الجزء 1 Cistanches يخفف من الخلل المعرفي الناجم عن Sevoflurane من خلال تنظيم PPAR - - الذي يعتمد على مضادات الأكسدة والالتهابات في الفئران

مزيد من المعلومات يرجى الاتصال:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola له العديد من التأثيرات ، انقر هنا لمعرفة المزيد

الملخص

تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في الآثار الوقائية والآليات الكامنة وراءcistancheعلى نموذج الفئران الخلل الوظيفي الإدراكي الذي يسببه سيفوفلوران. تم تعيين ذكور الفئران SD (24 شهرًا) بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: مجموعة التحكم ، مجموعة سيفوفلوران ، مجموعة التحكم بالإضافة إلى cistanche ، و سيفوفلوران بلسcistancheمجموعة. بعد ذلك ، تم قياس مستويات السيتوكين الالتهابي بواسطة ELISA ، وتم تقييم الخلل الإدراكي للفئران عن طريق اختبار متاهة الماء ، واختبار المجال المفتوح ، واختبار تكييف الخوف. بعد ثلاثة أيام من التخدير ، قُتلت الفئران وتم حصاد قرن آمون لتحليل الجزيئات الحيوية النسبية. تمت الإشارة إلى مستوى الإجهاد التأكسدي على أنه تركيز النتريت و MDA ، جنبًا إلى جنب مع نشاط SOD و CAT. أخيرًا ، تم استخدام مضاد PPAR- لاستكشاف آليةcistancheفي الجسم الحي. أظهرت النتائج أنه بعد استنشاق سيفوفلوران ، أصيب ذكور جرذان SD البالغة من العمر شهر 24- وليس 3- بضعف إدراكي واضح في اختبار السلوك بعد 3 أيام من التخدير. الحقن داخل الصفاقcistancheبجرعة 50 مجم / كجم لمدة 3 أيام متتالية قبل التخدير يخفف من ارتفاع مستويات الالتهاب العصبي الناجم عن سيفوفلوران ويضعف بشكل كبير ضعف الذاكرة المعتمد على الحُصين في 24- فئران عمرها شهر.سيستانشيقلل أيضًا من الإجهاد التأكسدي عن طريق تقليل النتريت و MDA مع زيادة نشاط SOD و CAT. علاوة على ذلك ، فإن هذا العلاج يمنع أيضًا تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا أن تثبيط PPAR- على العكس من ذلك خفف منcistanche- تأثير وقائي. مجتمعة ، أظهرنا أن cistanche يمكن أن يمارس مضادات الأكسدة ، المضادة للالتهابات ، المضادة لموت الخلايا المبرمج ، ومضادة لتفعيل تأثيرات الخلايا الدبقية الصغيرة على تطوير الخلل الإدراكي الناجم عن Sevoflurane عن طريق تنشيط إشارات PPAR.

الكلمات الدالة

cistanche، الخلل المعرفي بعد الجراحة (POCD) ، PPAR- ، سيفوفلوران

سيستانشالمكملات الغذائية تعزز المناعة

1|المقدمة

يعد الخلل المعرفي بعد الجراحة (POCD) من المضاعفات المدمرة التي لها عواقب طويلة الأمد ويتم تعريفه على أنه ضعف الذاكرة والانتباه والتركيز ومعالجة المعلومات التي تحدث بعد الجراحة والتخدير. أشارت الأبحاث إلى أن حوالي 10 في المائة من مرضى الجراحة وما يقرب من 40 في المائة من المرضى المسنين في سن 65 وما فوق سيصابون بهذا المرض. أولئك الذين ليس لديهم POCD.2،3 على الرغم من بذل العديد من الجهود البحثية في العقود الأخيرة ، إلا أن التسبب في هذا المرض لا يزال غير معروف إلى حد كبير.

من المعروف جيدًا أن الالتهاب العصبي والإجهاد التأكسدي في الدماغ يلعبان دورًا حاسمًا في بدء مرض POCD وتطوره. ، تشير التقارير الحديثة إلى أن عوامل التخدير المستخدمة أثناء الجراحة قادرة أيضًا على إحداث ضعف إدراكي.

