 و 0.01). لم يتم تضمين الطيور من مجموعات التحكم في عامل الحماية من الشمس (SPF) الملقح في هذه المقارنة ، لأن بيض SPF (والطيور التي تفقس منها) عادةً ما يكون أصغر وأخف من البيض التجاري.

الشكل 1. بقاء الدجاج بعد الفقس بعد تلقيح البيض التجاري في 18 يومًا من الأمة الجنينية مع لقاحات البيض NDV التجريبية. تم تلقيح بيض Hy-Line Rockside W -36 بالفيروسات المؤتلفة و LaSota. تم تلقيح ثلاث مجموعات تحكم بلقاح BHI أو rHVT-ND ، أو لم يتم تلقيحها (مجموعة التحكم Hatch). تم مراقبة الطيور لمدة 13 يومًا بعد الفقس. منحنيات البقاء على قيد الحياة معروضة في شكلين: (أ) مجموعات التحكم ومجموعات ZJ1 * L و (ب) مجموعات التحكم ومجموعات LS-IL4R. تشير الأحرف المرتفعة المختلفة إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (القيمة الاحتمالية <0. 05). اختصارات المجموعة: HATCH - بيض غير ملقّح ؛ BHI - البيض الملقح بـ BHI ؛ rHVT-ND - البيض الملقح بلقاح HVT المؤتلف ؛ ZJ1 * L - بيض مُلقَّح بفيروس ZJ1 * L المؤتلف الذي تم تعديل موقع انقسامه ليكون منخفض الفوعة ؛ ZJ1 * L-IL4R - بيض مُلقَّح بـ ZJ1 * L منخفض الضراوة المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 مُدخل في اتجاه عكسي ؛ LS - بيض مُلقَّح بسلالة LaSota ؛ LS-IL4R— يتم تلقيح البيض بفيروس LaSota المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 الذي تم إدخاله في اتجاه عكسي. يتم تمثيل جرعة الفيروس التي يتلقاها البيض في كل مجموعة كرقم بعد اسم المجموعة في EID50 / لكل بيضة.

الجدول 1. متوسط ​​الأوزان (والانحرافات المعيارية) للدجاج عند 1 و 8 و 13 يومًا بعد الفقس بعد تلقيح البيض التجاري في 18 يومًا من الأجنة بلقاحات تجريبية في البويضات وفي 14 يومًا بعد التحدي مع مرض نيوكاسل الخبيث الفيروس.

3.2 إفراز فيروسات اللقاح بعد التطعيم ، كما يتضح من rRT-PCR

في 2 DPH ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في إفراز الفيروس بين مجموعات اللقاح. (الشكل 2 أ). وبالمثل ، في 4 DPH ، لم تكن الاختلافات بين المجموعات ذات دلالة إحصائية. (الشكل 2 ب). لم يتم اكتشاف أي تساقط فيروسي في أي من الطيور المكافحة Hatch و BHI.

الشكل 2. متوسط ​​تساقط لقاح ما بعد الفقس من دجاج فقس من بيض تجاري تم تلقيحه في 18 يومًا من الأجنة بلقاحات تجريبية في البويضات. تمثل كل نقطة بيانات طائرًا و NDV عيارًا تم اكتشافه في مسحات البلعوم الفموي (OP) والمذرق (CL) في أيام مختلفة بعد الفقس (DPH). يتم تقديم سفك بشكل منفصل لمدة يومين بعد الفتحة (أ) و 4 أيام بعد الفقس (ب). تمثل الأشرطة الانحرافات المعيارية للمتوسط. تم إعطاء جميع المسحات التي لم يتم اكتشاف الفيروس منها قيمة عددية قدرها 1 سجل أقل من حد الكشف لكل من الفيروسات المعنية. يتم تقديم حد اكتشاف rRT-PCR كخط منقط أفقي (يتم استخدام الحد الأدنى). اختصارات المجموعة: HATCH - بيض غير ملقّح ؛ BHI - البيض الملقح بـ BHI ؛ rHVT-ND - البيض الملقح بلقاح HVT المؤتلف ؛ ZJ1 * L - بيض مُلقَّح بفيروس ZJ1 * L المؤتلف الذي تم تعديل موقع انقسامه ليكون منخفض الفوعة ؛ ZJ1 * L-IL4R - بيض مُلقَّح بـ ZJ1 * L منخفض الضراوة المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 مُدخل في اتجاه عكسي ؛ LS - بيض مُلقَّح بسلالة LaSota ؛ LS-IL4R— يتم تلقيح البيض بفيروس LaSota المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 الذي تم إدخاله في اتجاه عكسي. يتم تمثيل جرعة الفيروس التي يتلقاها البيض في كل مجموعة كرقم بعد اسم المجموعة في EID50 / لكل بيضة.

