تعمل السكريات قليلة التعدد على تحسين إصابات الكلى الحادة عن طريق تخفيف مجموعة التمايز 44-الاستجابات المناعية الوسيطة في الخلايا الأنبوبية الكلوية

خلاصة:إصابة الكلى الحادة (AKI)هي حلقة مفاجئة منتلف الكلىوالذي يحدث عادة عند المرضى الذين يدخلون المستشفيات. حتى الآن، لم يتم تطوير علاج مثالي للحد منهخطورة AKI. أوليجو فوكويدان(FC) يتداخل مع مجموعة بروتين سطح الخلية الأنبوبية الكلوية للتمايز 44 (CD44) لمنع التليف الخلالي الكلوي؛ ومع ذلك، فإن تأثير oligosaccharides على AKI لا يزال مجهولا. في هذه الدراسة، تم اختيار FC، galacto-oligosaccharide (GOS)، و fructo-oligosaccharide (FOS) للتحقيق في تأثير oligosaccharides على AKI. لقد ثبت أن جميع السكريات الثلاثة يتم امتصاصها جزئيًا بواسطة الأمعاء. لقد وجدنا أن السكريات قليلة السكاريد تقلل من إنتاجية CD44 اعتمادًا على الجرعة وتثبط التعبير الناجم عن نقص الأكسجة لـ CD44 وphospho-JNK وMCP-1 وIL-1 وTNF- في NRK-52E الخلايا الأنبوبية الكلوية. وفي الوقت نفسه ، قلل ترنسفكأيشن CD44 siRNA ومثبط JNK SP600125 من التعبير الناجم عن نقص الأكسجة للفوسفو-JNK والسيتوكينات. يجند يجند CD44، الهيالورونان، يقاوم تأثير قليلات السكاريد على CD44 والفوسفو-JNK. في يومين بعد الجراحة بسبب إصابة نقص التروية وإعادة ضخ الدم، قللت السكريات من التهاب الكلى والكرياتين في الدم وMCP-1 وIL-1 وTNF- في الفئران AKI. في 7 أيام بعد الجراحة، تم تعزيز تعافي الكلى. تشير هذه النتائج إلى أن FC وGOS وFOS تمنع سلسلة CD44/JNK الناجمة عن نقص الأكسجة والسيتوكينات في الخلايا الأنبوبية الكلوية، وبالتالي تحسين AKI والتهاب الكلى في الفئران AKI. لذلك،مكملات قليل السكاريدهي استراتيجية رعاية صحية محتملة للمرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتويدي.

الكلمات الرئيسية: إصابة الكلى الحادة; مجموعة التمايز 44؛ الفركتو-أوليغوساكاريد. غالاكتوليجوساكتشاريد. قليل الفوكويدان. اشتعال

1. مقدمة

إصابة الكلى الحادة(AKI) يتميز بانخفاض مفاجئ في معدل الترشيح الكبيبي وما يترتب على ذلك من زيادة في الكرياتينين في الدم. وهذا الضرر شائع لدى المرضى الذين يدخلون المستشفيات ووحدات العناية المركزة، وخاصة كبار السن. إن نقص التروية والإنتان والسمية الكلوية هي الأسباب الرئيسية للقصور الكلوي الحاد التي غالبًا ما تتواجد معًا، وبالتالي تعقد التشخيص والعلاج [1]. يعرض التهاب المفاصل الروماتويدي الشديد المرضى الذين خرجوا من المستشفى لخطر الأحداث السلبية، مثل أمراض الكلى المزمنة، وأحداث القلب والأوعية الدموية، والسرطان، والالتهابات [2]. يتطور التهاب المفاصل الروماتويدي سريعًا، ولا يتوفر علاج فعال لتجنبه أو تقليل خطورته. تناول عناصر غذائية محددة يمكن أن يقلل من الإصابة الأنبوبية الكلوية في التهاب المفاصل الروماتويدي [3]. ولذلك، فإن دراسة تأثير التغذية المحددة على التهاب المفاصل الروماتويدي ستساعد في تحسين التهاب المفاصل الروماتويدي والمخاطر المصاحبة التي يواجهها المرضى الذين خرجوا من المستشفى.