يستخدم Sevoflurane بشكل شائع في التخدير السريري للمرضى من جميع الأعمار نظرًا لانخفاض معامل تقسيم غازات الدم والانهيار الأيضي المنخفض. على سبيل المثال ، أفاد ماكاريوس أن سيفوفلوران له تأثيرات سمية عصبية على نمو الدماغ .9 وقد ثبت أن انخفاض الاتصال بين الخلايا العصبية المثيرة في قشرة الفص الجبهي مرتبط بضعف الإدراك الناجم عن سيفوفلوران. التهاب عصبي منظم في نموذج الفئران عن طريق تنظيم PPAR- نشاط في الحُصين .1 بمجرد تحديد الطريقة الجراحية ، لا يمكن تغيير درجة الصدمة والاستجابة الالتهابية. لذلك ، قد يصبح الحد من الضعف الإدراكي من منظور التخدير نهجًا ممكنًا. الcistancheالأنواع ('Rou Cong Rong' باللغة الصينية) قد استخدمت كمنشط في الصين لسنوات عديدة. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن cistanches لها وظائف طبية واسعة ، لا سيما على الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك مكافحة موت الخلايا المبرمج ، ومضادات الأكسدة ، ومكافحة الشيخوخة ، ومكافحة التعب ، ومضاد الالتهاب المناعي ، والحماية العصبية. {{5 }} وجد دنغ وآخرون أن إشنكوسايد ، وهو أحد المركبات النشطة الرئيسية للكيستانش ، أظهر تأثيرات وقائية على استماتة خلايا عامل نخر الورم - - المستحثة بـ SH-SY5Y. هيدروكسيل الفينول ، يمكن أن يكون بمثابة مانح للهيدروجين للجذور المختزلة وبالتالي تنظيفها. هناك نوعان من التدفقات الرئيسية التي من خلالهاcistanchesالبحث عن الجذور الحرة ، أي المشاركة المباشرة في إزالة الجذور الحرة أو منع إنتاجها وتنظيم الإنزيمات المضادة للأكسدة المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للجذور الحرة في الجسم الحي ، مثل SOD و CAT و GPX. 15 تساهم إدارة Cistanches في إبطاء الشيخوخة الأنماط الظاهرية وتخفيف التدهور المعرفي في الذباب عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي .16 على سبيل المثال ، قام Zhang et al بالتحقيق في أحد عمليات استخراج cistanches وأكدوا وظيفتها المتمثلة في إطالة العمر. اختلال وظيفي في أي من النماذج الحيوانية أو البشر تحت ظروف سيفوفلوران.

بناءً على النتائج المذكورة أعلاه ، اقترحنا ذلكcistanchesيمكن أن يخفف من الضعف الإدراكي الناجم عن سيفوفلوران. للتحقق من هذه الفرضية ، استخدمنا 24- فئران SD عمرها شهر للحصول على نموذج ضعف إدراكي عن طريق استنشاق سيفوفلوران. بعد ذلك ، استكشفنا الوظيفة الدوائية لـcistanchesمستخلص من مضادات الالتهاب والأكسدة والحماية العصبية. كما تم التحقيق في آلية cistanches على الضعف الإدراكي الناجم عن Sevoflurane.

2|المواد والأساليب

2.1|تحضير مستخلص Cistanches Herba وتوحيده

استخراجcistanchesوفقًا للأعمال السابقة .18،19 باختصار ،سيستانشتم استخلاص مستخلص Herba مع 95 بالمائة من الإيثانول في الماء وتم تجفيفه إلى المسحوق. تم تطبيق المستخلص عند 10 مجم / مل على التحليل الكيميائي الكمي لإشنكوسايد بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء للطور العكسي (HPLC). تم الحصول على المركب القياسي ، echinacoside ، من Haoxuanbio (Xi'an ، Shaanxi ، الصين).

2.2|نموذج الفئران للخلل الإدراكي الناجم عن سيفوفلوران والعلاج مع cistanche

تم شراء فئران ذكر Sprague Dawley (SD) التي تتراوح أعمارها بين 3 و 24 شهرًا من Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.، Ltd. تمت تربية الفئران في أقفاص أكريليك نظيفة مع إمكانية الوصول مجانًا إلى الماء والطعام في غضون 12- ساعة من الضوء / دورة مظلمة عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 21 درجة ± 1 درجة ورطوبة (45 بالمائة -65 بالمائة) لمدة أسبوع قبل تجربة الإقامة. تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان في مستشفى الشعب السابع بجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تم إجراء جميع الاختبارات السلوكية في غرفة ذات درجة حرارة (21 درجة ± 1 درجة) - ورطوبة (45 بالمائة -65 بالمائة) - غرفة خاضعة للتحكم.

