يتم تطهير العديد من المحاليل المرتبطة بالبروتين بواسطة الكلى بكفاءة عالية

تزيل الكلى العديد من المواد المذابة من البلازما. ومع ذلك ، فإن الاحتفاظ بهذه المواد المذابة يسبب مرض اليوريمي عندما تفشل الكلى. نحن نعرف القليل بشكل ملحوظ عن المواد السامة المحتجزة ، مما يحد من قدرتنا على تحسين علاجات غسيل الكلى.

لاستكشاف هذا ، استخدمنا مطياف الكتلة غير المستهدفة لتحديد المواد المذابة التي يتم تطهيرها بكفاءة بواسطة الكلى. كشف مطياف الكتلة عالي الدقة عن 1808 سمة في الترشيح الفائق للبول والبلازما لـ 5 أفراد مع وظائف كلوية طبيعية. كانت معدلات التخليص المقدرة بـ 1082 قمة أكبر من تصفية الكرياتينين التي تشير إلى إفراز أنبوبي.

حدد التحليل الإضافي 90 سمة تمثل المواد المذابة مع معدلات إزالة مقدرة أكثر أهمية من تدفق البلازما الكلوية. أكد مطياف الكتلة الكمي مع تخفيف النظائر المستقرة أن التصفية الفعالة لهذه المواد المذابة أصبحت ممكنة من خلال الجمع بين الارتباط ببروتينات البلازما والإفراز الأنبوبي. حدد مقياس الطيف الكتلي الترادفي الهوية الكيميائية لـ 13 مادة مذابة بما في ذلك حمض الهيبوريك وكبريتات الإندوكسيل وكبريتات ف كريسول. وُجِد أن هذه المواد المذابة الـ 13 التي تم تفريغها بكفاءة تتراكم في بلازما مرضى غسيل الكلى ، مع ارتفاع المستويات الحرة إلى أكثر من 20- ضعفًا طبيعيًا للجميع باستثناء اثنين منهم. وبالتالي ، قد يوفر المزيد من التحليل للمذابات التي يتم تطهيرها بكفاءة عن طريق الإفراز في الكلية الأصلية طريقًا محتملاً لتحديد السموم اليوريمية.

انقر لمعرفة cistanche wirkung

الكلمات الدالة

مطياف الكتلة ؛ وظائف الكلى ؛ السموم

تزيل الكلى العديد من الفضلات المذابة من بلازما الدم. عند فقدان وظائف الكلى ، تتراكم هذه المواد المذابة في الجسم وتسبب مرض اليوريمي الذي يصل إلى ذروته في حالة الوفاة ما لم يتم استبدال وظيفة الكلى جزئيًا بغسيل الكلى.

في الوقت الحالي ، لا نعرف سوى القليل من التدريب حول ما هو سام ، وهذا النقص في المعرفة يحد من قدرتنا على تحسين العلاج. 1 ، 2 كان التقدم بطيئًا جزئيًا لأن عدد المواد المذابة المحتفظ بها عند فشل الكلى كبير جدًا. 1. ، 3. ، 4. ، 5. ، 6. استخدمت هذه الدراسة مطياف الكتلة غير المستهدفة لإيجاد المواد المذابة التي تمت إزالتها بكفاءة من البلازما عن طريق الكلى.

وكشفت أن هناك العديد من النفايات المذابة التي تتجاوز معدلات التصفية الكلوية تدفق البلازما الكلوية لها. تتطلب هذه الارتباطات عالية التخليص بروتينات البلازما وإفراز أنبوبي نشط. يمكن أن ترتفع تركيزات هذه المواد المذابة إلى مستويات عالية عندما يتم استبدال وظيفة الكلى بغسيل الكلى الذي يزيل فقط عن طريق الانتشار. اضغط على القول بأن التطور قد وفر للكلى لإزالة المواد السامة بكفاءة ، وتحديد المواد المذابة ذات معدلات التصفية الكلوية المرتفعة يمكن أن يوفر طريقًا لتحديد السموم اليوريمية.

نتائج

تم إجراء القياسات في أربعة رجال وامرأة واحدة مع وظائف الكلى الطبيعية كما يتضح من متوسط ​​تصفية الكرياتينين 142 ± 22 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2. تم اكتشاف ما مجموعه 1808 ميزة في كل من الترشيح الفائق للبول والبلازما عن طريق مطياف الكتلة عالية الدقة غير المستهدفة. تم تقدير معدلات التخليص لهذه الميزات على أنها معدل إفراز البول مقسومًا على التركيز في الترشيح الفائق للبلازما. يتم التعبير عن قيم التصفية من حيث تركيز المذاب "الحر" غير المنضم في البلازما بدلاً من التركيز الكلي للمذاب.

يوضح الشكل 1 توزيع معدلات التخليص المقدرة المتعلقة بتصفية الكرياتينين. بالنسبة إلى 1082 سمة ، كانت معدلات التخليص المقدرة أكبر من تصفية الكرياتينين بمعدل اكتشاف خاطئ قدره q.<0.05. Because the creatinine clearance is slightly higher than the glomerular filtration rate (GFR), these features were considered likely to represent solutes secreted by the renal tubules. There were, in contrast, only 290 features with estimated clearance rates less than the creatinine clearance with a false discovery rate of q<0.05.

الشكل 1. يمثل الخط الأزرق توزيع معدلات التخليص المقدرة بالنسبة إلى تصفية الكرياتينين لميزات 1808 الموجودة في الترشيح الفائق للبول والبلازما للأشخاص الطبيعيين. تمثل المثلثات الحمراء السمات الـ 13 التي تم تأكيد الهوية لها من خلال تحليل معايير الكاشف.

بالنسبة لـ 163 ميزة ، كانت معدلات التخليص المقدرة أكثر من سبعة أضعاف تصفية الكرياتينين. يشير هذا إلى أن تصاريحهم تجاوزت تدفق البلازما الكلوي ، وهو ما يقرب من أربعة أضعاف تصفية الكرياتينين.

