هشاشة العظام هي مشكلة صحية عامة رئيسية لسكان العالم الذين يتقدمون في السن بشكل متزايد

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:هشاشة العظام هي مشكلة صحية عامة مهمة في جميع أنحاء العالم ، مع هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث بسبب نقص هرمون الاستروجين مما أدى إلى ما يقرب من 3/4 حالات. في هذه الدراسة ، تم استئصال المبايض لـ 18 نعجة ميرينو ، و 10 كانت ضابطة. تمت معالجة ثلاثة من النعاج التي تم استئصالها أسبوعيًا بـ 400 مجم من ميثيل بريدنيزولون لمدة 5 أشهر ، وثلاث نعاج أسبوعيًا لمدة شهرين ، تليها فترة تعافي مدتها 3- شهر. في شهرين ، تم قتل خمسة حيوانات تحكم وستة حيوانات تم استئصال المبيض. في 5 أشهر ، تم قتل جميع النعاج المتبقية رحيمًا. تم جمع عينات الكلى بعد الوفاة لتحليل qPCR لـ NPT1 و PTH1R و NPT2a و NPT2c و Klotho و FGFR1Illc و VDR و CYP24A1 و CYP27B1 و TRPV5 و TRPV6 و CalD9k و CalD28k و PMCA و NCX1. كان لدى الأغنام التي تم استئصال المبيض لها تعبير VDR أكبر بكثير مقارنة بالمجموعات الأخرى. أظهرت الأغنام المبيضة التي تم استئصالها بالجلوكورتيكويدات لمدة شهرين متبوعة بالقتل الرحيم في 5 أشهر اختلافات معنوية في التعبير الجيني TRPV5 و CYP24A1 و klotho مقارنة بالمجموعات الأخرى. كانت الاختلافات في تعبير klotho أكثر وضوحا بعد التعديل للقياسات المتكررة (ص =0. 1). يُعرف كلوثو بهرمون "مكافحة الشيخوخة" ويشارك في استقلاب الكالسيوم والفوسفور. قد يشارك كلوثو في استعادة الكثافة المعدنية للعظام في الأغنام التي خضعت لاستئصال المبايض والتي عولجت بالكورتيكويدات السكرية لمدة شهرين متبوعًا بالقتل الرحيم عند 5 أشهر. يوصى بإجراء مزيد من البحث حول دور كلوثو.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

الكلمات الدالة:هشاشة العظام؛ خروف؛ فيتامين د الفوسفات. qPCR ؛ استقلاب الكالسيوم استقلاب الفوسفور كلوثو

1 المقدمة

ترقق العظام هو مشكلة صحية عامة رئيسية لسكان العالم الذين يتقدمون في السن بشكل متزايد ، حيث كلف الولايات المتحدة الأمريكية ما يقرب من 17 مليار دولار أمريكي في 205 ومن المتوقع أن ينمو إلى 25 مليار دولار أمريكي في عام 2025 [1 ، 2]. يُعزى حوالي 70-75 في المائة من عبء هشاشة العظام إلى هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث لدى النساء [1] ، وهشاشة العظام الأولية حيث يؤدي نقص هرمون الاستروجين إلى انخفاض تكوين العظام وزيادة ارتشاف العظام ، مما يؤدي إلى انخفاض كتلة العظام وهشاشة العظام [3] . قد تحدث هشاشة العظام أيضًا بشكل ثانوي لأسباب محددة ، مثل علاج الجلوكورتيكويد. تعتبر الأغنام نموذجًا حيوانيًا كبيرًا راسخًا لمختلف أمراض الهيكل العظمي البشري ، بما في ذلك هشاشة العظام [4]. تتمثل إحدى مزايا النموذج الحيواني الكبير ، مثل الأغنام ، في القدرة على اختبار غرسات العظام ، والتقنيات الجراحية ، والمواد الحيوية [4] بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأغنام منخفضة التكلفة نسبيًا ، وسهلة التعامل ، وتوفر مواد وفيرة للاختبار [4،5].