في المجموعة الأولى من التجارب في الجسم الحي ، تم استخدام 3- و 24- شهر من ذكور جرذان SD. ستة عشر 3- من الفئران عمرها 200- 250 جم وستة عشر 24- شهرًا تزن 240-300 جم تم تعيينها عشوائيًا إلى indraft sevoflurane (Jiangsu Hengrui Medicine Co.، Ltd. ، Lianyungang ، الصين) أو الغاز الحامل (ن=8 لكل مجموعة). تعرضت الحيوانات في مجموعات التخدير (SEVO) إلى 2.6 في المائة من تركيز سيفوفلوران الذي تم تسليمه بواسطة غاز ناقل O2 مرطب بنسبة 30 في المائة لمدة 4 ساعات بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة باستخدام جهاز تخدير مزود بشاشة متعددة الغازات (بريزما SP Alpa ، Oxon ، المملكة المتحدة). تعرضت الفئران في المجموعة الضابطة للغاز الحامل بدون سيفوفلوران في نفس الوقت.

لمدة 4 ساعات (ن=8 لكل مجموعة). أجريت الاختبارات السلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث بعد التخدير. ثم قُتلت الحيوانات مباشرة بعد التقييم السلوكي في اليوم الثالث ، واستخدم الحصين في الدماغ للتحليلات الجزيئية. في المجموعة الثالثة من التجارب ، تم تقسيم جميع الفئران المخدرة بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات (ن=8 لكل مجموعة): (أ) مجموعة SEVO ؛ (ب) مجموعة SEVO plus GW9662 (مضاد لـ PPAR- ، 30 نانوغرام في كل مرة) ؛

(ج) SEVO pluscistancheمجموعة؛ و (د) SEVO pluscistancheبالإضافة إلى مجموعة GW9662. كانت التجارب اللاحقة مماثلة للوصف في المجموعة الثانية من التجارب.

2.3|الاختبار السلوكي

تم إجراء اختبار Morris Water Maze على النحو الموصوف سابقًا مع تعديل طفيف لتقييم الذاكرة المكانية وقدرات التعلم لدى الجرذان في الدراسة الحالية. 8،2 0 تم ملء خزان حتى عمق 40 سم بالماء وجعله معتمًا عن طريق إضافة طلاء تمبرا أبيض غير سام. تم الحفاظ على درجة حرارة الماء عند 22 ± 1 درجة لمنع الفأر من الطفو. تم وضع منصة هروب دائرية (نصف قطرها 11 سم) تحت سطح الماء بمقدار 0. 5-1 سم في واحد من أربعة أرباع. في ثلاث نقاط زمنية ، تم اختبار الفئران للذاكرة المرجعية بعد التدريب لمدة 5 أيام ويتألف كل قسم تجريبي من أربع تجارب بفاصل 15 دقيقة. في النقطة الزمنية الثانية والثالثة ، تمت إزالة المنصة من البركة ، ثم تم إجراء قياس الذاكرة المكانية والعاملة. تم تسجيل الوقت الذي يقضيه كل فأر في البحث عن النظام الأساسي باعتباره وقت استجابة الهروب. بعد التجارب ، وضعت الفئران في أقفاص ساخنة قبل أن تعود إلى أقفاصها.

تم إجراء اختبار المجال المفتوح في اليوم الأول واليوم الثالث بعد التخدير كما وصفه Fricano et al. باختصار ، تم اختبار الفئران في ساحة مربعة مقاس 27.5 سم × 27.5 سم. الوسط ، 66 في المائة من الساحة ، كان يسمى "الوسط". تم تسجيل الوقت الذي يقضيه في المركز كمعامل لتقييم سلوك مزيل القلق.

تم إجراء اختبار تكييف الخوف كما هو موضح سابقًا مع تعديل طفيف لاستكشاف الذاكرة المكانية وقدرات التعلم لدى الفئران في الدراسة الحالية. 22 ، 23 تم إجراء التدريب في يوم واحد بعد التخدير. سُمح لكل فأر بالتكيف مع الغرفة لمدة 12 {{6} ثانية ، متبوعًا بالتعرض لمحفز صوتي (20 ثانية ، 80 ديسيبل) ثم صدمة كهربائية بالقدم (ثانيتان ، 0.75 مللي أمبير) 25 ثانية بعد الصوت انتهى التحفيز. تكررت عمليات التعريض الضوئي مرتين ، مع 60- فواصل زمنية بين التعريضات الضوئية الثانية والثالثة. تم إجراء اختبار السياق في اليومين الثاني والثالث بعد الجراحة. تم وضع كل فأر في نفس الحجرة المستخدمة للتدريب ، متبوعًا بعدم وجود حافز أو صدمة قدم لنفس الفترة الفاصلة المستخدمة في تدريب الحيوان. تم تسجيل النتائج ، وتم جمع النسبة المئوية لزمن التجمد (غير متحرك).