من بين هذه الميزات البالغ عددها 163 ، تم اعتبار 90 على أنها تمثل مركبات كيميائية فريدة بعد إزالة التكرارات ، واعتُبر أن الميزات تمثل الثنائيات أو المقاربات أو النظائر أو المصنوعات اليدوية في المراجعة اليدوية للكروماتوجرام (الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت). تم البحث عن المركبات ذات القيم الكتلية المطابقة في قواعد البيانات القياسية ، وتم إنشاء الهويات الكيميائية لـ 13 من هذه الميزات التسعين بمقارنة أوقات الاحتفاظ الكروماتوجرافي وأطياف قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) مع تلك الخاصة بمعايير الكاشف (الجدول 1 والتكميلي 1) الجدول S2 عبر الإنترنت). بالنسبة لـ 40 من 90 سمة ذات أهمية ، ومع ذلك ، لم يتم العثور على مركبات مرشحة بين المستقلبات البشرية المعروفة بكتلة في حدود 3 أجزاء لكل مليون (جزء في المليون) (الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت). ممكن لأن التركيزات "الحرة" لهذه المواد المذابة في الترشيح الفائق للبلازما كانت أقل من تركيزاتها الكلية في البلازما ، مما يعكس على الأرجح الارتباط ببروتينات البلازما.

على الرغم من أن جميع المواد المذابة التي تم تطهيرها بكفاءة كانت مرتبطة بالبروتين ، إلا أن مدى الارتباط تباين على نطاق واسع ، حيث تراوح الجزء الحر من 2 إلى 52 بالمائة من إجمالي تركيز البلازما. أسفر الحساب من حيث إجمالي تركيز البلازما عن قيم تخليص أقل بكثير للمذابات المرتبطة (الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت).

الجدول 1. يتم تخليص المواد المذابة بكفاءة عن طريق الكلى الأصلية وتراكمها في مرضى غسيل الكلى.

القيم تعني ± sd التصفية / التصفية هي متوسط ​​نسبة تصفية المواد المذابة إلى تصفية الكرياتينين. الكسر الحر هو المستوى في الترشيح الفائق للبلازما كنسبة مئوية من مستوى البلازما الكلي. غسيل الكلى / العادي هو نسبة متوسط ​​تركيز المعالجة المسبقة في مرضى غسيل الكلى إلى متوسط ​​التركيز في الأشخاص العاديين.

a

يشير إلى q<0.05 for the elevation of the solute concentration in hemodialysis patients above the level in normal subjects.

b

يشير إلى أن الكسر الحر للفورويلجليسين قد تم حسابه في موضوع واحد فقط لأن القمم في عينات البلازما من موضوعات أخرى كانت صغيرة جدًا بحيث لا يمكن تحديدها كميًا.

أكدت القياسات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة / مقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC / MS / MS) مع المعايير المسمى بالنظائر ، العثور على معدلات خلوص عالية جدًا للهيبورات المذابة المقيدة ، وكبريتات الإندوكسيل ، وكبريتات p-cresol. تم تلخيص قيم التصفية لهذه المواد المذابة مع اليوريا والكرياتينين في الجدول 2.

للمقارنة ، تم أيضًا قياس قيم التصفية لـ phenylacetylglutamine الذي أظهرت الدراسات السابقة أنه يتم إفرازه بواسطة الأنابيب الكلوية ولكنه غير مرتبط إلى حد كبير .9 كما هو متوقع ، كان تصفية اليوريا أقل من تصفية الكرياتينين ، مما يعكس إعادة الامتصاص الأنبوبي بعد الترشيح الكبيبي. على النقيض من ذلك ، بلغ متوسط ​​إزالة فينيل أسيتيل الجلوتامين 455 ± 62 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2 أو ما يقرب من ثلاثة أرباع معدل تدفق البلازما الكلوي المقدر. كانت قيم التخليص للهيبورات وكبريتات الإندوكسيل وكبريتات p-cresol أعلى من ذلك بكثير. كانت القيم التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص الكمي مع المعايير المسمى أقل قليلاً من تلك المقدرة من مناطق الذروة التي تم تقييمها بواسطة مطياف الكتلة غير المستهدفة ، ولكنها لا تزال أعلى بكثير من تدفق البلازما الكلوي المقدر. كانت قيم التخليص لهذه المذابات المعبر عنها من حيث تركيز البلازما الكلي أقل بكثير من تلك المعبر عنها من حيث التركيز الحر ولم تتجاوز تدفق البلازما الكلوية.

الجدول 2. قيم التخليص التي تم الحصول عليها باستخدام مقايسة LC / MS / MS

اختصار:

LC / MS / MS ، اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي الترادفي.

القيم تعني ± sd التصفية / التصفية هي متوسط ​​نسبة تصفية المواد المذابة إلى تصفية الكرياتينين. الكسر الحر هو المستوى في الترشيح الفائق للبلازما كنسبة مئوية من مستوى البلازما الكلي. Clearancetotal هي القيمة التي يمكن الحصول عليها إذا تم حساب التصفية باستخدام التركيز الكلي للبلازما بدلاً من التركيز الخالي من البلازما.

فحصت دراسات إضافية التراكم في المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي من المواد المذابة التي تم تطهيرها بكفاءة عن طريق الكلى الأصلية. كما تم تلخيصه في الجدول 1 ، تم رفع المستويات الحرة لجميع المذابات الـ 13 المحددة كيميائيًا مع معدلات تصفية الكلى الأصلية المرتفعة في مرضى غسيل الكلى. وتجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لجميع هذه المواد المذابة باستثناء اثنين ، كان متوسط ​​التركيزات الحرة في عينات المعالجة المسبقة من مرضى غسيل الكلى أكثر من 20- أضعاف المعدل الطبيعي ، وارتفعت تركيزات المذاب الحر أعلى من إجمالي تركيزات المذاب. تم العثور أيضًا على الغالبية العظمى من المواد المذابة التي تتميز فقط بقيم الكتلة الدقيقة التي تحتوي على تصاريح كلية أصلية عالية تتراكم في مرضى غسيل الكلى ، كما تم تلخيصه في الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت.