أكثر نماذج ترقق العظام شيوعًا لدى الأغنام هي الأغنام التي تم استئصال المبيض بعد العملية الجراحية لمدة 12 شهرًا والأغنام التي تم استئصال المبيض {2} شهرًا والتي تتبع نظامًا غذائيًا ينقصه الكالسيوم وفيتامين د نظرًا للجلوكوكورتيكويد [4]. باستخدام مجموعة من العوامل المعروفة المسببة لهشاشة العظام بما في ذلك استئصال المبيض ، وعلاج الجلوكورتيكويد ، واتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم ، تمكنا من إنشاء نموذج لهشاشة العظام في الأغنام في 5 أشهر فقط [6،7] ، وبالتالي تقليل السكن والعمل ، وتكاليف العلف المتضمنة في تطوير النموذج. في هذا النموذج ، وجد أن استئصال المبيض يزيد من تركيز مصل الببتيدات التيلوببتيدية الطرفية C من النوع الأول من الكولاجين (CTX-I ، علامة ارتشاف العظم) و osteocalcin (علامة دوران العظام) مقارنة مع الأغنام الضابطة. كانت الأغنام التي عولجت بالجلوكوكورتيكويد لمدة شهرين تحتوي على تركيزات أعلى من CTX-I في المصل وتراكيز أوستيوكالسين منخفضة في الدم. بالإضافة إلى ذلك ، كانت كثافة عظم الفخذ والعمود الفقري القطني والكثافة المعدنية للعظم الحجمي الكلي والتربيقي في القصبة القريبة أقل في المجموعات المعالجة تجريبياً مقارنة بمجموعات الضبط ، خاصةً بالنسبة للنعاج المعالجة بالجلوكورتيكويد التي تم استئصالها المبيض [6]. تم العثور أيضًا على استقلاب الأحماض الأمينية والدهون في الأغنام المعالجة بالجلوكوكورتيكويد والمبيضين.cistanche wirkungتم العثور على تغييرات مماثلة في نماذج أخرى لهشاشة عظام الأغنام [8].

يمكن للكيستانش مكافحة الشيخوخة

لم يتم استكشاف الجينات المستجيبة لفيتامين (د) ونظام الفوسفات سابقًا في نماذج الأغنام المبيضية. فيتامين د ، الذي 1 ، 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين د هو الشكل النشط ، يؤدي في النهاية إلى زيادة تركيز الكالسيوم والفوسفور المتأين في البلازما عن طريق الارتباط بمستقبلات فيتامين د (VDR) - مغاير مستقبلات الريتينويد X وتغيير تعبيرات العديد من الفيتامينات الجينات المستجيبة لـ D ، مثل البروتينات المرتبطة بالكالسيوم (calbindin D9 و 28k (CalD9k ، CalD28k)) وقنوات الكالسيوم (مستقبلات قناة الكاتيون المحتملة العابرة للفئة الفرعية V العضو 5 و 6 (TRPV5 ، TRPV6) ، غشاء البلازما الكالسيوم ATPase (PMCA) ، مبادل الصوديوم والكالسيوم 1 (NCX1) [9]. إنتاج 1 ، 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين د هو خطوة منظمة بإحكام ، حيث يحفز لو هيدروكسيلاز الكلوي (CYP27B1) تحويل 25- هيدروكسي فيتامين د إلى 1 ، 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين د والإنزيم 24- هيدروكسيلاز (CYP24A1) يكسر كل من 25- هيدروكسي فيتامين د و 1 ، 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين د إلى منتجات ثانوية غير نشطة.cistanche المملكة المتحدةيتحكم نظام الفوسفات أيضًا في تركيزات الفوسفور والكالسيوم في البلازما [10]. العمود الفقري في هذا النظام هو عامل نمو الأرومة الليفية 23 ، والذي يتم إنتاجه بواسطة الخلايا العظمية في العظام ويتحكم بشكل أساسي في تركيزات الفوسفور في البلازما من خلال الارتباط بالعامل المساعد كلوثو لتقليل التعبير عن ناقلات الفوسفات الصوديوم (NPT1 ، NPT2a ، NPT2c) [11]. نظرًا للتأثيرات المتداخلة لهرمون الغدة الجار درقية ، و 1 ، 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين د ، كان تحديد تأثيرات FGF23 على استقلاب الكالسيوم أمرًا صعبًا ، ولكن هناك أدلة تشير إلى أنه يمكن أن ينظم امتصاص الأمعاء للكالسيوم والكلى إعادة امتصاص الكالسيوم [12،13].

القشرانيات السكرية لها تأثيرات عديدة على استقلاب الكالسيوم والفوسفور ، بما في ذلك تثبيط امتصاص الكالسيوم في الأمعاء ، وانخفاض إعادة امتصاص الكالسيوم في الأنابيب الكلوية ، وانخفاض إعادة امتصاص الفوسفور الكلوي [14-16]. بالإضافة إلى ذلك ، فحصت القليل من الأبحاث تأثير نقص هرمون الاستروجين على الجينات المستجيبة لفيتامين د ونظام الفوسفات [17 ، 18].

أتاح هذا النظام الغذائي الذي يتم استئصاله المبيض ، والذي يحتوي على نسبة منخفضة من الكالسيوم ، ونموذج الأغنام المعالج بالجلوكوكورتيكويد الخاص بهشاشة العظام ، فرصة لإنتاج معلومات أولية عن آثار هذه العلاجات على التعبير عن الجينات المستجيبة للفوسفات والفيتامين د في كلى الأغنام. كانت أهداف هذه الدراسة ذات شقين: (1) تحديد ما إذا كان استئصال المبيض أو استئصال المبيض وعلاج الجلوكوكورتيكويد قد غير التعبير عن فيتامين د والجينات المرتبطة بالفوسفات في الكلى ؛ (2) تحديد العلاقات بين فيتامين د الكلوي والجينات المرتبطة بالفوسفات ، فيتامين د في الدم وعلامات دوران العظام في الدم (CTX-I و osteocalcin).