2.4|جمع الأنسجة

بعد التحليل السلوكي في اليوم الثالث بعد التخدير ، تم قتل الفئران التجريبية. بعد ذلك ، تمت إزالة أنسجة المخ على الفور وتم تشريح الحُصين بعناية. بالنسبة لتحليل البروتينات والحمض النووي الريبي والسيتوكينات ، تم تجميد الحُصين في النيتروجين السائل على الفور وتخزينه عند درجة -80 درجة. بالنسبة للتحليل الكيميائي المناعي ، تم إصلاح الأنسجة بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 72 ساعة ثم نقلها إلى 20 في المائة سكروز لمدة 72 ساعة أخرى.

2.5|انزيم مرتبط المناعي فحص

تم قتل جميع الفئران بعد اختبار السلوك في اليوم الثالث. تم تشريح أنسجة الحصين على الجليد على الفور وتم تجانسها في محلول ملحي بواسطة الموجات فوق الصوتية. بعد ذلك ، تم إجراء الطرد المركزي عند 10 000 × جم عند 4 درجة لمدة 15 دقيقة. تم تحديد مستويات IL -1 و TNF- و IL -6 بواسطة مجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كانت حدود الاكتشاف 8. 0 بيكوغرام / مل لـ IL {{1 0} ، 8. 0 بيكوغرام / مل لـ TNF- و 4.0 بيكوغرام / مل لـ IL {{16} }. تم أيضًا قياس تركيزات البلازما IL -1 و TNF- و IL -6 في اليوم الأول واليوم الثالث باستخدام ELISA.

2.6|تحديد النتريت / النترات والأضرار المؤكسدة للدهون والبروتينات

تم قياس تركيز النتريت / النترات (NO2−) في المادة الطافية المجمعة بواسطة تفاعل Griess (Sigma ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي أظهر كمؤشر على إنتاج أكسيد النيتريك (NO). باختصار ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من كاشف Griess إلى 100 ميكرولتر من المادة الطافية. تم قياس محتوى البروتين الكلي للمادة الطافية باستخدام مجموعة كاشف اختبار بروتين BCA (KeyGEN ، الصين) بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، وتم قياس الامتصاصية باستخدام مقياس طيف ضوئي عند 550 نانومتر. النتائج هي nmol من NO - لكل ملغ من البروتين.

تم تحديد مستوى malondialdehyde (MDA) في قرن آمون بواسطة مجموعة مقايسة MDA (معهد Jiancheng Bioengineering Institute ، نانجينغ ، الصين) بعد جمعها عن طريق التجانس والطرد المركزي. تم تحديد الضرر التأكسدي للدهون بواسطة مقايسة المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS). باختصار ، تم ترسيب العينات الطافية بنسبة 1 0 في المائة من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. ثم تمت إضافة حمض الثيوباربيتوريك (0.67 بالمائة) ، وتم اختبار الامتصاصية عند 535 نانومتر. 1،1،3 ، 3- بروبان رباعي الميثوكسي كمعيار خارجي وتم التعبير عن البيانات كنومول من مكافئات malondialdehyde لكل مجم من البروتين.

2.7|الكشف عن نشاط إنزيم مضادات الأكسدة

لقياس نشاط ديسموتاز الفائق (SOD) ، تمت إضافة 1 {{1 0} ميكرولتر من المواد الطافية التي تم الحصول عليها عن طريق تجانس الأنسجة والطرد المركزي (10 000 × جم ، 15 دقيقة) عند 4 درجات إلى 2 0 0 ميكرولتر من محلول التفاعل (50 ميكرولتر تترازوليوم بالإضافة إلى 19.95 مليلتر من المحلول المنظم ، بما في ذلك 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك و 0.1 ملي مول / لتر هيبوكسانتين و 0.1 ملي مول / لتر ثنائي إيثيلين تريامين حمض فوق الخليك ، ودرجة الحموضة 8.0). بعد ذلك ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من أكسيد الزانثين إلى المخاليط لبدء التفاعل. بعد الاهتزاز والاحتضان لمدة 20 دقيقة ، تم تسجيل تغيرات الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تم حساب أنشطة SOD باستخدام الصيغة المرفقة مع مجموعة الكشف (شركة كايمان كيميكال ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم تحديد نشاط CAT في طاف نسيج الحصين بالطيف الضوئي عن طريق حساب معدل تحلل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) عند 24 0 نانومتر. باختصار ، تمت إضافة قسامة مقدارها 1 0 0 ميكرولتر من المادة الطافية (20 ميكرولتر) إلى خليط الركيزة (1000 ميكرولتر) تحتوي على 0.3 مل من H O في 50 مل من 0.05 مول / لتر PBS (الرقم الهيدروجيني) 7.0). تم تسجيل الامتصاص بعد دقيقة واحدة من بدء التفاعل. تم حساب النتائج باستخدام المعايير الخارجية وتم التعبير عنها بـ U لكل مجم من البروتين.

