اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

الرجاء النقر هنا للجزء 2

I-Fang Wang و 1،2 Yihan Wang و 2 Yi-Hua Yang و 1،3،4 Guo-Jen Huang و 5،6 Kuen-Jer Tsai و 3،4 * و Che-Kun James Shen1،2،7 ، *

1 خريج معهد الطب التجديدي العصبي ، كلية العلوم الطبية والتكنولوجيا ، جامعة تايبيه الطبية ، تايبيه 11031 ، تايوان

2 معهد البيولوجيا الجزيئية ، أكاديميا سينيكا ، تايبيه 11529 ، تايوان

3 معهد الطب السريري ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان 70403 ، تايوان

4 مركز أبحاث الطب السريري ، مستشفى جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، كلية الطب ، جامعة تشينغ كونغ الوطنية ، تاينان 70403 ، تايوان

5 قسم ومعهد الدراسات العليا للعلوم الطبية الحيوية ، كلية الطب ، جامعة تشانغ غونغ ، تاويوان 33302 ، تايوان

6 مركز أبحاث العلوم العصبية ، مستشفى تشانغ جونج التذكاري ، لينكو 33302 ، تايوان

7-قيادة الاتصال

* المراسلات: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT) ، ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

يمكن أن يحسن القدر من الذاكرة

ملخص

الاختلاف المظهرى هو شرط أساسي لتطور الخلية والكائن الحي عن طريق الانتقاء الطبيعي. في حين أن دور التعبير الجيني العشوائي في التنوع الظاهري للخلايا المتطابقة وراثيًا قد تمت دراسته جيدًا ، لا يُعرف الكثير فيما يتعلق بالعلاقة بين التعبير الجيني العشوائي والتغير السلوكي الفردي في الحيوانات. لقد أوضحنا أن نوعًا معينًا من الحمض الريبي النووي الريبي (miR -466 f -3 p) يتم تنظيمه في قرن آمون لجزء من الفئران الفردية الفطرية في مهمة موريس المائية. بشكل ملحوظ ، ينظم miR - 466 f -3 بشكل إيجابي مورفولوجيا الخلايا العصبية والوظيفة والتعلم المكاني ، وذاكرةقدرة الفئران. ميكانيكيًا ، تقوم miR -466 f -3 p بقمع ترجمة MEF2A ، وهو منظم سلبي للتعلم /ذاكرة. أخيرًا ، أوضحنا أن التنظيم المتنوع للحصين miR -466 f -3 p ينتج عن الفسفرة العشوائية لربط الحصين الدوري AMP (cAMP) - الاستجابة لعنصر الاستجابة (CREB) في الأفراد. هذه النتيجة من تعديل التعلم المكاني وذاكرةعبر محور إشارة الحصين العشوائي عند التحفيز العصبي يمثل عرضًا لكيفية التباين في التعبير الجيني للأنسجة يؤدي إلى سلوك حيواني متنوع.

المقدمة

يمنح الاختلاف المظهري بين الأفراد ميزة تطورية لأنه يوفر التنوع السكاني الذي يعمل عليه الانتقاء الطبيعي (Pavlicev et al. ، 2011). تساهم الخلفيات الجينية والعوامل البيئية في توليد مثل هذا التنوع الطبيعي (Bendesky and Bargmann ، 2011). من الناحية التجريبية ، غالبًا ما تُستخدم الفئران الفطرية لدراسة الأساس الجزيئي والخلوي للأنماط الظاهرية والسلوكيات المتوسطة لتقليل آثار الاختلافات الجينية بين الأفراد المختبرين (كاسيلاس ، 2011). ومع ذلك ، فقد تم عرض تباين في وفرة نسخ الأنسجة بين الفئران المتجانسة الفردية. غالبًا ما ترتبط الجينات التي تظهر مستويات تعبير شديدة التباين بوظيفة المناعة ، واستجابات الإجهاد ، والتنظيم الهرموني ، أي العمليات الحساسة للإشارات البيئية (Vedell et al. ، 2011). أظهرت بعض هذه الدراسات أيضًا أن الاختلافات في التعبير الجيني أو الإشارات الخلوية ، مع أو بدون تأثير العوامل البيئية مثل لعق الأم ، أو توفير المغذيات في الرحم ، أو المرونة الناتجة عن الإجهاد مقابل القابلية للتأثر (Bale ، 2015 ؛ Danchin et al. ، 2011 ؛ لورش