2. المواد والأساليب

وقد تم سابقًا نشر طرق تفصيلية لتطوير نموذج الأغنام المُستأصل المبيض والمعالج بالجلوكوكورتيكويد لهشاشة العظام [6]. باختصار ، تم توزيع نعجة ميرينو القديمة (7-9 عام ، ن =28) بشكل عشوائي في مجموعات: مجموعة التحكم (ن =10) التي تم استئصال المبيض (OVX) (ن=12) ، تم استئصال المبايض وعلاج الجلوكوكورتيكويد (40 مجم ميثيل بريدنيزولون عن طريق الحقن تحت الجلد) شهريًا لمدة شهرين متبوعًا بعدم العلاج لمدة 3 أشهر (ن =3) وعلاج الجلوكوكورتيكويد (400 مجم ميثيل بريدنيزولون) شهريًا لمدة 5 أشهر (ن =3) .بيوفلافونويدس الحمضياتتم إيواء الأغنام في حظيرة وتغذيتها إما بمجموعة تحكم (115 جم / كجم كالسيوم ؛ 2.2 جم / غنم يوميًا) أو منخفضة الكالسيوم (5 جم / كجم كالسيوم ؛ 1 جم / خروف يوميًا) علف الأغنام المركز بيليه [19]. متطلبات الصيانة للنعجة غير الحامل هي 1.2 غ / شاة في اليوم [19].

تم جمع عينات الدم عن طريق بزل الوريد الوداجي بعد شهرين و 5 أشهر من الجراحة. تم قياس أوستيوكالسين باستخدام مجموعة المقايسة المناعية Micro Vue Osteocalcin ، و CTX-I باستخدام مجموعة IDS Serum CrossLaps ELISA ، كما ورد سابقًا [6] تم قياس تركيزات الكالسيوم والفوسفور الكلي في المصل باستخدام القياس الطيفي على محلل الكيمياء السريرية AU680 (بريكمان كولتر ، بريكمان كولتر ، ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس تركيز المصل 25- هيدروكسي فيتامين د باستخدام مخطط كروماتوجرام سائل لتخفيف النظائر ؛ مطياف الكتلة في Endolab ، مختبرات Canterbury Health ، كرايستشيرش ، نيوزيلندا.

في أشهر ، تم قتل 5ewes من المجموعة الضابطة و 6 من مجموعة OVX ورحمة. في 5 أشهر ، تم قتل النعاج المتبقية أيضًا (المجموعة الضابطة n =5 ، OVX group n =6 ، OVX plus 2m glucocorticoids n =3 و OVX plus 5m glucocorticoids n =5 ) وتشريح. تم جمع عينات الكلى في غضون 30 دقيقة من الوفاة وتم تقسيمها إلى قسمين ، مع وضع عينة واحدة في الفورمالين المحايد المحايد بنسبة 10 بالمائة ومعالجتها للأنسجة ، وتم تجميد العينة الأخرى في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة -80 حتى معالجة الهيماتوكسيلين و تم فحص أقسام الكلية الملطخة باليوزين من قبل المؤلف الأساسي وأكد عدم وجود آفات كبيرة.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة ماسي (رقم الموافقة 14/103) وتم إجراؤها وفقًا لمدونة السلوك الأخلاقي لاستخدام الحيوانات الحية للبحث في جامعة ماسي ، بالمرستون نورث ، نيوزيلندا.

تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي و qPCR كما هو موضح سابقًا [2 0 ، 21]. باختصار ، تم استخدام Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc ، Merck KGaA ، Darmstadt ، Germany) لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تمت إزالة الحمض النووي الجينومي باستخدام Ambion Turbo DNA الخالي من (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس التألق Qubit 2. 0 ومجموعة الفحص واسع النطاق Qubit RNA (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي من خلال تحديد نسبة 260/280 والتشغيل على هلام الاغاروز. تم استخدام مجموعة التوليف الأولى للنسخة (كدنا) (روش) لتجميع (كدنا). احتوى كل مزيج من تفاعل 20 ميكرولتر على 600 نانوغرام من الحمض النووي الريبي ، و 2.5 ميكرومتر من أوليجو （dT） ، و 8 ميكرومتر من محلول رد الفعل RT ، و 1 ملي مولار من dNTP ، و 10 U من النسخ العكسي ، ومثبط 20 يو RNase ، وماء خالٍ من Rnase-Dnase. تم إجراء التفاعل عند 55 درجة لمدة 30 دقيقة ، و 85 درجة لمدة 5 دقائق ، ثم تم تبريده عند 4 درجات باستخدام Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء qPCR في الوقت الفعلي باستخدام جهاز PCR في الوقت الفعلي StepOne Plus (Applied Biosystems ، Thermo Fisher Scientific Inc ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). احتوى كل مزيج من PCR على 5 uL Power SYBR Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، بادئات أمامية وعكسية بتركيزات مدرجة في الجدول S1 ، 10 نانوغرام من cDNA ، ثم تتكون حتى 10 ميكرولتر مع RNase ، مياه خالية من DNase. يتكون بروتوكول PCR من 95 درجة لمدة 20 ثانية ، و 40 دورة عند 95 درجة و 60 درجة ، وأخيراً ، منحنى ذوبان يتراوح من 60 درجة إلى 95 درجة بمعدل تسخين 0.3 درجة / 15 ثانية. تم تضمين مزيج الماء والتفاعل بدون النسخ العكسي كعناصر تحكم سلبية في كل تشغيل PCR ، وتم تشغيل جميع العينات في نسختين. تم تقييم الجينات التالية: NPT1 و PTH1R و NPT2a و NPT2c و Klotho و FGFR1IIC و VDR و CYP24A1 و CYP27B1 و TRPV5 و TRPV6 و CalD9k و CalD28k و PMCA و NCX1. سبق أن وُجد أن PKG1 و SDHA يتم التعبير عنها بثبات في طفل الغنم [20] ، وتم تطبيع العينات بالنسبة للتعبير عن هذه الجينات وكفاءة الجينات باستخدام 2- طريقة AACt [22].

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام R Studio 1.3.1093 [23] مع إصدار R.

4. 0. 3 و tidyverse ، nlme 3. 1-150 وغاري

2.1.2 الحزم. تم تطبيق النماذج الخطية على بيانات تعبير طية الجينات المحولة log10. في النموذج الأول ، كان التعبير الجيني هو متغير النتيجة ، بينما كانت المجموعة (التحكم أو OVX ولكن باستثناء الأغنام المعالجة بالجلوكوكورتيكويد) والوقت (الموت الرحيم عند 2 م أو 5 م) متغيرات تابعة ، مع مصطلح التفاعل (المجموعة: الوقت). في النموذج الثاني ، كان التعبير الجيني هو متغير النتيجة ، بينما كانت المجموعة (التحكم ، OVX ، OVX مع علاج الجلوكوكورتيكويد لمدة 2 متر ، و OVX مع علاج الجلوكورتيكويد لمدة 5 أمتار) هي المتغير التابع.فوائد cynomoriumنظرًا لأنه تم اختبار متغيرات النتائج المتعددة (الجينات) للاختلافات بين المجموعات ، تم تعديل قيم p للاختبار المتعدد باستخدام إجراء هولم المتسلسل [24]. تم اختبار تركيزات مصل الكالسيوم والفوسفور و 25- هيدروكسي فيتامين د في نماذج التعبير الجيني ، ولكنها لم تكن كبيرة ، ونظرًا لعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات ، تمت إزالتها. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام تحليل المكون الرئيسي لتقييم ما إذا كانت بيانات تعبير طية الجين المحولة log10 اختلفت حسب المجموعة أو وقت القتل الرحيم أو تركيز المصل 25- هيدروكسي فيتامين د. تم استخدام ارتباط سبيرمان الزوجي ومخططات التشتت لدراسة الارتباط بين بيانات تعبير طية الجين المحولة log10 وتحليلات المصل.

3. النتائج

3.1. تأثير استئصال المبيض ، والوقت المنقضي منذ استئصال المبيض ، وعلاج القشرانيات السكرية على مصل الكالسيوم والفوسفور و 25- تركيزات هيدروكسي فيتامين د

يتم عرض النتائج الكاملة لتركيزات مصل الكالسيوم والفوسفور و 25- هيدروكسي فيتامين د في كل مجموعة في الشكل 1. "لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تركيز الكالسيوم والفوسفور و 25- هيدروكسي فيتامين د بين المجموعة التي خضعت لاستئصال المبيض والحمية منخفضة الكالسيوم ومجموعة النظام الغذائي المناسب من الكالسيوم غير المبيضين ، والوقت منذ استئصال المبيض شهرين و 5 أشهر. تشير هذه النتائج إلى أن استئصال المبيض مع اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم لم يكن لهما تأثير على تركيزات الكالسيوم في الدم. وعُولج بالكورتيكويدات السكرية لأشهر ، متبوعًا بالقتل الرحيم في 5 أشهر ، كان له تركيزات منخفضة من الكالسيوم في المصل (p =0. نظام غذائي منخفض الكالسيوم والأغنام المعالجة بالقشرانيات السكرية. ومع ذلك ، يشير فحص البيانات إلى أن هذا قد يكون بسبب حيوان واحد مصاب بنقص كلس الدم (1.52 مليمول / لتر ، النطاق المرجعي 2. 0-2. 7 مليمول / لتر) ؛ الإزالة من هذا الحيوان أزال أي أهمية.صفير الصحراءكان لدى جميع الأغنام الأخرى تركيزات الكالسيوم في الدم ضمن النطاق المرجعي. لم تُلاحظ أي اختلافات في تركيزات الفوسفور في الدم أو {0} تركيزات هيدروكسي فيتامين د في الأغنام التي تم استئصالها بالمبيض والمعالجة بالجلوكوكورتيكويد والتي يبلغ حجمها 5 أمتار.