مناقشة

لقد وجدت الدراسات الأيضية أن البول يحتوي على مئات من المواد المذابة ، والتي لا يزال يتعين تحديد معظمها كيميائيًا. 10 ، 11. ، 12. من المفترض أن يتم إزالة البلازما من معظم هذه المواد المذابة عن طريق الكلى ، وتراكمها في الجسم. حيث أن المواد المذابة اليوريمية قد تساهم في المرض عندما تنخفض وظائف الكلى. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، لدينا القليل من المعرفة حول أي من هذه المواد المذابة مهمة سريريًا.

صُممت هذه الدراسة لتحديد المواد المذابة التي تكون معدلات التصفية الكلوية فيها عالية جدًا في العادة. بالنسبة لأي معدل إنتاج للمذاب ، تعمل الخلوص العالي على إبقاء مستوى المذاب في الجسم منخفضًا. وبالتالي يمكننا أن نتوقع العثور على مركبات نفايات سامة بين تلك المواد المذابة ذات معدلات التخليص العالية. كشف تحليل عينات البول والرشح الفائق التوقيت عن طريق مطياف الكتلة غير المستهدفة عن وجود 90 سمة يُعتقد أنها من المحتمل أن تتوافق مع المواد المذابة مع معدلات تصفية كلوية أكبر من تدفق البلازما الكلوية.

وتجدر الإشارة إلى أن المركبات ذات القيم الكتلية المقابلة للعديد من هذه الميزات لا يمكن العثور عليها في القوائم القياسية للمستقلبات البشرية. 7،8 وهذا يشير إلى أن العديد من المواد التي وفر لها التطور معدلات خلوص عالية لا يزال يتعين تحديدها. تضمنت المركبات التي تمكنا من تحديدها كبريتات الإندوكسيل وكبريتات p-cresol. هذه المركبات مشتقة من عمل بكتيريا الأمعاء ومن المعروف أن الأنابيب الكلوية تفرزها. تتراكم في البلازما عندما تفشل الكلى وقد تم أخذها مؤخرًا في الاعتبار على أنها سموم يوريمية. 14 ، 15. ، 16. ، 17. المركبات الأخرى التي تم تحديدها تتكون من ثلاثة أحماض ثنائية الكربوكسيل ، وستة أسيل جلايسينات ، واثنين من مستقلبات البيورين المستبدلة.

تم العثور على كل هذه المواد سابقًا في البول البشري والهيبورات وحمض الأديبيك وسينامويل جلايسين كما تم الإبلاغ عن تراكمها في بلازما مرضى الفشل الكلوي (http://www.hmdb.ca) .5 ، 13. ، 18. مثل كبريتات الإندوكسيل و p-cresol sulfate ، يتم إفراز الهيبورات و 3- hydroxy hippurate بواسطة الأنابيب الكلوية. 9،19 ولكن بقدر ما يمكننا اكتشافه ، فإن إمكانية إزالة الكلى تتجاوز تدفق البلازما الكلوية لم يتم النظر في أي من هذه المواد المذابة.

كما هو موصوف هنا ، يمكن للكلية تحقيق معدلات تصفية على تدفق البلازما الكلوية من خلال مزيج من الإفراز الأنبوبي وربط الذائبة القابل للانعكاس بسرعة لبروتينات البلازما. بالنسبة للمذابات التي تقتصر على البلازما وليست مرتبطة بالبروتين ، فإن الحد الأقصى للتخليص يساوي معدل تدفق البلازما الكلوي. ولكن بالنسبة إلى المواد المذابة المقيدة ، فإن الإفراز النشط يخفض تركيز البلازما المذاب الحر في الدم الذي يمر عبر الشعيرات الدموية المحيطة بالنبيب بعد أن يغادر الكبيبات بحيث يميل الجزء المرتبط من المذاب إلى الانفصال عن البروتينات الرابطة ويصبح متاحًا للإفراز.

إذا كانت شدة النقل الإفرازي في التجويف الأنبوبي كافية ، فإن كمية المذاب المفرز أكبر من تدفق البلازما الكلوي مضروبًا بالتركيز الحر في البلازما التي تدخل الشعيرات الدموية حول الأنبوب ، وسوف يرتفع الخلوص فوق معدل تدفق البلازما. التأثير الصافي هو تقليل تركيز المذاب غير المنضم في الدورة الدموية إلى مستوى أقل مما يمكن تحقيقه إذا تمت إزالة المذاب بالكامل من البلازما التي تمر عبر الكلى ولكن لم يكن مرتبطًا بالبروتين.

نظرًا لأنه التركيز الحر وغير المقيد للمواد المذابة التي تتعرض لها الأنسجة في جميع أنحاء الجسم ، فإن الجمع بين ارتباط البروتين والإفراز الأنبوبي يمكن أن يوفر ميزة تكيفية في إزالة مركبات النفايات السامة. في الأساس ، تسمح إضافة ارتباط البروتين القابل للانعكاس بالإفراز بتقليل المستوى الحر للمذاب دون زيادة تدفق الدم في الكلى وحجمه.

تم التعرف على قدرة الكلى على تقليل تركيز البلازما الحر للمذابات المقيدة إلى مستويات منخفضة جدًا من قبل مارشال الذي قدم أول عرض لا لبس فيه لإفراز المذاب بواسطة الأنابيب الكلوية. لم يقيس مارشال أي مواد مذابة طبيعية ولكنه افترض أن الخلوص المرتفع المحتمل لها بناءً على ملاحظة المعالجة الكلوية للفينول الأحمر ، وهو صبغة مرتبطة بالبروتين.