وآخرون ، 2019 ؛ Pedersen et al. ، 2011) ، يمكن أن يؤدي إلى اختلافات في الأنماط الظاهرية والسلوكيات (Casellas، 2011؛ ​​Locke et al.، 2015؛ Loos et al.، 2015؛ Oey et al.، 2015).

التعلم المكاني وذاكرةيمكن فصل التكوين الذي يتحكم فيه الدماغ إلى نظامين: (1) التنقل الأناني الذي يستخدم الحركة الذاتية والإشارات الداخلية و (2) التنقل المركزي الذي يتضمن في المقام الأول الحُصين وهياكل الدماغ القريبة التي يتم تحفيزها بواسطة إشارات بعيدة خارج الكائنات الحية (إكستروم) وآخرون ، 2014). قدرة التعلم المكاني وذاكرةيسمح لمعظم أنواع الحيوانات بتعديل سلوكياتها تدريجياً للتكيف في بيئات متغيرة مكانياً وزمانياً ، وهو أمر بالغ الأهمية لبقائها على قيد الحياة. يمكن تقييم ذلك في حيوانات المختبر من خلال تطبيق نماذج سلوكية مثل متاهة موريس المائية (MWM) (فورهيس وويليامز ، 2014). والجدير بالذكر أن القوارض الفطرية المتماثلة وراثيًا قد أظهرت تباينًا ظاهريًا في التعلم المكاني وذاكرة(تساي وآخرون ، 2002) ، لكن الآليات الكامنة وراء هذا الاختلاف السلوكي ظلت مجهولة.

يعد تكوين ذكريات جديدة عملية معقدة تتطلب النسخ الجيني المعتمد على النشاط ، وتخليق بروتين جديد ، و

الشكل 1. العلاقة بين التباين في التعلم المكاني وذاكرةالقدرة والاستقراء miR -466 f -3 p

(أ) مهمة MWM للفئران البرية من النوع C57BL / 6J. اللوحة اليسرى: عروض MWM لفئران GLN (نقاط) وفئران PLN (مربعات). من إجمالي 289 فأرًا تم اختبارها ، تم تصنيف 180 فأرًا مثل GLNand109asPLN.Rightpanel: probetestoftheMWMtask (n =47 and30ineachgroup). تمت مقارنة المتوسطات التي تم إنفاقها على كل أربعة أجزاء ومنطقة النظام الأساسي في الرسم البياني. P ، مكان المنصة المفقودة ؛ T ، المنطقة المستهدفة بدون P ؛ R ، المنطقة الصحيحة ؛ O ، المنطقة المقابلة ؛ L ، المنطقة اليسرى. (ب) تحليل RT-qPCR لتعبير ميرنا. تم تحليل مستويات التعبير النسبي لستة miRNAs الموجودة داخل مجموعة miR -466-669 و miR -132-3 p ، كعنصر تحكم إيجابي غني بالدماغ ، وتم ضبطها باستخدام التحكم الداخلي U6 snRNA من GLN و PLN Mouse hippocampus (ن=9 - 18 لكل مجموعة). I، miR -466 f - 3 p؛ II ، miR -466 جم ؛ III ، miR -466 i -3 ص ؛ الرابع ، مير -467 ب -3 ص ؛ V ، miR -467 ص ؛ السادس ، مير -669 ص ؛ السابع ، مير -132-3 ص.