الالتهاب وتجنيد الكريات البيضهم الوسطاء الرئيسيون لـ AKI. يتم إنتاج الكلى، وخاصة الخلايا الأنبوبية الكلويةالسيتوكينات الالتهابيةخلال AKI، مثل IL-1، IL-6، بروتين الجاذب الكيميائي أحادي الخلية -1 (MCP -1)، وعامل نخر الورم- (TNF- ) [4،5] . هذه السيتوكينات تحفز أيضًا الالتهاب الجهازي وتجنيد الكريات البيض. على الرغم من أن العديد من مجموعات الكريات البيض الفرعية تمارس تأثيرات وقائية على القصور الكلوي الحاد (مثل الخلايا التنظيمية التائية)، فإن معظم العدلات والخلايا الوحيدة والخلايا الجذعية تكون ضارة بتعافي القصور الكلوي الحاد [6]. الالتهاب الجهازي يضر أيضًا بالتعافي من التهاب المفاصل الروماتويدي بسبب ارتفاع مستويات السيتوكينات [7]. من بين السيتوكينات التي تفرزها الكلى، يعد MCP-1 مسؤولًا بشكل رئيسي عن تجنيد كريات الدم البيضاء، ويستجيب للسيتوكينات المختلفة، بما في ذلك IL-1 وTNF- [8,9]، ويلعب دورًا مهمًا في التسبب في المرض. إصابات الكلى المختلفة [10]. في الخلايا الأنبوبية القريبة البشرية HK -2، يتم التوسط في تعبير MCP -1 الناجم عن نقص الأكسجة بواسطة مسار c-Jun NH 2- كيناز طرفي (JNK) [11]. ويشارك مسار p38 أيضًا في تعبير MCP -1 الناجم عن الألبومين في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية [12]. ولذلك، فإن تنظيم مسارات JNK وp38 قد يؤثر على الالتهاب وتجنيد الكريات البيض في AKI.

السكريات قليلة التعدد هي بوليمرات سكرية تحتوي على 3-10 سكريات أحادية غير قابلة للهضم وتشكل مكونًا رئيسيًا في إجمالي البريبايوتك المتاح كإضافات غذائية [13]. يتم تخمير معظم سكريات الفركتو-أوليجوساكاريدس (FOSs) التي يتم تناولها في جسم الإنسان بالكامل بواسطة نباتات القولون، ويتم استرداد جزء صغير منها في البول [14]. يمكن امتصاص الجالاكتو-أوليجوساكاريدس (GOSs) في الدم ثم إخراجها في البول [15]. وينطبق نفس الوضع على الفوكويدان في الطحالب البحرية البنية [16]. يمكن أن تؤثر السكريات قليلة التعدد الممتصة على التفاعلات الكيميائية الحيوية والتعرف على الخلايا [17]. تكشف دراستنا السابقة أن قليل الفوكويدان (FC) يتداخل مع التفاعل بين بروتين سطح الخلية الأنبوبية الكلوية CD44 وروابطه خارج الخلية، وبالتالي يمنع التليف الخلالي الكلوي [18]. التفاعل بين CD44 وروابطه خارج الخلية يعزز مسار إشارات JNK [19]. لذلك، فإن تناول قليلات السكاريد يوميًا قد يقلل من التهاب الكلى لدى المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتويدي. ومع ذلك، فإن تأثير هذه البوليمرات على AKI لا يزال غير معروف. بحثت هذه الدراسة في تأثير FC وFOS وGOS على الخلايا الأنبوبية الكلوية المعالجة بنقص الأكسجة وفئران AKI المصابة بإصابة بنقص التروية وضخه (IRI). أظهرت النتائج أن السكريات الثلاثة تثبط الاستجابات المناعية الكلوية المتواسطة بالقرص المضغوط 44- وتقلل من شدة ما بعد القصور الكلوي الحاد. ولذلك، فإن استخدام هذه البوليمرات كمكمل غذائي يمثل استراتيجية جديدة لعلاج التهاب المفاصل الروماتويدي

2. المواد والأساليب

2.1. مواد

تم الحصول على FOS (متوسط ​​درجة البلمرة <1 0)، GOS (متوسط ​​درجة البلمرة <8)، وFC (متوسط ​​درجة البلمرة <5) من Sigma-Aldrich (St. Louis، MO، USA، Cat. رقم F8052)، Carbosynth (بيركشاير، المملكة المتحدة، Cat. رقم OG32134)، وHi-Q Marine Biotech International (تايبيه، تايوان)، على التوالي. تم إذابة السكريات قليلة التعدد في H2O المقطر المزدوج وتم ترشيحها باستخدام مرشحات معقمة بحجم 0.22 ميكرومتر (Merck Millipore، Darmstadt، Germany). تم الحصول على الهيالورونان (HA) وجميع المواد الكيميائية الأخرى ذات الدرجة الكاشفة من سيجما. الأجسام المضادة ضد JNK (sc-7345)، phospho-JNK (sc-6254)، MCP-1 (sc-52701)، IL-1 (sc{{17 }})، وTNF- (sc -52746) من شركة Santa Cruz Biotechnology (دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على الأجسام المضادة ضد p38 (9212) و phospho-p38 (9211) من تقنية تشوير الخلية (Danvers، MA، USA). تم شراء الأجسام المضادة ضد Ly6G (ab25377) وF4/80 (ab100790) من Abcam (كامبريدج، المملكة المتحدة). تم شراء الأجسام المضادة ضد HIF -1 (NB 100-105) من Novus Biologicals (Centennial، CO، USA).