منذ ذلك الحين ، ومع ذلك ، تم تجاهل الميزة المحتملة لارتباط البروتين إلى حد كبير في الطب الكلوي ، وتم التعبير عن قيم التخليص لمذابات النفايات المقيدة وغير المقيدة من حيث الإجمالي بدلاً من تركيز البلازما المجاني الأكثر صلة. ومع ذلك ، كانت الممارسة المعيارية مختلفة في أدبيات علم الأدوية .21 مع العوامل الصيدلانية كما هو الحال مع المركبات الأخرى ، يكون الجزء الحر فقط من المذاب المرتبط نشطًا بيولوجيًا ، وبالتالي تم التعبير عن معدلات التخليص للمستحضرات الصيدلانية بشكل روتيني من حيث البلازما الحرة. تركيزات. ينتج عن الحساب من حيث التركيز الكلي قيمًا أقل ويقلل من قدرة الجسم على الحد من مستوى الذائبة الفعال والمجاني كما هو موضح في الجدول 2 والجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت.

السؤال الواضح لطب الكلى هو ما إذا كان الإفراز يمكن أن يستمر عندما ينخفض ​​الترشيح الكبيبي. كان الأمل القائم على الملاحظات المورفولوجية المبكرة بأن أعدادًا كبيرة من "الأنابيب الكبيبية" تستمر في العمل في المرضى الذين يعانون من مرض الكبيبات كانت مخيبة للآمال إلى حد كبير من خلال التحليلات اللاحقة. الدليل هو الأكثر شمولاً لإزالة شبه الأمينية هيبورات ، التي استخدمت منذ فترة طويلة كمقياس لتدفق البلازما الكلوية.

في المتوسط ​​، تنخفض إزالة الهيبورات شبه الأمينية بنسبة أقل قليلاً من معدل الترشيح الكبيبي ، مع تباين بين المرضى الفرديين وأمراض محددة. {3}} hydroxyindolacetate والعديد من المستحضرات الصيدلانية بما في ذلك المركبات المرتبطة بالبروتين مثل فوروسيميد .26. ، 27. ، 28. انخفاض مماثل في متوسط ​​التصفية الإفرازية لمذابات الإندوكسيل الداخلية المذابة بإحكام وكبريتات p-cresol بالتوازي مع GFR المقدرة تم وصفه مؤخرًا أيضًا في شكل مجرد .29 تركيزات البلازما المتزايدة كتطور لأمراض الكلى المزمنة لا تعمل على تمييز المركبات التي يتم تطهيرها عن طريق الإفراز من تلك التي يتم تطهيرها إلى حد كبير عن طريق الترشيح. تمت دراسة الأسئلة الأكثر دقة ، مثل مدى تأثر مستويات المذاب المفرز بالتنافس على جزيئات النقل وجزيئات نقل التعبير المتغيرة أثناء تطور مرض الكلى ، بشكل أقل دقة.

يتمثل أحد نقاط الضعف في قياس الطيف الكتلي غير المستهدف في أنه لا يوفر قياسًا دقيقًا للكميات. تعمل تأثيرات المصفوفة على تغيير قوة الإشارات الأيونية من العينات الفردية ، خاصةً من عينات السوائل المختلفة. يجب اعتبار قيم التصفية في الجدول 1 ، والتي تستند إلى مناطق الذروة النسبية في كروماتوجرامس للبول والترشيح الفائق للبلازما ، تقريبية فقط. تم تطوير فحوصات LC / MS / MS كمية أكثر دقة لقياس تركيزات المواد المذابة المختارة التي تمكنا من الحصول عليها على حد سواء المعايير غير المسماة والمسمى بالنظائر.

أكدت هذه القياسات أن الخلوص لكل من hippurate و p-cresol sulfate و indoxyl sulfate كانت أعلى بكثير من تدفق البلازما الكلوي المقدر. يمكن أن تتناقض تصاريحهم مع فينيل أسيتيل الجلوتامين ، وهو مادة مذابة يتم إفرازها بشكل نشط ولكنها غير مرتبطة إلى حد كبير بحيث لا يمكن إلا أن تقترب إزالتها من تدفق البلازما الكلوية. من المعروف أن كبريتات الإندوكسيل وكبريتات p-cresol و 3- hydroxy hippurate و 1،3 و 7- ثلاثي ميثيل حمض البوليك و 1 7- حمض اليوريك ثنائي ميثيل يتم التعامل معها بواسطة ناقل الأنيون العضوي 1 و / أو 3 في النبيبات الكلوية القريبة ، وهياكل المواد المذابة الأخرى التي حددناها على أنها تمت إزالتها بكفاءة لجعلها مرشحة محتملة للنقل بنفس الآليات 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34. ومع ذلك ، فإن تحديد الناقلات التي تتعامل مع المواد المذابة ، سيتطلب دراسات في الخلايا أو الحيوانات المستزرعة التي تم فيها التلاعب بالنشاط الناقل وراثيًا.

يتم التأكيد على أن الكلى يتم تطهيرها من المواد المذابة الفردية من خلال العثور على مستويات عالية في مرضى الفشل الكلوي. من بين المركبات التي حددناها على أنها تحتوي على خلوص كلى أصلية أكبر من تدفق البلازما الكلوية ، تم الإبلاغ سابقًا عن ارتفاع تركيزات البلازما الكلية لهيبورات ، كبريتات بي كريسول ، كبريتات الإندوكسيل ، وحمض الأديبيك ، وسينامويل جلايسين في المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي .5. ، 13. ، 18. تظهر هذه الدراسة أيضًا أن المستويات الحرة من المواد المذابة المقيدة التي يتم تطهيرها بكفاءة بواسطة الكلية الأصلية يمكن أن ترتفع إلى مستويات عالية في المرضى الذين يخضعون لغسيل الكلى الذي يوفر التخليص عن طريق الانتشار السلبي.