2.8|عزل الحمض النووي الريبي و PCR الكمي

تم تجانس أنسجة الحصين للحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام TRIzol (Invitrogen) ، ثم تم تنفيذ تضخيم النص باستخدام iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). تم تضخيم (كدنا) الناتج بواسطة qPCR باستخدام iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) مع بادئات التمهيدي الخاصة بالجينات ، وتم حساب التعبير النسبي لكل جين باستخدام طريقة 2 − Ct وتم تطبيعه للتحكم في GAPDH. يتم عرض تسلسل التمهيدي في الجدول S1.

2.9|لطخة غربية

تم تجانس أنسجة الحصين في المخزن المؤقت لتحلل الخلايا (5 0 مليمول / لتر تريس ، درجة الحموضة 7.5 ، 1 مليمول / لتر EDTA ، 15 0 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.5 بالمائة Triton X -100 ، 0.5 بالمائة NP -40 ، 1 مليمول / لتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد ، 5 مليمول / لتر فانات الصوديوم ، 1 مليمول / لتر فلوريد الصوديوم ، 1 ميكروغرام / مل من أبروتينين ، بيبستاتين وليوببتين). تم فصل البروتينات بواسطة المواد الهلامية SDS- PAGE ، ثم تم نقل البروتينات الموجودة في المواد الهلامية إلى أغشية PVDF (Millipore). تم حظر الأغشية باستخدام حليب بنسبة 5 في المائة ثم حضنت بأجسام مضادة أولية محددة ، بما في ذلك مضادات - - APP (ab76763 ، تخفيف 1: 1000) ، ومضاد BDNF (ab108319 ، تخفيف 1: 1000) ، ومضاد GFAP (ab68428 ، تخفيف 1: 1000) ، مضاد لـ Iba -1 (ab178847 ، تخفيف 1: 1000) ، مضاد لـ PPAR- (ab209350 ، تخفيف 1: 1000) ، مضاد NF-B (ab32360 ، تخفيف 1: 1000) ومكافحة GAPDH (تخفيف ab181602 ، 1: 1000). بعد ذلك ، تم استخدام TBST لغسل الأغشية ثم احتضانها بالأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP (سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). أخيرًا ، تمت ملاحظة البروتين ذي الصلة بواسطة نظام ECL (PerkinElmer) في ضوء شرح الشركة المصنعة. وتم تطبيق ImageJ للتحليل الكمي للتعبير النسبي للبروتين.

2.10|تحليل فرز الخلايا (FACS) المنشط بالفلورة

لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ، تم جمع خلايا الحصين بعد العزل على الفور. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا باستخدام محلول ملحي مبرد بالفوسفات (PBS) وأعيد تعليقه في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 في المائة من FBS. لكل اختبار ، تم تلوين 1 × 105 خلية في 100 ميكرولتر PBS-FBS باستخدام CD11b مترافق بشكل فلوري (BD PharMingen ، الكتالوج رقم 554982 ، 1: 250) و CD45 (BD PharMingen ، الكتالوج رقم 554878 ، 1: 250) على الجليد من أجل ساعتان عند 4 درجات في الظلام. بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، تم تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS-FBS. وتم إجراء تحليل التدفق الخلوي على مقياس التدفق الخلوي FACSAria I (BD Biosciences). تم تحليل النتائج باستخدام FlowJo (الإصدار 7.6.1).