"شبكات عصبية محددة محددةذاكرةengrams لعمل اتصالات عصبية جديدة ودونة مستدامة (Asok et al. ، 2019). إنغرام الحصين ، وهي مجموعات متفرقة من الخلايا العصبية في التلفيف المسنن (DG) ، تمثل مجموعات من الخلايا العصبية التي تظهر نشاطًا متزايدًا بعدذاكرةتشكيل - تكوين. بينما تُظهر الخلايا العصبية لـ DG engram نمطًا متميزًا للغاية للتعبير الجيني (Rao-Ruiz et al. ، 2019) ، فإن الآليات الجزيئية المحددة لـ engram الكامنة وراءهاذاكرةالتوحيد لا يزال غير معروف إلى حد كبير. من المعروف أن العديد من العوامل ومسارات الإشارات تنظم التعلم بشكل إيجابي أو سلبيذاكرةتم تحديد العمليات (Abraham et al.، 2019؛ Humeau and Choquet، 2019). من بينها ، يحفز الشكل المنشط لبروتين ربط عنصر الاستجابة الدوري AMP (cAMP) (CREB) نسخ الجينات استجابة للتجاعيد المعتمدة على النشاط لـ Ca2 plus داخل الخلايا في الخلايا العصبية (Kandel ، 2012). من ناحية أخرى ، فإن نشاط النسخ المعسكر / PKApathwayrepresses myocyteenhancer factor 2 (MEF2) من خلال منع التصدير النووي لمضيقه المساعد ، HDAC5 ، والاستيراد النووي للمنشط المساعد NFAT (بيليلد وآخرون ، 2006). علاوة على ذلك ، على عكس CREB ، يقيد نشاط MEF2Aذاكرةتشكيل (كول وآخرون ، 2012). بصرف النظر عن عوامل البروتين ، فإن microRNAs (miRNAs) تشارك أيضًا في تنظيم وظائف الخلايا العصبية ، بما في ذلك التعلم والذاكرة (McNeill and Van Vactor ، 2012). إن miRNAs صغيرة (22 نانومتر) من الحمض النووي الريبي غير المشفر والتي تعمل بشكل أساسي على تنظيم ما بعد النسخ للتعبير الجيني عبر الاقتران الأساسي المتسلسل مع مواقع التعرف عليها في 30 منطقة غير مترجمة (30 UTRs) من mRNAs محددة (Daugaard and Hansen ، 2017). تشارك miRNAs في مجموعة من مسارات الإشارات في الخلايا العصبية بعد الانقسام الفتيلي ، وهي تتوسط في العمليات الخلوية المعتمدة على النشاط ، بما في ذلك النمو التغصني والتفرع ، وتشكيل المشبك ، والنضج. من خلال تنظيم التعبير الجيني ، فإنها تلعب أيضًا أدوارًا مهمة في الأشكال طويلة الأمد من اللدونة المشبكية التي تكمن وراءهاذاكرةالتكوين والاسترجاع والتوحيد (Chen and Shen، 2013؛ Wang et al.، 2012b).

في ما يلي ، نقدم أدلة على وجود علاقة سببية بين التعبير الجيني للنسيج العشوائي والتباين السلوكي الفردي في الحيوانات. على وجه الخصوص ، نوضح أن التنشيط العشوائي لمحور الحصين CREB-pCREB / miR - 466 f -3 p-MEF2A يعدل التباين الفردي للتعلم المكاني وذاكرةالقدرة في الفئران الفطرية.

النتائج

التباين الفردي للتعلم المكاني وذاكرةالقدرة مرتبطة باستقراء miR -466 f -3 p من مجموعة miRNA محددة