من بين المركبات الـ 13 التي حددناها على أنها تحتوي على نسبة عالية من تصفيات الكلى الأصلية ، كانت المستويات المجانية للجميع باستثناء مركبين أكثر من 20- أضعاف المعدل الطبيعي في مرضى غسيل الكلى. الاستثناءات ، 1.3 ، 7- حمض يوريك ثلاثي الميثيل ، و 1 ، 7- حمض البوليك ثنائي ميثيل عبارة عن نواتج أيض الكافيين. 35 كان جميع الأشخاص الطبيعيين الذين يتناولون القهوة يشربون القهوة أو الشاي ، في حين كان المدخول بين مرضى غسيل الكلى يقتصر على كوب واحد من الشاي يوميًا لفرد واحد. بالإضافة إلى الاختلافات في الإنتاج ، يمكن أن يؤثر التصفية غير الكلوية وحجم توزيع المواد المذابة الفردية على درجة ارتفاع مستوياتها في مرضى غسيل الكلى.

ينبغي الاعتراف بالعديد من القيود. أولاً ، قائمة الميزات التي تتوافق مع المواد المذابة ذات معدلات التصفية الكلوية المرتفعة غير مكتملة بلا شك. أظهرت الدراسات السابقة أن عدد الميزات التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي يزداد عندما يتم فحص العينات باستخدام طرق كروماتوغرافيا وتأيين متعددة. من البلازما ولكن تم تحللها بعد ذلك في الكلى أو تغيرت قبل الإخراج في البول. أخيرًا ، ربما قمنا بحساب قيم التصفية المرتفعة بشكل خاطئ للمواد التي تفرز في البول بعد الإنتاج في الكلى.

باختصار ، تُظهر هذه الدراسة أن الجمع بين ارتباط البروتين بالإفراز الأنبوبي يسمح للكلى بإزالة النفايات المذابة بمعدلات تتجاوز تدفق البلازما الكلوية. وتشير إلى أن معدلات الإزالة المرتفعة هذه تتحقق لعدد كبير من المواد المذابة الطبيعية ، والتي لا يزال يتعين تحديد العديد منها كيميائيًا. يمكن أن يوفر التحليل الإضافي لمجموعة المواد المذابة التي تم تطهيرها بكفاءة بواسطة الكلى طريقًا لتحديد هذه السموم البوليسية.

المواد والأساليب

تم الحصول على عينات الدم في منتصف مجموعات البول الموقوتة بعد الصيام بين عشية وضحاها في خمسة مواضيع مع وظيفة كلوية طبيعية والتي لوحظت خصائصها في الجدول التكميلي S1 عبر الإنترنت. تم إجراء الدراسات من خلال إعلان مبادئ هلسنكي. تم نزع البروتين من البلازما باستخدام الميثانول (1: 3 حجم: المجلد) ، وتجفيفها ، وإعادة تكوينها في 90:10 مجلد: حجم ماء / أسيتونتريل إلى نصف التركيز الأصلي. تم الحصول على الترشيح الفائق باستخدام فواصل Nanosep 30K Omega (Pall ، Ann Arbor ، MI) ، وتجفيفها وإعادة تكوينها في 90:10 ماء / أسيتونيتريل إلى خمسة أضعاف التركيز الأصلي. تم تخفيف البول بالماء لتوفير تركيزات مذابة يمكن العثور عليها في تدفق البول من 100 مل / دقيقة ، وتجفيفها وإعادة تكوينها في 90:10 ماء / أسيتونتريل إلى ضعف تركيز العينة المخففة.

الجدول التكميلي 1.

تم إجراء الكروماتوغرافيا على نظام ACQUITY UPLC (ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس). من كل عينة ، تم تحميل 1 0 ul إلى عمود Kinetex XB-C 18 150 × 2.1 مم ، 1.7 ميكرومتر بحجم جسيم (Phenomenex ، Torrance ، CA) تم الحفاظ عليه عند 4 {{1 {{12} }}} درجة . كان تدفق الطور المتحرك 0.4 مل / دقيقة باستخدام 0.1 بالمائة من حمض الفورميك في الماء (أ) و 0.1 بالمائة حمض الفورميك في الأسيتونيتريل (ب) مع تدرج من 3 بالمائة ب إلى 25 بالمائة ب خلال 9 دقائق ، من 25 بالمائة ب إلى 100 بالمائة B إلى 15 دقيقة ، وتبقى عند 100 بالمائة B إلى 19 دقيقة والعودة إلى 3 بالمائة B إلى 21 دقيقة. تم إجراء MS على مطياف كتلة مداري نشط (Thermo Fisher ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) مع البيانات التي تم جمعها على مدى م / ع 70 إلى 800 عند 50 ، 000 عرض كامل بنصف الدقة القصوى باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI) ) مع مسبار ساخن (400 درجة). تمت معايرة MS في الوضع الإيجابي باستخدام محلول معايرة أيوني إيجابي ESI (بيرس ، روكفورد ، IL) LTQ قياسي (رباعي الأقطاب خطي) بمدى كتلة م / ض 138-1922. تم تمديد معايرة الأيونات السالبة إلى m / z 97 من النطاق الكتلي m / z 265–1980 لمحلول معايرة الأيونات السالبة LTQ ESI القياسي عن طريق شده بكبريتات p-cresol و indoxyl sulfate عند 3.3 ميكروغرام / مل ، والتي أنتجت أيونات معايرة إضافية من m / z 96.9601 (جزء كبريتات) ، m / z 187.0070 (p-cresol sulfate) ، و m / z 212.0023 (indoxyl sulfate).

كان القصد من تعديل مزيج المعايرة للسماح بدرجات أقل من 1 جزء في المليون في النطاق الكتلي لمعظم المواد المذابة التي تفرز في البول وبالتالي تقليل عدد التركيبات الأولية الممكنة. لتقليل تأثيرات انحراف الأداة ، تم تشغيل عينات من كل موضوع معًا في ثلاث نسخ ، وتم تشغيل عينات من جميع الموضوعات أولاً في الوضع السلبي ثم في الوضع الإيجابي.