2.2. ثقافة الخلية

تم شراء الخلايا الأنبوبية الكلوية القريبة من الفئران (NRK-52E) وخط بلاعم الفأر RAW264.7 من معهد أبحاث وتطوير صناعة الأغذية (هسينشو، تايوان)؛ مثقف في DMEM تستكمل بمحلول مضاد حيوي/مضاد للفطريات و 10% مصل العجل الجنين؛ ويحفظ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ورطوبة 95% في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد الوصول إلى التقاء 70%، تم زراعة الخلايا في وسط خالي من المصل واحتضانها طوال الليل قبل التجربة. بالنسبة لتجربة نقص الأكسجة، تم إيداع خلايا NRK-52 E وAnaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America، نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) في جرار مستطيلة (Mitsubishi Gas Chemical America)، وتم وضع الإعداد بالكامل في 37 ◦C الحاضنة لمدة 4 ساعات. ثم تم تربيتها الخلايا بين عشية وضحاها في ظل الظروف العادية.

2.3. تحليل لطخة غربية

باختصار، تم تطبيق 15 ميكروغرام من محللة البروتين NRK-52E على كل حارة، وتم تحليل النتائج بواسطة اللطخة الغربية. تم قياس مستويات نطاق البروتين النسبي من خمس تجارب مستقلة بواسطة برنامج Quantiscan من Biosoft (كامبريدج، المملكة المتحدة).

2.4. التدخل القصير (si) RNA ترنسفكأيشن من CD44

تم شراء الفئران CD44 siRNA (4390771) من Thermo Scientific (Waltham، MA، USA). بعد النمو إلى 70٪ من التقاء، تم نقل الخلايا باستخدام سيرنا باستخدام كاشف ترنسفكأيشن Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) وفقًا لتعليمات المصنع.

2.5. فحص تكاثر الخلايا

بعد زراعة خلايا NRK -52E ناقصة التأكسج لمدة 24 ساعة، تم استخدام نفس الوسيط لزراعة خلايا RAW264.7 في صفيحة بئر 96- (2000 خلية/بئر). بعد 24 ساعة من الحضانة، تم تحليل تكاثر خلايا RAW264.7 باستخدام مجموعة الفحص SRB (Abcam، Cat. رقم ab235935) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

2.6. اختبارات استضد CD44

تم الحصول على الفئران المؤتلفة CD44 من R&D Systems (Minneapolis، MN، USA، Cat. No. 6577-CD) وتم استخدامها لإنتاج تفاعل ربط مع HA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تم خلط 20 نانوغرام/مل من الفئران المؤتلفة CD44 مع تركيزات مختلفة من FC أو FOS أو GOS لمدة 10 دقائق للتحقيق في تأثير السكريات قليلة التعدد على مولد الضد CD44. تم تحليل الخلائط باستخدام مجموعة CD44 ELISA (Abcam، Cat. رقم ab213928) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