لتحديد miRNAs المشاركة في تنظيم التعلم وذاكرة، استخدمنا مهمة MWM للتمييز بين الفئران البرية من النوع C57BL / 6J ذات القدرة على التعلم والذاكرة الجيدة أو السيئة (الشكل 1 أ). حددنا الفئران التي أكملت المهمة في غضون 30 ثانية في الجلسة (السادسة) الأخيرة على أنها "متعلمين جيدين" (GLN) ، في حين أن الفئران التي لم تتمكن من العثور على النظام الأساسي خلال 30 ثانية في الجلسة الأخيرة اعتُبرت "متعلمين فقراء" (PLN). كما هو مبين في الشكل 1 أ (اللوحة اليسرى) ، ينتمي 62 في المائة من الفئران إلى مجموعة GLN (180 من 289 فأرًا) ، مما يُظهر انخفاضًا ملحوظًا في زمن انتقال الهروب من 98.1 ثانية (الجلسة الأولى) إلى 21.8 ثانية (الجلسة السادسة). في المقابل ، انخفض زمن انتقال نسبة 38 بالمائة المتبقية من الفئران ، مجموعة PLN (109 من 289 فأرًا) ، بشكل معتدل فقط بين الجلسات الأولى والسادسة (من 111.8 ثانية في الجلسة الأولى إلى 82.1 ثانية في الجلسة السادسة) . أظهر اختبار المسبار ، الذي يشير إلى أن الفئران قد تعلمت بالفعل المهمة خلال الجلسات الست ، أن الفئران GLN بقيت لفترة أطول في منطقة المنصة مقارنة بفئران PLN (الشكل 1 أ ، زوج من القضبان اليسرى في اللوحة اليمنى).

بعد ذلك ، قمنا بتحليل الحمض النووي الريبي من قرن آمون من فئران GLN و PLN بواسطة تهجين ميكروأري ميرنا (ن=4 كل مجموعة). بشكل عام ، لاحظنا اختلافات طفيفة نسبيًا في التعبير عن المحاولات المجهرية للحصين من الفئران GLN و PLN. ومع ذلك ، لاحظنا أن أعلى 10 miRNAs التي كانت مستويات التعبير فيها أعلى في الفئران GLN من الفئران PLN (البيانات غير معروضة) مشتقة جميعها من نفس مجموعة miRNA الخاصة بالقوارض ، miR -466-669 ، الموجودة في intron 10 من الجين mSfmbt2 (انظر أدناه). استنادًا إلى تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) مستويات التعبير عن miRNAs المحددة في المجموعة ، اخترنا miR -466 f -3 p لمزيد من التحقيق (الشكل 1 ب). كان متوسط ​​التعبير عن هذا الميرنا 1. 5- أضعاف أعلى في قرن آمون من فئران GLN مقارنةً بفئران PLN. والجدير بالذكر أن متوسط ​​مستويات الحصين mR -466 f -3 p كانت متشابهة بين مجموعة PLN ومجموعة التحكم في القفص المنزلي (HC) ومجموعة التحكم في السباحة (الشكل 1C) ، وبالتالي باستثناء التأثيرات المرتبطة بالتمارين الرياضية أثناء السباحة ودعم فكرة أن miR -466 f -3 تم تحفيزها أثناء التعلم المكاني وذاكرةتشكيل - تكوين.

في الشكل 1 ج ، تكشف البيانات أن مستويات التعبير للحصين miR -466 f -3 p لأكثر من 42 بالمائة من فئران GLN كانت 1 على الأقل. 5- أضعاف مستوى التعبير المتوسط ​​لـ الفئران الضابطة HC ، في حين أن المستويات في 15 في المائة من الفئران PLN كانت نصف تلك الموجودة في الفئران HC. ما يقرب من 25 في المائة من فئران GLN و 55 في المائة من فئران PLN لديها مستويات مماثلة من miR -466 f {{1 {11}}} p (0. 8- إلى 1. 2- أضعاف بالنسبة إلى HC). يوضح الشكل 1 د مخطط نثر ارتباط بيرسون الذي يظهر ارتباط إيجابي بين مستويات مير -466 و -3 ص ومدة النسبة المئوية على المنصة أثناء اختبار المسبار. أجرينا أيضًا miR -466 f -3 p و U6 صغيرًا الحمض النووي الريبي (snRNA) في التهجين الموضعي (ISH) لشرائح الدماغ في كل من الفئران GLN و PLN (الشكل 1E). أكد التحليل الإحصائي لإشارات miR - 466 f {23}} p عبر ISH أن تحريض miR -466 f - 3 p كان بالفعل أكبر في DG لفئران GLN مقارنةً بإشارات