تم استخدام برنامج MZmine v2.2 (معهد أوكيناوا للعلوم والتكنولوجيا ، أوكيناوا ، اليابان) لتحديد الميزات التي تتميز بوقت الاحتفاظ و m / z من كل تشغيل LC / MS وتعيين السعات لهذه الميزات بناءً على تكامل الأيون القيم الحالية .38 نظرًا لأن هدفنا كان تحديد المواد المذابة التي يتم تطهيرها من الكلية ، فقد اقتصر التحليل أيضًا على 754 أيونًا سالبًا و 1054 سمة أيونية موجبة بمتوسط ​​مساحة ذروة أكبر من 4000 في الدورات الثلاثية في الترشيح الفائق للبلازما لما لا يقل عن ثلاثة من خمسة موضوعات وأيضًا في بول ثلاثة على الأقل من خمسة موضوعات. تم تقدير معدلات التخليص لهذه الميزات 1808 من خلال مقارنة تركيزات الترشيح الفائق للبول والبلازما بتركيزات الكرياتينين.

بالنسبة إلى 1082 من ميزات 1808 ، كانت معدلات التخليص المقدرة أكبر من تصفية الكرياتينين بمعدل اكتشاف خاطئ قدره q.<0.05. This was considered evidence of tubular secretion. Chromatograms for 163 of the 1082 secreted features with clearance values more than sevenfold the creatinine clearance were examined manually. The cutoff of sevenfold was chosen to be well above the renal plasma flow, which is approximately fourfold the creatinine clearance and to include the feature identified as p-cresol sulfate for which a deuterated standard was available, allowing its high renal clearance to be confirmed by a more quantitative assay (below). Elimination of duplicates when features appeared in both positive and negative mode and of features considered to represent dimers, adducts, isotopes, or artifacts on manual review reduced the total number of features with estimated clearance rates greater than sevenfold the creatinine clearance to 90 as summarized in Supplementary Table S2 online. Compounds with m/z values corresponding to these features were identified using the Human Metabolome and Metlin Databases (http://www.hmdb.ca and http://metlin.scripps.edu/) and chemical standards were obtained as further summarized in Supplementary Table S2 online. 

لتأكيد الهويات الكيميائية ، تم تشغيل عينات البول المختارة والمعايير الكيميائية باستخدام نفس طريقة LC المقترنة بـ LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher) للميزات التي تظهر في الوضع السلبي وإلى مصيدة الأيونات LTQ XL (Thermo Fisher) للميزات التي تظهر بإيجابية وضع. تم تحديد التعريف الكيميائي عن طريق تطابق وقت الاستبقاء وكتلة الأيونات الرئيسية وطيف MS / MS (الجدول التكميلي S3 عبر الإنترنت). من بين 13 سمة تم تحديدها كيميائيًا ، كان متوسط ​​حجم الخطأ الجماعي المخصص للقمم المستخرجة بواسطة MZmine هو 0. 5 ± 0. 5 جزء في المليون ، مما يشجع الثقة في تعيين قيم الكتلة الصحيحة إلى الميزات غير المحددة المدرجة في الجدول التكميلي S2 عبر الإنترنت.

الجدول التكميلي 3.

تم أيضًا تحليل بلازما المعالجة المسبقة من ستة مرضى غسيل الكلى ومن ستة أشخاص عاديين تم تلخيص خصائصهم في الجدول التكميلي S1 عبر الإنترنت بواسطة مطياف الكتلة عالية الدقة كما هو موضح أعلاه. تم نزع البروتين وتجفيف وإعادة تكوين البلازما في حجم 90:10: حجم الماء / الأسيتونيتريل إلى ربع التركيز الأصلي لمرضى غسيل الكلى وإلى التركيز الأصلي للأشخاص العاديين. تم إعادة تكوين الترشيح الفائق في 90:10 ماء / أسيتونيتريل إلى التركيز الأصلي لمرضى غسيل الكلى وعشرة أضعاف التركيز الأصلي للأشخاص العاديين. تم حساب متوسط ​​مناطق الذروة للبلازما والترشيح الفائق التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج MZmine باستثناء قيم<4000 in duplicate runs of each sample. Peaks corresponding to solutes previously identified as having very high renal clearance values were identified by matching retention time and mass. Peaks corresponding to the 13 chemically identified features were reintegrated manually using Xcalibur Software (Thermo Fisher).

تم تقييم تركيزات كبريتات p-cresol و indoxyl sulfate و hippurate و phenylacetylglutamine في العينات العادية عن طريق تخفيف النظائر المستقرة LC / MC / MS باستخدام كبريتات p-cresol-d 8- (تم تصنيعه من p-cresol d8 ؛ 39 Cambridge Isotopes) و indoxyl -2 و 4،5،6 و 7- d 5- كبريتات (Isosciences) و N-benzoyl-d 5- جلايسين و N - ( phenyl-d 5- acetyl) -L-glutamine (كلاهما من نظائر C / D / N ، بوانت كلير ، كيبيك ، كندا) كمعايير داخلية. كان التحضير هو نفسه فيما عدا أنه تم إعادة تكوين العينات المجففة في الماء إلى ضعف التركيز المستخدم في التحليل غير المستهدف.