2.11|تلطيخ نيسل

تم تضمين الحصين الذي تم جمعه في مركب OCT ثم تم تقطيعه إلى أقسام إكليلية {0} ميكرومتر باستخدام مشراح متجمد (لايكا). بعد تركيب الذوبان على الشرائح المشحونة ، تم غسل المقاطع بـ 0. 01 جزيء جرامي / لتر PBS ثلاث مرات لمدة إجمالي 15 دقيقة ثم تم تحضينها في محلول كريسيل البنفسجي (0.5 بالمائة ، يحتوي على بضع قطرات من الخل الجليدي acid) لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل بالماء المقطر مرتين ، تم تجفيف المقاطع في الإيثانول تدريجيًا (70 بالمائة و 85 بالمائة و 95 بالمائة و 100 بالمائة). بعد الجفاف ، تم وضعها في زيلين وتغطيتها باستخدام وسط تصاعد. أخيرًا ، لوحظ تلطيخ Nissl تحت النطاق الدقيق (لايكا).

2.12|تحليل البيانات

تم تحليل البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism 6. 0. تم تحليل البيانات في دراسات السلوك في نقاط زمنية مختلفة (يوم 1 أو يوم 3) بعد تخدير سيفوفلوران باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع مقاييس متكررة. تم تحليل البيانات الأخرى باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه قبل اختبار Bonferroni. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ ، وتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SEM P <.05 اعتبر="" مختلفًا="">

3|النتائج

3.1|منع Cistanche التهاب الأعصاب غير الطبيعي في الفئران المسنة

لاستكشاف الاختلاف في الوظيفة الإدراكية بين الجرذان البالغة والشيخوخة ، تم استخدام سيفوفلوران للحث على التخدير في الفئران البالغة من العمر 3- و 24- شهرًا. بعد ذلك ، تم تقييم السلوك المعتمد على الحصين في اليوم الأول واليوم الثالث (الشكل S1A). كما هو مبين في الشكل S1B ، لم يكن هناك فرق في زمن الهروب لأربع مجموعات تجريبية في اليوم الأول. علاوة على ذلك ، كان الوقت الذي يقضيه في المركز والنسبة المئوية للتجميد مماثلاً للفئران التي تلقت مركبة وسيفوفلوران في اليوم الأول (الشكل S1C ، د). ومع ذلك ، كان للفئران البالغة من العمر 3- و 24- شهرًا اختلافات كبيرة في وقت استجابة الهروب والوقت الذي يقضيه في المركز ونسبة

التجميد بعد تحريض سيفوفلوران في اليوم الثالث ، مما يشير إلى أن سيفوفلوران غيّر الوظيفة المعرفية للحيوانات المسنة بشكل كبير (الشكل S1B-D). وهكذا ، تم استخدام الفئران المسنة للتجارب اللاحقة.

للتحقيق في آثار cistanche على التهاب الأعصاب في الفئران المسنة التي تخضع لتعرض سيفوفلوران ، قمنا بتقييم مستويات السيتوكين المؤيد للالتهابات. شوهد الدليل على التهاب الأعصاب بعد 24 ساعة من تخدير سيفوفلوران ، كما يتضح من التركيز العالي من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات IL -1 و IL -6 و TNF- في البلازميد في اليوم الأول واليوم الثالث (الشكل 1 أ ، 1) ، وأشير إلى التهاب الأعصاب بواسطة الرنا المرسال المرتفع للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات في الحصين حتى 3 أيام (الشكل 1C-E). لكل من العوامل المؤيدة للالتهابات ، قضى علاج cistanche على الاختلافات في التغيرات التي يسببها سيفوفلوران في الوسطاء المسببة للالتهابات. خفف Cistanche بشكل ملحوظ السيتوكينات المرتفعة المؤيدة للالتهابات في سيفوفلوران

3.2|علاج مستخلص Cistanches Herba يخفف الإجهاد التأكسدي الناجم عن Sevoflurane في قرن آمون للفئران المسنة

بعد ذلك ، قمنا بالتحقيق في آثار cistanche على الإجهاد التأكسدي الناجم عن Sevoflurane. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، وجدنا أن علاج السيستانش منع الإجهاد التأكسدي الناجم عن سيفوفلوران ، كما هو مقترح من خلال انخفاض تركيز النتريت / النترات في الحصين بشكل ملحوظ. لاحظنا أيضًا أن مجموعة SEVO plus cistanche قدمت مستويات أقل من مكافئات MDA ، وهو مؤشر للضرر التأكسدي للدهون ، في الحُصين بعد ثلاثة أيام من استنشاق سيفوفلوران ، مقارنةً بـ SEVO

المجموعة (الشكل 2 ب). بالإضافة إلى ذلك ، قدمت الفئران التي خضعت لتخدير سيفوفلوران (مجموعة SEVO) انخفاضًا كبيرًا في نشاط SOD و CAT في اليوم الثالث بعد التخدير في قرن آمون. ومع ذلك ، تمت زيادة نشاط الحصين لهذه الإنزيمات بشكل كبير في مجموعة SEVO بالإضافة إلى مجموعة cistanche ، مقارنة بمجموعة SEVO (الشكل 2C ، D).