3.3 الاستجابة المناعية الخلطية بعد الفقس

يوضح الشكل 3 تحليل عينات المصل التي تم جمعها عند 13 DPH (قضبان مملوءة بشريط قطري) بواسطة مقايسة HI (الكشف عن الأجسام المضادة للتلوث الدموي لـ NDV). تم نزف الدجاج مباشرة بعد الفقس (0 DPH). تباينت التتر HI عند الفتحة بين السجل 2 5 والسجل 2 8 ، بمتوسط ​​سجل 2 7. 17 (الشكل 3 ، خط أحمر أفقي منقط). الأجسام المضادة عند 13 DPH في مجموعات Hatch و BHI و rHVT-ND (متوسط ​​السجل 2 4. 7) هي أجسام مضادة متبقية للأم ، نظرًا لأن هذه المجموعات إما لم يتم تحصينها أو تم تحصينها بلقاح rHVT-ND ، وهو ما يحدث بالفعل لا تحفز الأجسام المضادة HI إلى NDV. كانت عيارات الأجسام المضادة في مجموعات ZJ1 * L و ZJ1 * L-IL4R و LS 104.5 أعلى بكثير مقارنة بمجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND. لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات الجرعات المختلفة للقاحات التي لها نفس العمود الفقري. كان لمجموعات LS-IL4R عيارات HI أقل بعد التطعيم مقارنة بمجموعات ZJ1 * L-IL4R و ZJ1 * L ، على الرغم من أن هذه الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية. من الجدير بالذكر ، على الرغم من ارتفاعها عددًا قليلاً ، إلا أن عيارات HI بعد التطعيم للطيور في جميع مجموعات LS-IL4R لم تكن مختلفة بشكل كبير عن التتر المقاسة في الطيور غير المحصنة.

الشكل 3. عدادات الأجسام المضادة HI قبل وبعد التحدي (والانحراف المعياري) من الدجاج الذي فقس من البيض التجاري الملقح في 18 يومًا من الأجنة مع لقاحات تجريبية في البيض والتحدي المبكر مع فيروس مرض نيوكاسل الخبيث في 14 يومًا بعد الفقس. تمثل القضبان المملوءة بالشريط المائل عيار ما قبل التحدي في 13 يومًا بعد الفتحة. تمثل القضبان الصلبة المملوءة التتر بعد التحدي بعد 14 يومًا من التحدي. يتم عرض فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات المختلفة بأحرف صغيرة فوق كل مجموعة (قيمة p<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. العلامات السريرية والبقاء على قيد الحياة بعد التحدي المبكر مع CDV

في مجموعات التحكم ، كانت العلامات السريرية الأولى التي تمت ملاحظتها في مجموعات Hatch و BHI في 3 DPC. ثلاثة طيور في مجموعة Hatch وطائر واحد في مجموعة BHI عانوا من التنفس. في 4 DPC ، شوهد الريش المنتفخ وهزات الرأس في مجموعات BHI والفتحة ، وفي 5 DPC في مجموعة rHVT-ND ؛ في المجموعة الأخيرة ، تم تسجيل رنح وصعر شديد في عصفورين. أظهرت الطيور في مجموعة التحكم في Hatch الخمول عند 5 DPC ، وأظهر عصفوران في مجموعة BHI الشلل. لوحظ الخمول والشلل في مجموعة rHVT-ND عند 6 و 7 DPC. لوحظ وجود Opisthotonos ، صعر ، وصعوبة في التنفس في مجموعات التحكم Hatch و BHI بدءًا من 9 DPC. في مجموعة rHVT-ND ، لوحظ الصعر في وقت مبكر من 5 DPC ، بدأ التنفس الصعب والرنح عند 6 DPC ، وبدأ opisthotonos عند 13 DPC. بحلول 14 DPC ، ماتت جميع الطيور باستثناء طائرين هاتش وواحد BHI واثنان من الطيور rHVT-ND (83.3 بالمائة و 91.6 بالمائة و 83.3 بالمائة من المراضة على التوالي) أو ظهرت عليها علامات سريرية عصبية في الغالب مثل الرنح ، والتشنج ، والصعر ، والرعشة ويشل. تم التخلص من الطيور التي ظهرت عليها علامات سريرية شديدة ، أو توقفت عن الأكل أو الشرب ، أو بقيت راقدًا ، وأُبلغ عن نفوقها في اليوم التالي لحساب أوقات البقاء على قيد الحياة. لم يلاحظ أي علامات سريرية في أي من مجموعات ZJ1 * L و ZJ1 * L-IL4R. لوحظ وجود علامات سريرية طفيفة على طائر opisthotonos أو صعر في طائر واحد (8.4 بالمائة مراضة) في كل مجموعة من مجموعات LS-IL4R ومجموعة LS 104.5 في 14 DPC.