من كل عينة ، تم تحميل 1 0 ul من إلى Kinetex C 18 150 × 2.1 مم ، وتم الحفاظ على عمود حجم جسيم 1.7 ميكرومتر عند 3 0 درجة. تم ضبط تدفق المخزن المؤقت عند 0. 35 مل / دقيقة باستخدام 1 0 مليمول / لتر فورمات أمونيوم في الماء (أ) و 1 0 مليمول / لتر فورمات أمونيوم في ميثانول (ب) مع 5 بالمائة ب لمدة دقيقة واحدة ، من 5 بالمائة ب إلى 30 بالمائة ب إلى 6 دقائق ، سريعًا إلى 90 بالمائة ب إلى 8.5 دقيقة ، ثم نزولًا إلى 5 بالمائة ب إلى 13.5 دقيقة. تم إجراء MS على مطياف الكتلة Agilent 6430 Triple Quadrupole مع ESI في الوضع السلبي (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا). تم حساب تركيزات المذاب باستخدام برنامج الشركة المصنعة (MassHunter Quant ، Agilent Technologies). كانت انتقالات الأيونات المستخدمة في القياس الكمي هي m / z 187.0 → 107.0 لكبريتات p-cresol ، m / z 212.0 → 80.0 لكبريتات الإندوكسيل ، m / z 178.1 → 134.2 للهيبورات ، و m / z 263.2 → 145.1 لـ phenylacetylglutamine مع التحولات المقابلة لـ المعايير الداخلية المتحللة. كانت عمليات الاسترداد لكبريتات p-cresol و indoxyl sulfate و hippurate و phenylacetylglutamine 100 ± 4 و 114 ± 6 و 93 ± 3 و 105 ± 3 بالمائة للكواشف المضافة إلى الترشيح الفائق للبلازما ، 93 ± 7 ، 108 ± 25 ، 107 ± 6 ، و 95 ± 4 في المائة للكواشف المضافة إلى البلازما ، و 91 ± 17 ، و 105 ± 12 ، و 95 ± 15 ، و 102 ± 14 في المائة للكواشف المضافة إلى البول لتحقيق تركيزات مماثلة لتلك الموجودة في المواد التجريبية. تم فحص الكرياتينين واليوريا في المختبر السريري.

إحصائيات

تمت مقارنة معدلات التخليص لميزات 1808 المكتشفة في البول وفي الترشيح الفائق للبلازما مع معدلات تصفية الكرياتينين في كل موضوع عن طريق اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون باستخدام SAS Enterprise Guide 4.3 وتم إجراء مقارنات غير زوجية بين قيم مرضى غسيل الكلى والأشخاص العاديين باستخدام Mann - اختبار ويتني U باستخدام SPSS V20. ثم تم حساب معدلات الاكتشاف الخاطئ باستخدام Q-VALUE.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور أندريس مارتينيز من جامعة ولاية كاليفورنيا للفنون التطبيقية ، سان لويس أوبيسبو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، على تخليق كبريتات بي كريسول المبللة ، وموظفي مختبر قياس الطيف الكتلي لمؤسسة فنسنت كوتس في جامعة ستانفورد لمساعدتهم في التحليلات ، و د. جيني شين من جامعة ستانفورد للمساعدة في الإحصاء. تم دعم TLS من قبل زمالة Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation NKF لدراسة Uremia. تم تقديم دعم آخر من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21DK84439 و RO1 DK80123 إلى TWM و RO1 DK80123 إلى THH).

مواد تكميلية

الجدول S1. خصائص الأشخاص الطبيعيين ومرضى غسيل الكلى.

الجدول S2. من المحتمل أن تمثل ميزات مقياس الطيف الكتلي المواد المذابة التي يتم تطهيرها بكفاءة بواسطة الكلى وتراكمها في مرضى غسيل الكلى.

الجدول S3. مقياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) للسمات المحددة كيميائياً على أنها مواد مذابة تمت إزالتها بكفاءة بواسطة الكلية.

مراجع

1. Vanholder R ، أبو ضيف O ، Argiles A ، وآخرون. دور EUTox في اليوريميأبحاث السموم. ندوة الاتصال 2009 ؛ 22: 323 - 328.

2. Meyer TW، Sirich TL، Hostetter TH. لا يمكن جرعات غسيل الكلى. سيمين الطلب2011; 24: 471–479.

3. ماير TW ، Hostetter TH. تبولن الدم. إن إنجل جي ميد 2007 ؛ 357: 1316-1325.

4. Niwa T. تحديث لبحوث السموم اليوريمي عن طريق قياس الطيف الكتلي. ماس سبيكتروم القس 2011 ؛ 30: 510-521.

5. Rhee EP ، Souza A ، Farrell L ، et al. يحدد التنميط المستقلب علامات التبول في الدم. J آم سوك نفرول 2010 ؛ 21: 1041-1051.

6. Sato E و Kohno M و Yamamoto M et al. التحليل الأيضي للبلازما البشرية من مرضى غسيل الكلى. Eur J Clin Invest 2011 ؛ 41: 241-255.

7. Wishart DS ، Knox C ، Guo AC ، وآخرون. HMDB: قاعدة معرفية عن المستقلب البشري. الأحماض النووية ريس 2009 ؛ 37: D603 – D610.

8. Smith CA ، O'Maille G ، Want EJ et al. METLIN: قاعدة بيانات طيفية كتلة مستقلب. ثير دروغ مونيت 2005 ؛ 27: 747-751.

9. Zimmerman L، Jornvall H، Bergstrom J. Phenylacetylglutamine and hippuric acid in uremic and health members. نفرون 1990 ؛ 55: 265 - 271.

10. Guo K و Peng J و Zhou R et al. تجزئة كروماتوجرافيا سائلة بمرحلة عكسية مقترنة بالأيونات بالاقتران مع وضع العلامات النظيرية على مقياس الطيف الكتلي للسائل الكروماتوجرافي السائل ذي الطور العكسي من أجل تحديد ملامح أيضية شاملة. ي تشروماتوجر أ 2011 ؛ 1218: 3689 - 3694.

11. Roux A ، Xu Y ، Heilier JF ، وآخرون. شرح توضيحي لعملية الأيض البولي لدى البالغين وتحديد المستقلب باستخدام كروماتوجرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بمطياف كتلة خطي رباعي الأيونات - Orbitrap. الشرج كيم 2012 ؛ 84: 6429 - 6437.

12. تشانغ تي ، كريك دي جي ، باريت إم بي ، وآخرون. تقييم الطور المعكوس للاقتران ، الطور الطبيعي المائي ، والكروماتوجرافيا السائلة للتفاعل المحب للماء مع مطياف الكتلة Orbitrap للدراسات الأيضية للبول البشري. الشرج كيم 2012 ؛ 84: 1994-2001.

13. Duranton F ، Cohen G ، De Smet R et al. التركيزات الطبيعية والمرضية للسموم اليوريمية. J آم سوك نفرول 2012 ؛ 23: 1258-1270.