سيستانشمكمل غذائي يخفف من الإجهاد الناتج عن مضادات الأكسدة

3.3|علاج مستخلص Cistanches Herba يخفف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة

يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء المختبر أو التهاب الحُصين الناجم عن التخدير ، والذي يساهم بعد ذلك في التقدم المرضي. لاستكشاف ما إذا كان يمكن أن يمنع cistanche تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، قمنا بقياس عدد سكان الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وعلاماتها النسبية. عبرت الخلايا الدبقية الصغيرة المستريحة عن CD11b وتعبير منخفض عن CD45 ، بينما عبرت الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة عن CD11b ومستوى عالٍ من CD45. كما هو معروض في الشكل 3 أ ، أكدت نتائج تحليل قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية لـ CD45 كانت أقل بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة بالكيستانش مقارنة بالفئران التي يسببها SEVO (0. 495 ± 0. {{15} } 51 في المائة بعد علاج cistanche مقابل 1.127 ± 0.032 في المائة في مجموعة SEVO). بعد ذلك ، قمنا بقياس العلامات الدبقية بواسطة qRT-PCR. بعد التخدير مع سيفوفلوران ، مرنا

3.4|علاج مستخلص Cistanches Herba يخفف موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن Sevoflurane

يحدث موت الخلايا المبرمج العصبي جزئيًا بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة النشطة والإجهاد التأكسدي ، وقد أكدنا أن cistanche يمكن أن يمنع تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والإجهاد التأكسدي في الجسم الحي. لمزيد من التحقيق في التأثيرات الدوائية للقيود ، اختبرنا موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية باستخدام تلطيخ TUNEL و caspase 3 المشقوق و Bax / Bcl -2 immunoblot. كما هو معروض في الشكل 4 أ ، زاد سيفوفلوران موت الخلايا المبرمج في مناطق الحصين. خفضت إدارة Cistanche خلايا TUNEL plus بعد تخدير سيفوفلوران. لقد أوضحنا أيضًا المستويات العالية الملحوظة من كاسباس 3 و باكس ، بينما المستويات المنخفضة من Bcl -2 في قرن آمون للفئران المسنة المخدرة. كشفت الفئران التي تلقت إدارة cistanche قبل التخدير عن انخفاض كبير في نشاط caspase 3 (الشكل 4B) ، و caspase 3 المشقوق ، وبروتين Bax (الشكل 4C ، D) ، والذي كان متسقًا مع موت الخلايا المبرمج الخلايا العصبية المنخفض لوحظ في تلطيخ TUNEL.

3.5|علاج مستخلص Cistanches Herba يخفف من الخلل الوظيفي الإدراكي وضعف أنسجة الحصين بعد التخدير الناجم عن Sevoflurane

لمزيد من التحقيق في دور cistanche على الوظيفة الإدراكية ، تعرضت الفئران لـ 50 مجم / كجم من cistanche شفويا لمدة ثلاثة أيام متتالية قبل التخدير. في المجموعة المعالجة بالكيستانتش (المجموعة SEVO بالإضافة إلى cistanche) ، تم تقصير زمن الهروب بشكل كبير ، وكان الوقت الذي يقضيه في المركز أطول ، وزادت النسبة المئوية للتجميد في اليوم الثالث بعد التخدير عند مقارنتها بمجموعة SEVO (الشكل 5A- ج). أشارت هذه النتائج إلى أن cistanche يمكن أن ينقذ جزئيًا على الأقل ضعف الإدراك. قمنا كذلك بتقييم مدى موت الخلايا العصبية في حصين الفئران في أربع مجموعات بواسطة تلطيخ نيسل. أظهرت الصور أن الخلايا لا يوجد بها شذوذ واضح في التحكم في المجموعة والتحكم في المجموعة بالإضافة إلى الاتزان. ومع ذلك ، انخفض عدد الخلايا العصبية على قيد الحياة في مناطق CA1 بشكل كبير في الفئران التي يسببها SEVO مقارنةً بالمجموعة الضابطة في اليوم الثالث. عكس العلاج باستخدام cistanche هذا التأثير لـ SEVO ويعزز بشكل كبير بقاء الخلايا العصبية مقارنةً بـ SEVO الذي يسببه وحده. (الشكل 5 د).