3.2.تأثير استئصال المبيض والوقت منذ استئصال المبيض على فيتامين د والتعبير الجيني المرتبط بالفوسفاتونين في الكلى

لم يرتبط التعبير الجيني لفيتامين د والجينات المرتبطة بالفوسفات باستئصال المبيض أو الوقت منذ استئصال المبيض (الشكل 2). كان الاستثناء هو مستقبل فيتامين د (VDR) ، حيث كان لمجموعة OVX تعبير VDR أكبر بشكل ملحوظ (ص =0. 05 ، ص 2 0. 16) ؛ ومع ذلك ، اختفت هذه الأهمية بعد تعديل التدابير المتكررة.

3.3 تأثير استئصال المبيض وعلاج الجلوكوكورتيكويد على فيتامين د والتعبير الجيني المرتبط بالفوسفاتونين في الكلى بعد العملية بخمسة أشهر

يتم عرض النتائج الكاملة في الشكل 3. كان التعبير عن PTH1R أكبر بشكل ملحوظ في الأغنام OVX المعالجة بالكورتيكويدات السكرية لمدة 5 أشهر مقارنة بالمجموعات الأخرى (ص =0. {8}}. 01 و R20.31) و CYP24A1 (ص =0. 005 ، المعدل R40.40) كان التعبير أكبر بشكل ملحوظ في الأغنام OVX المعالجة بالجلوكوكورتيكويد لمدة شهرين مقارنة بالمجموعات الأخرى.

كان التعبير عن كلوثو مختلفًا بشكل كبير بين جميع المجموعات (ص =0. 01 ، ص 20.48) ، مع أقل تعبير في الضأن. كان لأغنام OVX المعالجة بالكورتيكويدات السكرية لمدة شهرين أعلى تعبير (ص =0. 002) ، تليها أغنام OVX (ص =0. {10}}. 03). ومع ذلك ، عند تعديلها للقياسات المتكررة ، لم يكن التعبير الجيني مختلفًا بشكل كبير بين هذه المجموعات ، حيث أظهر klotho أكبر فرق في الأغنام OVX المعالجة بالجلوكوكورتيكويد لمدة 5 أشهر (ص =0. 1).

وبالمثل ، فإن تعبير VDR كان مختلفًا بشكل كبير بين جميع المجموعات (ص =0. 03 ، المقابل R20.38). كان أكبر تعبير عن VDR في الأغنام OVX التي عولجت بالكورتيكويدات السكرية لمدة أشهر (ص =0. 009) ، متبوعة بأغنام OVX (ص =0. 01) ، ثم أغنام OVX المعالجة بالكورتيكويدات السكرية لمدة 5 أشهر (ص =0. 05) ، وكان أدنى تعبير موجود في الضأن.

3.4.PCA للتعبير الجيني العام بين المجموعات

فشل تحليل PCA لـ OVX والتحكم والقتل الرحيم في شهرين و 5 أشهر في فصل المجموعات المختلفة (الشكل S1). أوضح PCL و PC2 69.6 بالمائة من التباين. وبالمثل ، فشل تحليل PCA للمجموعات التي تم قتلها رحيمًا في 5 أشهر أيضًا في فصل المجموعات المختلفة. أوضح PCL و PC2 53.2 في المائة من التباين (الشكل S2). أظهر تحليل PCA أن التعبير الجيني الكلي لا يمكن تفسيره بواسطة الكالسيوم والفوسفور في المصل 25- بتركيزات هيدروكسي فيتامين د (الشكل S3).