14. Wikoff WR ، Anfora AT ، Liu J et al. يكشف تحليل الأيض عن التأثيرات الكبيرة لنبات الأمعاء الدقيقة على مستقلبات الدم في الثدييات. بروك ناتل أكاد سسي USA 2009 ؛ 106: 3698-3703.

15. Evenepoel P ، Meijers BK ، Bammens BR et al. السموم اليوريمية الناشئة عن التمثيل الغذائي الجرثومي القولون. ملحق Int الكلى 2009 ؛ 76: S12 – S19.

16. Schepers E ، Glorieux G ، Vanholder R. القناة الهضمية: العضو المنسي في بولينا الدم؟ بوريف الدم 2010 ؛ 29: 130-136.

17. ماير تي دبليو ، Hostetter TH. المذاب اليوريمي من ميكروبات القولون. الكلى الدولية 2012 ؛ 81: 949-954.

18. Aronov PA ، Luo FJ ، Plummer NS et al. مساهمة القولون في المذابات اليوريمية. J آم سوك نفرول 2011 ؛ 22: 1769-1776.

19. سميث إتش دبليو ، فينكلستين إن ، أليمينوسا إل وآخرون. التصفيات الكلوية لمشتقات حمض الهيبوريك البديلة والأحماض العطرية الأخرى في الكلاب والإنسان. ياء كلين إنفست 1945 ؛ 24: 388-404.

20. مارشال EK الابن محاضرتان في فسيولوجيا الكلى. عالم وظائف الأعضاء 1966 ؛ 9: 367-384.

21. بينيت إل زد ، هونر با. التغييرات في بروتين البلازما لها صلة سريرية قليلة. كلين فارماكول ثير 2002 ؛ 71: 115-121.

22. أوليفر ج. بنية الكلى في مرض بريث المزمن. بول هوبر: نيويورك ، 1939.

23. ماير TW. الإصابة الأنبوبية في مرض الكبيبات. الكلى الدولية 2003 ؛ 63: 774-787.

24. برادلي سي ، برادلي جي بي ، تايسون سي جيه وآخرون. وظيفة الكلى في أمراض الكلى. Am J Med 1950 ؛ 9: 766-798.

25. Bricker NS ، Klahr S ، Lubowitz H et al. وظيفة الكلى في أمراض الكلى المزمنة. الطب (بالتيمور) 1965 ؛ 44: 263-288.

26. Igarashi P ، Gulyassy P ، Stanfel L ، et al. هيبورات البلازما في الفشل الكلوي: طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء والتطبيق السريري. نفرون 1987 ؛ 47: 290 - 294.

27. Hannedouche T، Laude D، Dechaux M et al. البلازما 5- هيدروكسي إندول حمض الخليك كمؤشر داخلي لتدفق البلازما الكلوية. الكلية الدولية 1989 ؛ 35: 95-98.

28. Voelker JR ، Cartwright-Brown D ، Anderson S ، وآخرون. مقارنة الحلقة

مدرات البول في مرضى القصور الكلوي المزمن. الكلية الدولية 1987 ؛ 32: 572-578.

29. Meijers B ، Viaene L ، Poesen R. معدل الترشيح الكبيبي المقدر هو علامة جيدة للتصفية الكلوية لكبريتات الإندوكسيل وكبريتات p-cresyl PO384 ASN Kidney Week 2012.

30. Enomoto A ، Takeda M ، Taki K ، وآخرون. تفاعلات الأنيون العضوي البشري وكذلك ناقلات الكاتيون مع كبريتات الإندوكسيل. يور J فارماكول 2003 ؛ 466: 13-20.

31. سوجاوارا إم ، موتشيزوكي تي ، تاكيكوما واي وآخرون. علاقة تقارب البنية في تفاعلات ناقل الأنيون العضوي البشري 1 مع الكافيين ، الثيوفيلين ، الثيوبرومين ، ومستقلباتها. Biochim Biophys Acta 2005 ؛ 1714: 85-92.

32. Anzai N، Kanai Y، Endou H. Organic anion transporter family: المعرفة الحالية. ي فارماكول سسي 2006 ؛ 100: 411-426.

33. Miyamoto Y ، Watanabe H ، Noguchi T et al. تلعب ناقلات الأنيون العضوية دورًا مهمًا في امتصاص p-cresyl sulfate ، وهو سم يوريمي ، في الكلى. زرع الكلى 2011 ؛ 26 (): 2498-2502.

34. Wikoff WR ، Nagle MA ، Kouznetsova VL et al. تحدد الأيضات غير المستهدفة المستقلبات المعوية والسموم اليوريمية المفترضة كركائز لناقل الأنيون العضوي 1 (Oat1). J بروتيوم ريس 2011 ؛ 10: 2842-2851.

35. Tang-Liu DD ، Williams RL ، Riegelman S. التخلص من الكافيين ومستقلباته في الإنسان. J فارماكول إكس ثير 1983 ؛ 224: 180-185.

36. Psychogios N ، Hau DD ، Peng J et al. مستقلب المصل البشري. بلوس وان 2011 ؛ 6: e16957.

37. Nordstrom A، Want E، Northen T et al. إستراتيجية قياس الطيف الكتلي للتأين المتعدد المستخدمة للكشف عن مدى تعقيد عمليات التمثيل الغذائي. الشرج تشيم 2008 ؛ 80: 421 - 429.

38. Pluskal T ، Castillo S ، Villar-Briones A et al. MZmine 2: إطار معياري لمعالجة بيانات الملف الجزيئي القائمة على قياس الطيف الكتلي وتصورها وتحليلها. المعلوماتية الحيوية BMC 2010 ؛ 11:395.

39. Feigenbaum J ، Neuberg C. طريقة مبسطة لتحضير استرات حمض الكبريتيك العطرية. J آم كيم سوك 1941 ؛ 63: 3529-3530. 590 Kidney International (2013) 84، 585-590 cl I n I nvest I gat I on TL Sirich et al: المذابات التي تم تطهيرها بكفاءة عالية

For more information:1950477648@gmail.com