الفئران PLN ، بينما لم يتم العثور على فرق عند مقارنة إشارات U6 snRNA (الرسم البياني الأيمن ، الشكل 1E). على الرغم من أن إشارات miR -466-3 p لم تكن متساوية بين الخلايا الحبيبية الفردية في DG ، إلا أنها لا تزال تزداد بشكل ملحوظ وفي كل مكان في قرن آمون من فئران GLN مقارنةً بفئران PLN. لذلك ، فإن تحريض miR -466 f -3 p لم يحدث فقط في جزء صغير من الخلايا ، على سبيل المثال ، عصبونات engram. تشير هذه البيانات إلى أن تنظيم miR -466 f -3 p أثناء مهمة MWM يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالتعلم المكاني الأفضل وذاكرةالقدرة بين نسبة كبيرة من الفئران GLN.

قمنا أيضًا بتحليل متوسط ​​مستويات التعبير للعديد من الجزيئات الدقيقة الخاصة بالدماغ بواسطة RT-qPCR. من بينها ، تم تنظيم miR -132-3 p في قرن آمون الماوس بعد مهمة MWM ، لكننا لم نلاحظ اختلافات كبيرة بين مجموعتي GLN و PLN (زوج العارضة VII ، الشكل 1B). كانت مستويات التعبير عن miR -335-5 p و miR -22 متشابهة بين مجموعات GLN و PLN و HC (الشكل S1A). وبالتالي ، على عكس miR -466 f -3 p ، فإن التعبير الحصيني عن هذه الجزيئات الدقيقة أثناء تدريب MWM لا يرتبط بالتعلم المكاني وذاكرةقدرة الفئران.

يعزز تنظيم miR -466 f {1}} p من نمو العصبونات وتكوين العمود الفقري التغصني

لتأكيد أن miR -466 f -3 p قد تم التعبير عنه بالفعل في الخلايا العصبية ، أجرينا miRNA ISH جنبًا إلى جنب مع تلطيخ التألق المناعي (IF) لكل من NeuN و MAP2 في الخلايا العصبية الأولية في الحصين. أظهرت النتائج أنه على غرار miRNAs الأخرى (كوهين وآخرون ، 2011 ؛ توماس وآخرون ، 2017) ، تم التعبير عن miR -466 f -3 p بشكل أساسي في منطقة سوما العصبية ، مع بعض الإشارات الإضافية في التشعبات (الشكل S2A). لفهم الأساس الجزيئي والخلوي لارتباط miR المنتظم -466 f -3 p بالتعلم وذاكرةفي البداية ، قمنا أولاً بإفراط في التعبير عن miR -466 f -3 p مع بولي ببتيد الانصهار dsRed تحت سيطرة مروج اليوبيكويتين من pFUGW- miR -466 f -3 p- dsRed البلازميد إلى الخلايا العصبية الحصينية الأولية DIV10 (الشكل S2B). من خلال miRNA ISH ، تأكدنا من أن إشارة miR -466 f -3 p أقوى في مجموعة miR -466 f -3 p overexpression بالنسبة إلى التحكم في النواقل أو miR المتحولة {{ 12}} مجموعة -3 p (أسهم ، الشكل S2B). بالتوازي مع ذلك ، أنشأنا أيضًا نظامًا أساسيًا لفحص تأثير miR -466 f -3 p فقد الوظيفة عن طريق تثبيط miR -466 f -3 p باستخدام miR-sponge الموجود في 30 UTR من EGFP mRNA المعبر عنها من pFUGW-miR-sponge- EGFP plasmid (الشكل S2C). عمل مراسل EGFP في البلازميد الإسفنجي كمؤشر على كفاءة تعداء الجسم ومستشعر لنشاط ميرنا الخلوي (Kluiver et al. ، 2012). في جزء مهم من خلايا HEK293T المنقولة ، انخفضت إشارة EGFP عند التعبير المشترك مع النوع البري miR -466 f -3 p ، ولكن ليس مع miR متحولة -466 f {{32 }} p ، بسبب تثبيط ترجمة EGFP mRNA بربط miR -466 f -3 p بـ miR- sponge في 30 UTR (قارن الصور الأربع اليسرى واثنتين من برنامجه ، الشكل S2C) . في المقابل ، لم نلاحظ انخفاض إشارة EGFP عند التعبير المشترك لإسفنجة التحكم بتشفير ثماني نسخ من تسلسل مخلوط من pFUGW-SCR- sponge-EGFP plasmid إما مع miR -466 f -3 p أو متحولة (قارن الصور الأربع الصحيحة واثنين من المدرج التكراري).