تم تصوير البقاء على قيد الحياة بعد التحدي مع ZJ1 NDV الخبيث كمنحنيات البقاء على قيد الحياة في الشكل 4. بينما أظهرت جميع المجموعات الملقحة باللقاحات المؤتلفة و LS نسبة بقاء بنسبة 100 في المائة ، كان لدى الطيور في مجموعات Hatch و BHI و rHVT-ND 58.3 بالمائة ، 58.3 في المائة و 66.6 في المائة البقاء على قيد الحياة على التوالي. كان البقاء على قيد الحياة بعد التحدي في هاتش ومجموعات التحكم BHI أقل بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعات اللقاح التجريبية. من الجدير بالملاحظة ، على الرغم من أن أوزان أجسام الطيور في المجموعات الملقحة كانت تتأرجح بعد الفقس مقارنةً بعناصر التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND ، إلا أن جميع الطيور المحصنة بـ rNDV (282-328 جم) تجاوزت أوزان أجسام غير الملقحة مراقبة الطيور بعد التحدي (255-266 جم) (الجدول 1). ومع ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف كبير في وزن الجسم بين أي من المجموعات المدروسة.

الشكل 4. بقاء الدجاج بعد تلقيح البيض التجاري في 18 يومًا من الأجنة بلقاحات تجريبية في البويضات والتحدي المبكر لفيروس مرض نيوكاسل الخبيث في 14 يومًا بعد الفقس. تم مراقبة الطيور لمدة 14 يومًا بعد التحدي. تشير الأحرف المرتفعة المختلفة إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (القيمة الاحتمالية <0. 05). اختصارات المجموعة: HATCH - بيض غير ملقّح ؛ BHI - البيض الملقح بـ BHI ؛ rHVT-ND - البيض الملقح بلقاح HVT المؤتلف ؛ ZJ1 * L - بيض مُلقَّح بفيروس ZJ1 * L المؤتلف الذي تم تعديل موقع انقسامه ليكون منخفض الفوعة ؛ ZJ1 * L-IL4R - بيض مُلقح بـ ZJ1 * L منخفض الضراوة المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 تم إدخاله في اتجاه عكسي ؛ LS - بيض مُلقَّح بسلالة LaSota ؛ LS-IL4R— يتم تلقيح البيض بفيروس LaSota المؤتلف مع جين الإنترلوكين -4 الذي تم إدخاله في اتجاه عكسي. يتم تمثيل جرعة الفيروس التي يتلقاها البيض في كل مجموعة كرقم بعد اسم المجموعة في EID50 / لكل بيضة.

3.5 سفك ما بعد التحدي كما يتضح من rRT-PCR

في 2 DPC ، أسقطت الطيور في مجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND عيارًا فيروسيًا عاليًا (1 {{2 0}} 5.3-5.7 EID50 / مل) من خلال المسار الفموي ، في حين أن جميع مجموعات اللقاح كان أقل من 104 EID50 / مل يعني ذرف التتر (الشكل 5 أ). كانت نتائج سفك الفيروس من خلال مجرور أقل من حد الكشف للمقايسة في جميع المجموعات. في 2 DPC ، كانت الطيور في جميع مجموعات ZJ1 * L و ZJ1 * L-IL4R وتلك الموجودة في مجموعة LS-IL4R 105.5 أقل بكثير من RNA الفيروسي الذي تم اكتشافه من خلال المسار الفموي مقارنة بمجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND (تراوحت قيم p بين 0.001 و 0.02). في 4 DPC ، كان التساقط عبر الطريق الفموي في مجموعات Hatch و BHI و rHVT-ND مرتفعًا (106.2-6.9 EID50 / مل) (الشكل 5 ب).