3.5 الارتباط الزوجي بين جميع التحليلات والتعبير الجيني

بغض النظر عن حالة استئصال المبيض ، ومحتوى الكالسيوم في النظام الغذائي ، والوقت منذ استئصال المبيض (2 م أو 5 م) ، أو حالة علاج الجلوكوكورتيكويد ، كان التعبير الجيني لـ NPT1 مرتبطًا بشكل كبير وإيجابي (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. مناقشة

تشير نتائج هذه الدراسة إلى أن علاج الأغنام التي تم استئصال المبيض باستخدام القشرانيات السكرية كان له أكبر تأثير على التعبير الجيني ، بينما كان لاستئصال المبيض نفسه والوقت الذي مضى منذ استئصال المبيض (شهرين وخمسة أشهر) تأثير ضئيل على التعبير الجيني. في التحليل أحادي المتغير ، شوهدت فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير الجيني TRPV5 و CYP24A1 و klotho في الأغنام التي تم استئصالها بالمبيض والتي عولجت بالقشرانيات السكرية لمدة شهرين متبوعة بالقتل الرحيم عند 5 أشهر ، وفي PTH1R في الأغنام التي تم استئصالها المبيض والتي عولجت بالكورتيكويدات السكرية لمدة 5 أشهر. كانت الاختلافات أكثر وضوحا في تعبير klotho بعد التعديل للتدابير المتكررة.

أظهر التصوير المقطعي الكمي المحيطي للظنبوب القريب من هذه الأغنام أن استئصال المبيض قلل من الكثافة المعدنية للعظام الحجمي الكلي (BBMD) بنسبة 8 في المائة ، واستئصال المبيض باستخدام علاج القشرانيات السكرية لمدة 5 أشهر بنسبة 27 في المائة ، واستئصال المبيض باستخدام القشرانيات السكرية لمدة شهرين والقتل الرحيم في 5 أشهر بنسبة 13 بالمائة [6]. ومن المثير للاهتمام أن الكثافة المعدنية للعظام التربيقية ومنطقة التربيق والمحتوى المعدني للعظام التربيقية كانت مماثلة أو أكبر من الضوابط في الأغنام التي تم استئصالها المبيض والمعالجة بالجلوكوكورتيكويدات لمدة شهرين والموت الرحيم لمدة 5 أشهر ، مما يشير إلى استعادة كتلة العظام [6]. للجلوكوكورتيكويدات العديد من التأثيرات الموثقة جيدًا على العظام والتي تؤدي إلى الإصابة بهشاشة العظام التي يسببها الجلوكوكورتيكويد. تتضمن هذه التأثيرات تثبيط تكوين الخلايا السلفية للخلايا وخلايا بانيات العظم ، وزيادة موت الخلايا المبرمج ، وتقليل إنتاج العظم ، وكلها تقلل من تكوين العظام [25 ، 26]. في الوقت نفسه ، تزيد الجلوكوكورتيكويدات من ارتشاف العظم عن طريق تقليل تعبير OPG ، وزيادة تعبير RANKL ، وزيادة تكوين ناقضات العظم ، وتقليل موت الخلايا المبرمج ، وزيادة إفراز الكاتيبسين والبروتينات المعدنية المصفوفة بواسطة ناقضات العظم [25،26].

يعتبر كلوثو جزءًا لا يتجزأ من نظام الفوسفات ، حيث يرتبط بعامل نمو الخلايا الليفية 23 (FGF23) في الكلى. يرتبط مركب klotho-FGF23 بعد ذلك بمستقبل FGFR1IIC ، الذي يبدأ العديد من المسارات الخلوية ، وينتج عنه في النهاية زيادة تنظيم التعبير الكلوي 24- هيدروكسيلاز (CYP24A1) وتقليل تنظيم لا هيدروكسيلاز الكلوي (CYP27B1) والأنبوبي الكلوي ناقلات مشتركة Na / P II (NPT2a و 2c) [10]. قد يفسر التعبير المتزايد (الاختلافات التي كانت أكثر وضوحًا بعد ضبط القياسات المتكررة) لـ klotho في الأغنام على الجلوكوكورتيكويدات لمدة شهرين ثم الموت الرحيم في 5 أشهر زيادة تعبير CYP241 الذي شوهد أيضًا في هذه المجموعة من الأغنام ، على الرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في تركيزات مصل 25OHD.

يُعرف كلوثو بالبروتين المضاد للشيخوخة والفئران التي تعاني من نقص كلوثو لديها تكوين عظام منخفض وامتصاص عظمي ، مما يؤدي إلى انخفاض معدل دوران العظام [27 ، 28]. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط أشكال متعددة لجينات كلوثو مع انخفاض كثافة المعادن في العظام لدى البشر [29،30]. ينظم klotho القابل للذوبان بروتين الاستجابة المبكرة للنمو 1 (EGR -1) ويحث على التعبير عن علامات تمايز العظام في زراعة خلايا بانيات العظم [31] بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للجلوكوكورتيكويدات أن تثبط عامل نمو الأرومة الليفية 232]. ربما تكون تعبيرات klotho الأكبر في الأغنام على الجلوكوكورتيكويد لمدة شهرين ثم الموت الرحيم في 5 أشهر انعكاسًا لعملية التعافي لعلاج ما بعد الجلوكورتيكويد للأغنام ، وبالنظر إلى دوره في تكوين العظام وامتصاصها ، فمن المحتمل أن يكون محركًا رئيسيًا لاستعادة العظام وبالتالي ، من المحتمل أن يكون هدفًا علاجيًا لهشاشة العظام لدى البشر.