كما هو مبين في الشكل 2 أ ، أدى التعبير خارج الرحم عن miR -466 f -3 p إلى تغيرات مورفولوجية في الخلايا العصبية ، وعلى الأخص تحسين نمو العصبونات بالنسبة للتحكم في الخلايا العصبية المنقولة باستخدام ناقل التعبير dsRed pFUGW- dsRed أو متحولة miR -466 f -3 plasmid pFUGW-mut-miR - 466 f -3 p-dsRed. أظهرت بيانات الكميات أن متوسط ​​عدد الفرع التغصني لكل خلية عصبية لم يكن مختلفًا بشكل كبير بين مجموعة التعبير الزائد عن التعبير mi -466 f -3 (الشريط II) والتحكم في المتجهات أو الطافرة (الشريطان الأول والثالث) (على اليمين) الرسم البياني العلوي ، الشكل 2 أ). ومع ذلك ، فقد زاد متوسط ​​طول التغصنات الكلي ومتوسط ​​طول التشعبات الأولية عند التعبير الزائد عن mR -466 f -3 p (قارن الشريط II بالشريط الأول والثالث ، الرسم البياني السفلي الأيمن للشكل 2 أ). في موازاة ذلك ، منعنا miR -466 f -3 p الداخلي باستخدام miR-sponge. كما رأينا ، لم يكن هناك فرق كبير في رقم الفرع التغصني بين مجموعات التحكم والتثبيط p miR -466 f -3 (قارن الشريط الرابع بالشريط الأول والخامس ، التاريخ العلوي الأيمن ، الشكل 2 أ) ، ولكن مجموعة تثبيط p mi {-466 f -3 عرضت انخفاضًا ملحوظًا في متوسط ​​طول التغصنات الكلي بالإضافة إلى متوسط ​​أطوال التشعبات الأولية والثانوية بالنسبة للمجموعات الأخرى (قارن الشريط IV بالأشرطة I و الخامس ، الرسم البياني السفلي الأيمن من الشكل 2A). علاوة على ذلك ، أظهر تلطيخ IF أن التعبير المفرط miR - 466 f -3 p ، ولكن ليس تثبيطًا ، زاد أيضًا من كثافة العمود الفقري الشجيري (الشكل 2 ب ، اللوحات العلوية والرسم البياني السفلي الأيسر). أجرينا أيضًا تلطيخًا مشتركًا لبروتين ما بعد المشبكي 95 (PSD -95) وقمنا بحساب كثافة العمود الفقري المتغصن لتحديد الأعداد الدقيقة من نقاط الاشتباك العصبي المثيرة (الشكل 2 ب ، الرسم البياني السفلي الأيمن) ، والذي كشف أن miR {{40 }} زاد التعبير الزائد -3 من كثافة أشواك PSD -95- الموجبة مقارنة بمجموعات التحكم الأخرى. ومع ذلك ، فإن تثبيط miR -466 f -3 p لم يغير بشكل كبير كثافة العمود الفقري الإيجابي PSD -95- فيما يتعلق بمجموعات التحكم (الشكل 2 ب ، الرسم البياني السفلي الأيمن). تشير هذه البيانات معًا إلى أنه في غياب التحفيز العصبي ، فإن تثبيط miR -466 -3 p وحده لا يؤثر على كثافات المشابك المثيرة أو إجمالي العمود الفقري الشجيري.