3.6|قلل العلاج بمستخلص Cistanches Herba من إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي يسببها سيفوفلوران بطريقة حساسة لـ PPAR - -

قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كان تأثير cistanche على إنتاج السيتوكينات حساسًا لـ PPAR - -. أدى العلاج بـ GW9662 (مجموعة SEVO بالإضافة إلى GW9662) إلى زيادة مستويات IL -1 و IL -6 و TNF- مقارنة بمجموعة SEVO. ومع ذلك ، فإن العلاج باستخدام cistanche يقلل من إنتاج السيتوكين المؤيد للالتهابات الناجم عن SEVO. من المذكرة،

3.7|يمنع علاج مستخلص Cistanches Herba الإجهاد التأكسدي الناجم عن Sevoflurane عبر PPAR-

تم الإبلاغ عن أن سيفوفلوران يبالغ في الخلل المعرفي في نموذج الفئران المزمن الناجم عن نقص الأكسجة من خلال تثبيط تعبير PPAR في الحصين.cistancheحدثت بطريقة PPAR - - التابعة. لهذا الغرض ، تم استخدام GW9662 ، وهو مضاد انتقائي ولا رجوع فيه لـ PPAR- ، لمزيد من الدراسة. عزز العلاج بـ GW9662 عند 30 نانوغرام الإجهاد التأكسدي ، كما يتضح من زيادة مستويات النتريت / النترات و MDA. ومع ذلك ، تمت زيادة الواسمات المضادة للأكسدة SOD و CAT في قرن آمون في اليوم الثالث مقارنة بالفئران التي تديرها SEVO. العلاج بcistancheخفض الإنتاج المفرط الناجم عن SEVO لعلامات الإجهاد التأكسدي ويسهل نشاط SOD و CAT (الشكل 7 أ-د). علاوة على ذلك ، هذه الآثار التي تنتجهاcistancheتمت إعادتها بواسطة GW9662 ، كما لوحظ من خلال زيادة إنتاج النتريت / النترات (الشكل 7 أ) و MDA (الشكل 7 ب). بالإضافة إلى ذلك ، فإن

تم أيضًا إرجاع تأثيرات cistanche على نشاط SOD و CAT بواسطة GW9662 (الشكل 7C ، D) ، مما يشير إلى مشاركة PPAR-.

3.8|أدى العلاج بمستخلص Cistanches Herba إلى تثبيط تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وموت الخلايا العصبية وخفف التدهور المعرفي بطريقة حساسة لـ PPAR - -

كانت الخطوة التالية هي استكشاف ما إذا كانت تأثيراتcistancheعلى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وموت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية كانت حساسة لـ PPAR - -. أدى العلاج باستخدام GW9662 إلى زيادة مستويات الرنا المرسال لكل من CD68 (الشكل 8 أ) و GFAP (الشكل 8 ب) وإيبا -1 (الشكل 8 ج). والجدير بالذكر أن هذه التأثيرات الناتجة عن GW9662 قد تم إرجاعها بشكل فعال بواسطةcistanche، كما لوحظ من خلال انخفاض في هذه العلامات نفسها (الشكل 8A-C). علاوة على ذلك ، تم أيضًا عكس تعبير البروتين عن GFAP و Iba -1 الذي تنتجه GW9662 عن طريق cistanche ، مما يشير إلى أن cistanche يمنع تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، ويعتمد جزئيًا على الأقل على PPAR-. بالإضافة إلى ذلك ، تم منع تأثير cistanche على التعبير البروتيني -APP و BDNF بواسطة GW9662 (الشكل 8D ، E). للتحقق مما إذا كان cistanche يمكن أن يثبط موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية بطريقة حساسة PPAR - - ، تم اكتشاف البروتينات المرتبطة بالاستماتة. كما هو مبين في الشكل 8F ، G ، قلل التواجد عند 50 مجم / كجم من التعبير عن البروتين المؤيد لموت الخلايا المبرمج (كاسباس المشقوق 3 و Bax). ومع ذلك ، تم إنقاذ هذه التأثيرات إلى حد كبير بواسطة GW9662.

سيستانشيمكن أن يخفف المستخلص من موت الخلايا المبرمج

نظرًا لأن مستويات الإجهاد التأكسدي والالتهاب كانت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالوظيفة الإدراكية في فئران ما بعد التخدير ، فقد حددنا أيضًا ما إذا كان تأثيرcistancheعلى الخلل المعرفي كان PPAR - - معتمدًا. كما هو مبين في الشكل 8H-J ، مقارنة بالفئران