ومع ذلك ، فإن الأغنام OVX قد زادت أيضًا من تعبيرات كلوثو مقارنةً بالأغنام الضابطة. وبالمثل ، أظهرت إحدى الدراسات التي أجريت على الفئران التي تعاني من نقص الأروماتيز أن نقص هرمون الاستروجين أدى إلى زيادة مستويات بروتين كلوثو ، كما أدى علاج استراديول إلى تقليل تعبيرات كلوثو في هذه الفئران [17]. في الفئران ، يعمل الإستروجين على تقليل تنظيم NPT2a في عملية مستقلة عن klotho / FGF23 و PTH [18]. ومع ذلك ، لم يلاحظ هذا التأثير في الأغنام المبيض في هذه الدراسة. خلاف ذلك ، هناك القليل من الأدبيات حول تأثير نقص هرمون الاستروجين على عقار كلوثو. يجب أن تدرس الأبحاث الإضافية آثار كل من استئصال المبيض والقشرانيات السكرية على تعبير كلوثو ، نظرًا لدورها في الشيخوخة وأمراض الكلى المزمنة.

TRPV5 عبارة عن قناة كالسيوم ظهارية يتم التعبير عنها أساسًا في الأنابيب الملتفة البعيدة والأنابيب المتصلة في الكلى [20،33]. قناة TRPV5 مفتوحة بشكل أساسي ولكنها تخضع لتعطيل يعتمد على الكالسيوم بالاشتراك مع الكالمودولين ، وهو بروتين حساس للكالسيوم [34]. يمكن زيادة تعبير TRPV5 بواسطة PTH و 1،25 (OH) D3 [35]. كان أحد الأغنام التي تم تناولها على الجلوكوكورتيكويد لمدة شهرين ثم الموت الرحيم في 5 أشهر تعاني من نقص كلس الدم ، وكانت تركيزات الكالسيوم في الدم أقل بشكل ملحوظ في الأغنام في هذه المجموعة مقارنة بالمجموعات الأخرى. لذلك ، من المحتمل أن يكون التعبير المتزايد عن TRPV5 نتيجة لانخفاض تركيز الكالسيوم في الدم في هذه الحيوانات. لقد ثبت أن القشرانيات السكرية تقلل من امتصاص الكالسيوم في الأمعاء عن طريق تقليل التعبير عن TRPV6 و CalD9k [36،37] وزيادة إفراز الكالسيوم في البول [14] ، ولكن من غير المألوف حدوث نقص كلس الدم في الأشخاص الأصحاء. وبالمثل ، فإن الأغنام التي لديها تركيز منخفض من الكالسيوم في الدم لم تظهر عليها أي علامات سريرية لتكزز نقص كالسيوم الدم. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يعكس التعبير المتزايد عن TRPV5 في الأغنام على جلايكورتيكويد لمدة شهرين ثم القتل الرحيم بعد 5 أشهر عملية الاسترداد ، حيث يلزم استبدال المحتوى المعدني للعظام والمنطقة والعظام التربيقية ، وزيادة ارتشاف الكالسيوم من الكلى.

في الأغنام المعالجة بالكورتيكويدات السكرية لمدة 5 أشهر ، زاد تعبير PTH1R مقارنة بالمجموعات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة بالمجموعات الأخرى ، كان هناك اختلاف بسيط في التعبير بين الأغنام في المجموعة. على الرغم من عدم وجود فروق في تركيزات الكالسيوم في الدم في الأغنام المعالجة بالكورتيكويدات السكرية لمدة 5 أشهر ، فقد يترافق ذلك مع زيادة عمل الهرمون PTH ومستقبلاته. إن تأثيرات القشرانيات السكرية على إفراز هرمون الغدة الدرقية وعمله غير واضحة. وجدت بعض الدراسات التي أُجريت على البشر أن المرضى الذين عولجوا بالجلوكوكورتيكويد قد زادوا من تركيزات هرمون PTH في الدم ، إلى جانب انخفاض امتصاص الكالسيوم ، وزيادة إفراز الكالسيوم في البول وانخفاض كتلة العظام [38،39]. ومع ذلك ، لم تجد معظم الدراسات أي تغييرات في تركيزات هرمون PTH في المصل عند البشر عند العلاج بالجلوكوكورتيكويد [38،40،41]. أظهرت إحدى الدراسات أن تأثير الجلوكوكورتيكويد ربما يكون على تغيير إفراز هرمون الغدة الدرقية ، مع زيادة الإفراز النابض للهرمون PTH في الأفراد المعالجين بالسكر الجلوكورتيكويد [4]. أظهر آخرون أيضًا زيادة تعبير PTH1R في الخلايا الجذعية اللحمية المتوسطة والخلايا الشبيهة ببرومة العظم استجابةً للعلاج بالديكساميثازون [43 ، 44]. على هذا النحو ، فإن الزيادة في تعبير PTH1R الكلوي في الأغنام المعالجة بالقشرانيات السكرية لمدة 5 أشهر من المحتمل أن تكون بسبب 5 أشهر من العلاج بالكورتيكويد.