2.7. حيوانات التجارب والكلى IRI

تم شراء الفئران الذكور 129S1 / SvImJ البالغة من العمر ثمانية أسابيع من Lasco Technology (تايبيه، تايوان). تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة جامعة تايبيه الطبية لرعاية واستخدام الحيوانات التجريبية (رقم الموافقة LAC-2019-0511) وتم تشكيلها بواسطة دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. لتحريض IRI، تم تعريض الفئران (التي تزن 21-23 جم) لقط عنيق كلوي ثنائي لمدة 30 دقيقة عن طريق إجراء شق في الخاصرة [20]. تم تخدير الفئران عن طريق التخدير المستنشق مع الأيزوفلورين قبل الجراحة. خضعت الفئران التي تديرها الشام لعملية مماثلة، باستثناء لقط عنيقات الكلى. تم تغذية جميع الفئران بالسكريات قليلة التعدد من خلال أنبوب فموي من يوم واحد قبل إلى يومين بعد جراحة IRI. تم تقسيم الفئران التجريبية إلى المجموعات الخمس التالية مع n=8 للنتائج في اليوم الثالث واليوم السابع: (1) مجموعة صورية؛ (2) مجموعة آكي؛ (3) مجموعة AKI التي تم تغذيتها بـ FC (10 مجم / كجم / يوم)؛ (4) مجموعة AKI التي تم تغذيتها بـ FOS (10 مجم / كجم / يوم)؛ و (5) مجموعة AKI التي تم تغذيتها بـ GOS (10 مجم / كجم / يوم). تم التضحية بالفئران بعد 3 أو 7 أيام من الجراحة، وتم جمع الدم وتحليله باستخدام محلل كيميائي حيوي ومجموعات ELISA. تم تحليل مستوى الكرياتينين في الدم لكل فأر لتقييم تطور التهاب المفاصل الروماتويدي. تم فحص مورفولوجيا الكلى عن طريق تلطيخ حمض شيف (PAS) الدوري وتلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) في أقسام البارافين الثابتة الفورمالين 2 ميكرون.

2.8. تلطيخ الكيمياء المناعية

تم إصلاح أنسجة الكلى باستخدام بارافورمالدهيد مخزن بنسبة 4٪، مضمن في البارافين، ومقطع إلى أقسام 2 ميكرون للتلوين باستخدام مجموعات UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific، Fremont، CA، USA) والتهجين مع الجسم المضاد الرئيسي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. .

2.9. تلطيخ PAS

تم تلطيخ أقسام الكلى باستخدام PAS Stain Kit (Abcam، Cat. رقم ab150680) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

2.10. فحص إليسا

تم جمع وتحليل الوسط المزروع لخلايا NRK-52E وعينات مصل الفئران التجريبية باستخدام مجموعة ELISA MCP-1 (Abcam, Cat. No. ab208979) وIL-1 مجموعة ELISA (Abcam، Cat. رقم ab197742). تم تحليل عينات المصل أيضًا باستخدام مجموعة TNF-ELISA (R&D Systems، Cat. No. MTA 00 B) ومجموعة ELISA المرتبطة بالجيلاتيناز (NGAL) (R&D Systems، Cat. No. MLCN20) بواسطة تعليمات الشركة المصنعة.

2.11. الاختبارات الإحصائية

تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين باستخدام اختبار الطالب. واعتبرت الاختلافات كبيرة بالنسبة للقيم p<0.05

3. النتائج

3.1. تمنع السكريات قليلة الزيادة في CD44 والسيتوكينات في خلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج

تمت مراقبة تعبير CD44 في خلايا NRK-52E المعالجة بـ FC وFOS وGOS لأول مرة لتقييم تأثير السكريات قليلة التعدد على الخلايا الأنبوبية الكلوية. تم تثبيط تعبير CD44 الناجم عن نقص الأكسجة بواسطة السكريات الثلاثة في نطاق 0.05–0.5 ملغم / مل (الشكل 1A). ولذلك، تم استخدام جرعة قليل السكاريد من 0.1 ملغم/مل في تجارب الخلايا التالية. في النظام المُجهز، أدى علاج نقص الأكسجة بشكل ملحوظ إلى التعبير عن علامة نقص الأكسجة HIF -1 في خلايا NRK -52 E، مما يشير إلى أن الخلايا كانت في حالة نقص الأكسجة (الشكل 1B). ينظم نقص الأكسجة مستويات JNK المفسفرة، وMCP-1، وIL-1، وTNF- ولكن ليس في الخلايا المعالجة بالسكريات قليلة التعدد (الشكل 1B، C). زاد تعبير JNK في خلايا نقص الأكسجين ولكن ليس في الخلايا المعالجة بـ FC أو FOS. لم يؤثر GOS على تعبير JNK في خلايا نقص الأكسجين ولكنه قام بقمع تنظيم JNK المفسفر. لذلك، يمكن أن تمنع السكريات قليلة التعدد نقل إشارات JNK الناجم عن نقص الأكسجة وتعبير السيتوكينات في الخلايا الأنبوبية الكلوية. على الرغم من أن FC و GOS قاما بتنظيم phos phorylated p38 في خلايا نقص الأكسجين، فإن التعبير عن هذا البروتين لم يزد في خلايا نقص الأكسجين. تشير هذه النتيجة إلى أن p38 لا يلعب دورًا رئيسيًا في الاستجابات الناجمة عن نقص الأكسجة في خلايا NRK -52 E.

3.2. يلعب CD44 وJNK دورًا حاسمًا في زيادة السيتوكين في خلايا NRK ناقصة التأكسج -52 E

تأثر التعبير عن CD44 وJNK المفسفر والسيتوكينات في الخلايا الأنبوبية الكلوية بالسكريات قليلة التعدد، لكن ارتباطها لا يزال بحاجة إلى توضيح. للتحقيق في دور CD44 في نقل إشارات JNK وتعبير السيتوكين في الخلايا ناقصة التأكسج، تم نقل خلايا NRK -52 E بجرعات مختلفة من CD44 siRNA. قام CD44 siRNA عند 50 و 100 مساءً بحظر تعبير CD44 الناتج عن نقص الأكسجة بكفاءة وتثبيط الزيادة الناجمة عن نقص الأكسجة بشكل كبير في مستويات JNK المفسفرة، وMCP- 1، وIL-1، وTNF- (الشكل 2A). ارتبط تأثير حظر CD44 على تعبير JNK بجرعات سيرنا. تم تحفيز تعبير JNK في خلايا نقص الأكسجين بواسطة CD44 siRNA عند 50 مساءً ولكن تم تثبيته عند 100 مساءً. كلتا الجرعتين قمعت تنظيم JNK الفسفرة. قلل المثبط الانتقائي لـ JNK، SP600125، بشكل كبير من تعبير MCP-1، IL-1، وTNF- في خلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج (الشكل 2B). تشير هذه النتائج إلى أن التأثير المثبط لترنسفكأيشن CD44 سيرنا على السيتوكينات الناجمة عن نقص الأكسجة يعزى إلى انخفاض في JNK الفسفرة.

الشكل 1. التأثير المثبط للسكريات قليلة التعدد على نقل إشارة CD44 في خلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج. تمت معالجة الخلايا باستخدام FC أو FOS أو GOS لمدة 3 0 دقيقة ثم إخضاعها لثقافة نقص الأكسجين. تم تحليل تعبير البروتين عن طريق النشاف الغربي. (أ) آثار السكريات المعتمدة على الجرعة على تعبير CD44. (ب) تأثير السكريات قليلة التعدد على الإشارات ذات الصلة بالقرص المضغوط44-. تم ضبط تركيز قليل السكاريد على 0.1 مجم / مل. يتم أيضًا عرض الزيادات النسبية في نطاقات البروتين في شكل مخطط شريطي (C). يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± SD (ن=4).

الشكل 2. دور CD44 وJNK في الاستجابات الالتهابية الناجمة عن نقص الأكسجة في خلايا NRK-52E. تم تحليل التعبير البروتيني بواسطة لطخة غربية. (أ) التأثير المثبط لترنسفكأيشن CD44 سيرنا على JNK الفسفرة والسيتوكينات. (ب) التأثير المثبط لـ SP600125 على السيتوكينات. تمت معالجة الخلايا بـ 20 ميكرومتر SP600125 لمدة 30 دقيقة قبل علاج نقص الأكسجة. يتم أيضًا عرض الزيادات النسبية في نطاقات البروتين في شكل مخطط شريطي. يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± SD (ن=4).

3.3. إفراز السيتوكين الناجم عن نقص الأكسجة في الخلايا الأنبوبية الكلوية يعزز تكاثر البلاعم

الالتهاب هو وسيط للإصابة الكلوية في AKI. ومن ثم، تم فحص تأثير ركوب oligosaccha على الكريات البيض. يوضح الشكل 3A أن FC وFOS وGOS لم يؤثر على تكاثر خلايا البلاعم RAW264.7. تم تعزيز تكاثر خلايا RAW264.7 بواسطة وسط زراعة 24- ساعة لخلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج (الشكل 3B) ولكن ليس بواسطة وسط خلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج المعالجة بـ قليلات السكاريد. كان لدى الأول مستويات MCP -1 و IL -1 أعلى من الأخير (الشكل 3C، D). جميع السكريات الثلاثة قللت بشكل كبير من MCP -1 و IL -1 في وسط استنبات خلايا NRK -52 E ناقصة التأكسج. لذلك، يمكن لـ FC وFOS وGOS تقليل تعبير وإفراز السيتوكينات في الخلايا الأنبوبية الكلوية ناقصة التأكسج، وبالتالي تقليل الالتهاب الناجم عن الخلايا الأنبوبية الكلوية المصابة.