في المقابل ، لوحظ تساقط أقل في جميع مجموعات اللقاح عند 4 DPC مقارنة بـ 2 DPC ، مع أعلى متوسط ​​عيار 102.9 EID50 / مل في مجموعة ZJ1 * L 104.5 وأقل متوسط ​​عيار 101.5 EID50 / مل في ZJ1 * مجموعة l-IL4R 104.5 (لم يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي في بعض الطيور). جميع مجموعات لقاح rNDV التجريبية تسقط فيروسات أقل بشكل ملحوظ من خلال الطريق الفموي مقارنة بمجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND (قيم p من<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

الشكل 5. متوسط ​​تساقط الفيروس بعد التحدي من الدجاج بعد تلقيح البيض التجاري في 18 يومًا من الأجنة بلقاحات تجريبية في البويضات والتحدي المبكر لفيروس مرض نيوكاسل الخبيث في 14 يومًا بعد الفقس. تمثل كل نقطة بيانات عيارات NDV المكتشفة في مسحات البلعوم الفموي (OP) والمذرق (CL) في أيام مختلفة بعد التحدي (DPC). يتم تقديم سفك بشكل منفصل لمدة يومين بعد التحدي (أ) و 4 أيام بعد التحدي (ب). تمثل الأشرطة الانحرافات المعيارية للمتوسط. تم إعطاء جميع المسحات التي لم يتم اكتشاف الفيروس منها قيمة عددية قدرها 1 سجل أقل من حد الكشف. يتم تقديم حد اكتشاف rRT-PCR كخط منقط أفقي.

يتم عرض فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات المختلفة بأحرف صغيرة فوق كل مجموعة (قيمة p <0. 05). اختصارات المجموعة: HATCH - بيض غير ملقّح ؛ BHI - البيض الملقح بـ BHI ؛ rHVT-ND - البيض الملقح بلقاح HVT المؤتلف ؛ ZJ1 * L - بيض مُلقَّح بفيروس ZJ1 * L المؤتلف الذي تم تعديل موقع انقسامه ليكون منخفض الفوعة ؛ ZJ1 * L-IL4R - بيض مُلقَّح بـ ZJ1 * L منخفض الضراوة المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 مُدرج في اتجاه عكسي ؛ LS - بيض مُلقَّح بسلالة LaSota ؛ LS-IL4R— يتم تلقيح البيض بفيروس LaSota المؤتلف مع جين إنترلوكين -4 الذي تم إدخاله في اتجاه عكسي. يتم تمثيل جرعة الفيروس التي يتلقاها البيض في كل مجموعة كرقم بعد اسم المجموعة في EID50 / لكل بيضة.

3.6 أمصال ما بعد التحدي

أظهرت جميع الطيور في مجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND زيادة (أكثر من ضعف) عيار الأجسام المضادة HI عند 14 DPC (أعلى من السجل 2 10) مقارنة مع عيارات ما قبل التحدي عند 13 DPH (سجل {{ {6}} .7). كانت الاختلافات في التتر في هذه المجموعات الثلاث قبل وبعد التحدي كبيرة (قيمة p<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7 تلقيح مجموعات التحكم في SPF

كان البقاء على قيد الحياة في مجموعات التحكم في SPF بعد الفتحة 66.7 في المائة في المجموعة الملقحة بـ ZJ1 * L 103.5 و 57.1 في المائة في المجموعة الملقحة بـ ZJ1 * L-IL4R 103.5 (الشكل التكميلي S3A). تم الكشف عن تساقط فيروسي نشط في الطيور في مجموعات التحكم في SPF من خلال كلا المسارين ، مع اكتشاف التتر الأعلى في عينات مسحة الفم والبلعوم (انظر الشكل التكميلي S3B). كانت عيارات HI بعد التطعيم لطيور التحكم في عامل الحماية من الشمس (SPF) الملقحة أعلى من التتر في مجموعات التحكم Hatch و BHI و rHVT-ND ووصلت إلى متوسط ​​قيم السجل 2 7. 08 والسجل 2 7. 58 عند 13 DPH في مجموعات ZJ1 * L-IL4R 103.5 و ZJ1 * L-IL4R 103.5 ، على التوالي (انظر الشكل التكميلي S3C). لم يلاحظ أي علامات سريرية أو وفيات بعد التحدي في مجموعتي التحكم في SPF الملقحين (انظر الشكل التكميلي S3D لمنحنيات البقاء على قيد الحياة). ألقت الطيور من مجموعات التحكم في عامل الحماية من الشمس (SPF) الملقحة فيروسات أقل بشكل ملحوظ عبر الطريق الفموي عند 2 DPC و 4 DPC مقارنة بمجموعات التحكم (قيم p من<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com