في حين أن استئصال المبيض مع اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم أدى إلى تغييرات طفيفة في التعبير الجيني ، يبدو أنه يغير تعبير VDR ، مع الأغنام المستأصلة المبيض على نظام غذائي منخفض الكالسيوم بشكل معتدل مع تعبير VDR أكبر مقارنة بالأغنام الضابطة. هذا على النقيض من دراسة أجريت على الفئران التي خضعت لاستئصال المبايض حيث أظهر أولئك الذين تناولوا نظامًا غذائيًا بمستويات طبيعية من الكالسيوم زيادة في التعبير الكلوي لـ VDR ، في حين أن أولئك الذين غذوا على نظام غذائي منخفض الكالسيوم قد قللوا من تعبير VDR [45]. من الصعب في هذه الدراسة الحالية للأغنام فصل تأثير استئصال المبيض على التعبير الكلوي لـ VDR عن تأثير النظام الغذائي منخفض الكالسيوم. ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تركيزات الكالسيوم في الدم بين المجموعات (باستثناء مجموعة الجلوكوكورتيكويد) مما يشير إلى أن النظام الغذائي منخفض الكالسيوم كان له تأثير ضئيل وربما يكون التأثير على VDR بسبب استئصال المبيض. ومع ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من البحث للتحقيق في هذه العلاقات.

درست دراستان سابقتان العلاقات المنفصلة بين الجينات المستجيبة لفيتامين د ، والجينات المرتبطة بالفوسفات في كلى الأغنام [20 ، 21]. ومع ذلك ، لم يتم فحص العلاقات بين مسارات فيتامين (د) والفوسفات. ومن المثير للاهتمام ، أن أهم الارتباطات بين الجينات التي تم الإبلاغ عنها في هاتين الورقتين تنطبق على العلاقات الجينية في دراسة الأغنام الحالية أيضًا ، مما يشير إلى الاتساق في النتائج بين الدراسات والعلاقات بين هذه الجينات.استخراج الصلصا cistancheمن بين العلاقات المثيرة للاهتمام التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقًا ، كما قد يتوقع المرء نظرًا لدورها المحوري في استقلاب الكالسيوم ، كان التعبير عن PTH1R مرتبطًا بشكل كبير بـ CalD28k و CalD9k و TRPV5 CYP27B1 و CYP24A1 و VDR و Klotho و NPT2c. ارتبط تعبير klotho ارتباطًا وثيقًا بالتعبير الجيني لـ TRPV5 ، وهو ما يتوافق مع الأدبيات الأخرى التي تظهر أن klotho ينظم TRPV5 ويعزز إعادة امتصاص الكالسيوم الكلوي [46 ، 47].

لسوء الحظ ، لا يمكن فصل المجموعات المختلفة بناءً على التعبير الجيني المستجيب لفيتامين (د) والفوسفات باستخدام تحليل PCA. هذا على الأرجح بسبب القيود الرئيسية لهذه الدراسة - حجم العينة الصغير. مع وجود 3-6 من الحيوانات فقط في كل مجموعة ، من المحتمل أن يكون هذا قد حد من القدرة على اكتشاف الاختلافات في التعبير الجيني بين المجموعات.

5. الاستنتاجات

أظهرت نتائج هذه الدراسة أن الاختلافات الأكثر وضوحا في التعبير الجيني كانت في التعبير الكلوي الكلوي في الأغنام التي تم استئصالها المبيض والتي عولجت بالجلوكوكورتيكويد لمدة شهرين تليها فترة نقاهة لمدة 5 أشهر. نظرًا لأن كلوثو هو هرمون "مضاد للشيخوخة" وله دور حاسم في استقلاب الكالسيوم والفوسفات ، فمن الممكن أن يكون لهذا الهرمون دور حاسم في استعادة الكثافة المعدنية للعظام التربيقية والمنطقة الموجودة في الأغنام المعالجة ، وبالتالي من المحتمل أن يكون هدف علاج هشاشة العظام لدى البشر. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث حول آثار الجلوكورتيكويد واستئصال المبيض على كلوثو.

تم اقتباس هذا المقال من موقع الحيوانات 2022 ، 12 ، 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals