الجزء 1: آثار المستخلص المائي لـ Cistanche Tubulosa على ميكروبيوتا الأمعاء للفئران المصابة باضطرابات معوية

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

ترتبط اضطرابات ميكروبيوتا الأمعاء بالعديد من الأمراض. * ه مستخلص مائي منسيستانش توبولوسا (CT)، تركيبة عشبية صينية تقليدية ، تم الإبلاغ عنها أنها تلعب دورًا فيحماية الأمعاء البشرية. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن آثاره على ميكروبيوتا الأمعاء. * تم إجراء الدراسة الحالية لتحديد ما إذا كان المستخلص المائي المقطعي المحوسب يمكنه تعديل ميكروبيوم الأمعاء في الفئران المصابة باضطرابات معوية. وجدنا أن التالفةمورفولوجيا الأمعاءالناتجة عن العلاج بالسيفيكسيم يمكن إنقاذها باستخدام المستخلص المائي للتصوير المقطعي المحوسب. * أشارت مقارنة التنوع الميكروبي بين الفئران المعالجة بمستخلص التصوير المقطعي المحوسب والفئران الضابطة أيضًا إلى أنه يمكن استعادة الاضطراب في مجتمع الميكروبيوم لمجموعات النماذج عن طريق العلاج بتركيزات عالية ومتوسطة من المستخلص المائي. أدى العلاج بالسيفيكسيم إلى انخفاض معنوي في بكتيريا حمض اللاكتيك. ومع ذلك ، فإن مكملات المستخلص المائي CT استعادت نمو بكتيريا حمض اللاكتيك هذه. علاوة على ذلك ، كان المستخلص المائي المقطعي المحوسب قادرًا على تخفيف التغيرات الدراماتيكية في المسارات الأيضية لميكروبيوم الأمعاء الناجم عن سيفيكسيم. * قدمت هذه النتائج نظرة ثاقبة على الآثار المفيدة للمستخلص المائي المقطعي المحوسب على ميكروبيوتا الأمعاء ، كما أنها قدمت مرجعًا مهمًا لتطوير الأدوية ذات الصلة في المستقبل.

Cistanche من أجل استرخاء الأمعاء ، من فضلك انقرهنالمعرفة المزيد

مقدمة

أثبتت أن C.السكريات الصحراويةتحفيز تكون الميلانين فيالخلايا الصباغية، وتقليل الإجهاد التأكسدي [15] ، وتخفيف الخلل المعرفي عن طريق تنظيم مضادات الأكسدة والعمليات المضادة للالتهابات في الجرذان [16] ، وحماية خلايا PC12 ضد الإصابات الناجمة عن OGD / RP [17] ، وتعزيز امتصاص إكيناكوسيد في الجسم الحي ، والتأثير على الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء [ 18]. البروبيوتيك هي كائنات دقيقة حية غير مسببة للأمراض لها فوائد صحية وتضفي التوازن الميكروبي في الجهاز الهضمي عند تناولها بكميات كافية [19]. * يمكن لـ ey تعزيز الاستجابات المناعية الخلوية غير النوعية التي تتميز بتنشيط الضامة والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا الخاصة بمستضد معين وإطلاق السيتوكينات المختلفة بطريقة خاصة بالسلالة وتعتمد على الجرعة [20]. تعمل سلالات البروبيوتيك على تحسين خصائص ظهارة الأمعاء عن طريق تعديل TJ ، وقد تم إثبات سلالات بروبيوتيك معينة لتنظيم تعبير الميوسين ، وبالتالي التأثير على خصائص الطبقة المخاطية وتنظيم الجهاز المناعي للأمعاء بشكل غير مباشر [21]. تعتبر سلالات بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) و Bifidobacterium من البروبيوتيكات الرئيسية التي تم استخدامها في العديد من المجالات [22-26]. * الفوائد الصحية لها عديدة ، حيث تعد قدرتها المضادة للأكسدة عاملاً مهمًا في وظائفها المتعلقة بالصحة [27]. يمكن للبروبيوتيك أن تخلب أيونات المعادن لمنعها من تحفيز الأكسدة [28 ، 29] ؛ يمكنهم أيضًا زيادة تعبير الإنزيمات المضادة للأكسدة [30 ، 31] ، وإنتاج مستقلبات مختلفة مع نشاط مضاد للأكسدة [32 ، 33] ، والتوسط في مسارات إشارات مضادات الأكسدة [34-36] ، وتنظيم الإنزيمات المنتجة لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) واستجابة الأمعاء الكائنات الحية الدقيقة للإجهاد التأكسدي [37]. أظهرت دراسة حديثة أن السكريات المتعددة الموجودة في القرص المضغوط يمكن أن تحفز نمو بعض بكتيريا حمض اللاكتيك ، والتي يمكن أن تفيد صحة الإنسان [38]. ومع ذلك ، فإن محتوى السكريات المتعددة في القرص المضغوط يختلف عن المحتوى الموجود في التصوير المقطعي المحوسب [7 ، 39] ، وقد يؤدي هذا الاختلاف إلى حدوث اختلافات في العدوى في الكائنات الحية الدقيقة المعوية. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن السكريات المتعددة للقرص المضغوط يمكن أن تقلل من الإجهاد التأكسدي عن طريق تنشيط مسار NRF2 / HO -1 [15] ، فإن تأثيرات السكريات الفردية قد تختلف عن التأثير العام للتركيبات المتعددة في التصوير المقطعي المحوسب. * بالنسبة لنا ، من الضروري أن نحدد بدقة آثار المستخلصات المائية للتصوير المقطعي المحوسب على الكائنات الحية الدقيقة المعوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمراوح أيضًا مقاومة الإجهاد التأكسدي [40] وقمع الاستجابات الالتهابية بوساطة تحلل الدهون عن طريق تنشيط مسار Keap1 / Nrf2 / HO -1 [41]. * من قبل ، كان تحديد تأثير المستخلص المائي المقطعي المحوسب ذا قيمة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تشير تأثيرات بعض مكونات المستخلص المائي CD على الإجهاد التأكسدي والنباتات المعوية إلى أن مقاومة الإجهاد التأكسدي قد تكون مرتبطة بتغيرات الفلورا المعوية. من أجل سد الثغرات في المعرفة حول الموضوعات المذكورة أعلاه ، قمنا بالتحقيق في آثار مستخلص CTaqueous على ميكروبيوتا الأمعاء للفئران المصابة باضطرابات الفلورا المعوية. * ستوفر هذه النتائج معلومات قيمة حول الآليات المحتملة التي يتم من خلالها تغيير الجراثيم المعوية ومقاومة الأمعاء للإجهاد التأكسدي.

2. المواد والأساليب

يتم تناوله يوميًا في الساعة 12: 00 ساعة ، ويتم تناول المواد الأخرى يوميًا في الساعة 15: 00 ساعة. أثناء التجارب ، تم الاحتفاظ بمجموعات C و D و E و F في حالة نموذجية لاضطرابات الأمعاء. * تم جمع البراز كل سبعة أيام على طاولة قابلة للتشغيل المعقمة وتخزينها عند -20 درجة .2.4. مراقبة الأنسجة من الفئران القولون. في نهاية التجربة ، قُتلت الفئران بسبب خلع عنق الرحم ، وتم جمع محتويات القولون على طاولة قابلة للتشغيل المعقمة وتخزينها عند -80 درجة ؛ في الوقت نفسه ، تم تثبيت عينات أنسجة القولون في فورمالين محايد بنسبة 10 في المائة. * ar ، تم تجفيف العينات باستخدام تركيز متدرج من الإيثانول ، وتم تحليتها باستخدام الزيلين ، ومضمنة في البارافين ، ومقطعة ، وملطخة بهيماتوكسيلين يوزين. لوحظت التغيرات المورفولوجية في الغشاء المخاطي للقولون وتمت مقارنتها باستخدام المجهر الضوئي. تم قياس طول الزغابة وعمق القبو في القولون ، وتم حساب نسبة طول الزغابة إلى عمق القبو (قيمة V / C) (51) .2.5. استخراج الحمض النووي وبناء المكتبة. تم استخراج الحمض النووي من البراز باستخدام EZNA ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek ، Norcross ، GA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد جودة الحمض النووي باستخدام مقياس التألق (QuantiFluor ™ –ST ، Promega Corporation ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصميم البادئات المزدوجة في منطقة V4 من 16s rDNA لتضخيم المنطقة وإنتاج 466 نقطة أساس من شظايا الحمض النووي. * كان التمهيدي الأمامي 341F (-5- CCTACGGGNGGCWGCAG -3-) ، وكان التمهيدي العكسي 806R (-5- GGACTACHVGGGTATCTAAT -3-). كان حجم كل PCR 25 ميكرولتر ، يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10 × PCR عازلة ، 2 ميكرولتر من dNTPs ، 1 ميكرولتر من كل تمهيدي ، و 20-30 نانوغرام من قالب DNA. * ar ، تم إرفاق المحولات المفهرسة بنهاية الأمبليكونات لإنشاء مكتبات التسلسل. * تم التحقق من صحة المكتبات باستخدام مقياس التألق QuantiFluor ™ وقيمتها إلى 10 نانومول. 16s تسلسل الجينات الرنا الريباسي وتحليل المجتمع الميكروبي. * تم استخدام منصة Illumina (Illumina MiSeq) للحصول على 2 × 250 نقطة أساس من البيانات ذات النهاية المزدوجة. تم الحصول على وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) باستخدام برنامج Uparse من خلال التجميع القياسي مع تشابه 97 بالمائة. * تم استخدام خوارزمية تعيين بايز الساذجة لمصنف RDP لمحاذاة OTUs مع الإصدار 13.5 من قاعدة بيانات Greengene وإجراء شرح توضيحي للأنواع. * تم حساب تنوع ألفا للميكروبات المعوية باستخدام مؤشري شانون وسيمبسون ، وتم تحليل الفروق بين المجموعات عن طريق تحليل التمايز الخطي Effffect Size (LEfSe). * تم تحليل تنوع بيتا من خلال تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) للاختلافات بين برادي وكيرتس. تم استخدام PICRUSt2 لتقدير قدرة التمثيل الغذائي الميكروبي لميكروبيوم الأمعاء [42] .2.7. تحليل البيانات الإحصائية. تم استخدام SPSS 20 لـ ANOVA أحادي الاتجاه ، وتم التعبير عن البيانات التجريبية كـ X ± S ؛ تشير X إلى متوسط ​​القيمة ، وتشير S إلى الانحراف المعياري.

cistanche لتحسين المناعة

3. النتائج

3.1. تم التحقق من صحة تأثير المستخلص المائي المقطعي المحوسب على شكل القولون. لتحديد تأثير المستخلص المائي على القناة الهضمية ، قمنا بفحص طول الزغابات القولونية وعمق التجاويف بعد العلاج بالمستخلص المائي. * الزغابات القولونية في المجموعات الطبيعية والجرعة العالية (A ، B ، D) كانت أطول وتشبه الإصبع ، في حين أن الزغابات القولونية في النموذج ومجموعات الجرعات المنخفضة (C و F) كانت قصيرة ، ونصائح تم كسر الزغب القولون (الشكل 1). وفقًا لذلك ، أدت الجرعات العالية من المستخلص المائي المقطعي المحوسب إلى زيادة كبيرة في طول الزغابات القولونية وتقليل عمق التجويف في الفئران المصابة باضطرابات معوية مقارنة بالفئران في المجموعة النموذجية (P <0. 0="" 1).="" في="" المقابل="" ،="" لم="" يكن="" عمق="" العطلة="" مختلفًا="" بشكل="" كبير="" بين="" مجموعة="" الجرعات="" العالية="" والمجموعة="" العادية="" (p=""> 0.05) (الجدول S1). * أشارت هذه النتائج إلى أن الجرعة العالية من المستخلص المائي المقطعي المحوسب يمكن أن تحسن التشكل داخل القولون للفئران المصابة باضطرابات معوية. تأثير 8e للمستخلص المائي CT على تنوع ميكروبيوتا الأمعاء. أجرينا تسلسل جين الرنا الريباسي 16 ثانية للتحقيق في السبب المحتمل للتغيرات المورفولوجية داخل القولون والتحقيق في التغيرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد العلاج بالمستخلص المائي المقطعي المحوسب. تم الحصول على متوسط ​​100،553 علامة فعالة ، تتراوح من 77،734 إلى 125،144 ، من البيانات الأولية (الجدول S2). * تم تجميع الأيائل في 4932 OTUs (الجدول S3). ثم قمنا بتحليل تنوع ميكروبيوتا الأمعاء بناءً على ثيسيوس. * لم تظهر فهارس شانون وسيمبسون أي فرق بين المجموعة A (طبيعية مع المستخلص المائي CT) والمجموعة B (طبيعية بدون المستخلص المائي CT) (الشكل 2 (أ)). * يشار إلى أنه في الفئران التي لم يتم علاجها بالسيفيكسيم ، قد لا يكون للمستخلص المائي المقطعي المحوسب أي آثار مفيدة أو ضارة إضافية على تنوع ميكروبيوتا الأمعاء. ومع ذلك ، أظهر التنوع في مجموعة النموذج (C) اتجاهًا تنازليًا مقارنةً بالمجموعات العادية. * أظهرت الفئران التي عولجت بالمستخلصات المائية ذات الجرعات العالية والمتوسطة من التصوير المقطعي المحوسب علامات على انتعاش التنوع ، في حين لم تُلاحظ هذه الظاهرة في الفئران التي عولجت بالمستخلص المائي للجرعة المنخفضة من التصوير المقطعي المحوسب (الشكل 2 (أ)). في هذه الأثناء ، كشفت PCoA أن المجموعات الطبيعية (A و B) ومجموعات الاضطرابات المعوية تعطى جرعات عالية (D) وجرعة متوسطة (E) CTaqueous تميل إلى أن تكون مسافات بين العينات أقصر من تلك الموجودة في المجموعة النموذجية وفي المجموعة المنخفضة -جرعة مجموعة مكملات خلاصة CTa المائي (F) (الشكل 2 (ب)). * أشارت النتائج إلى أن المستخلص المائي المقطعي المحوسب يمكن أن يساعد في تحسين تنوع ميكروبيوتا الأمعاء في الفئران المصابة باضطرابات معوية.

3.3 التغييرات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء المعالجة بالمستخلص المائي المقطعي المحوسب. * تمت مقارنة ملامح تكوين الجراثيم الإلكترونية بين المجموعات المختلفة. على مستوى الشعبة ، كانت الوفرة النسبية للبكتيريا المتقنة في المجموعة النموذجية أعلى من تلك الموجودة في المجموعات الأخرى.

الشكل 1: * تأثير المستخلص المائي Cistanche tubulosa (CT) على شكل القولون: تمت إضافة مجموعة عادية مع مستخلص مائي Cistanche tubulosa (CT) بجرعة متوسطة ؛ ب ، مجموعة عادية ؛ C ، مجموعة نموذجية ؛ D ، تمت إضافة المجموعة النموذجية مع مستخلص مائي CT عالي الجرعة ؛ تمت إضافة E ، مجموعة نموذجية مع مستخلص مائي CT متوسط ​​الجرعة ؛ F ، وهي مجموعة نموذجية تحتوي على جرعة منخفضة من المستخلص المائي المقطعي المحوسب. (أ) المجموعة (ب) المجموعة ب (ج) المجموعة ج (د) المجموعة د (هـ) المجموعة هـ (و) المجموعة ف.

(الشكل 3 (أ)). * تشير الزيادة في Proteobacteria إلى أن الميكروبيوم في الفئران النموذجية قد تم تغييره بواسطة سيفيكسيم وأن المستخلص المائي المقطعي المحوسب قد يفيد الكائنات الحية الدقيقة المعوية حيث أن زيادة انتشار البكتيريا المتقلبة هي علامة مركزية للنباتات المعوية المضطربة [43-45]. بالإضافة إلى ذلك ، على مستوى الجنس ، انخفضت الوفرة النسبية لـ Lactobacillus في المجموعة النموذجية مقارنةً بالمجموعات الطبيعية والجرعات العالية ؛ ومع ذلك ، فقد زاد مقارنةً بالمجموعة ذات الجرعة المتوسطة والمنخفضة (الشكل 3 (ب)). * أشارت هذه النتائج إلى أن مستخلص CTaqueous بجرعة عالية قد يعزز نمو بعض البكتيريا من جنس Lactobacillus. تم تحديد الجراثيم التفاضلية بين المجموعات المدروسة أيضًا وفقًا لتحليل LEfSe. * أظهر التحليل أنه ، بعد العلاج بالسيفيكسيم ، زادت الوفرة النسبية من بكتيريا Turicibacter و Alphaproteobacteria و Acidobacteria و Betaproteobacteriales و Chloroflflexi بشكل ملحوظ ، في حين أن الوفرة النسبية للملبنة ، Eubacterium _ nodatum _ المجموعة cardiales و Christensenellaceae _ R -7_ انخفض بشكل ملحوظ مقارنة مع المجموعة العادية (الشكل 4 (أ)). اللافت للنظر ، عندما تم استكمال المجموعة النموذجية بجرعة عالية من المستخلص المائي المقطعي المحوسب ، زادت الوفرة النسبية من Muribaculaceae و Lactobacillus و Kin eosporiaceae و Eubacterium no datum و Pedobacter بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة النموذجية. وفي الوقت نفسه ، انخفضت الوفرة النسبية لبكتيريا Rhodobacter و Ruminococcaceae UCG _013 و Roseburia و Ruminiclostri dium _9 و Candidatus Stoquefifichus بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة النموذجية (الشكل 4 (ب))

الشكل 2: تحليل تنوع ميكروبيوتا الأمعاء لبراز الفئران. (أ) - تنوع مجتمعات البكتيريا المقاسة بمؤشر شانون (أ) ومؤشر سيمبسون (ب) ؛ (ب) مخطط تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) الذي يصور البيانات بناءً على الاختلافات بين Bray-Curtis. تمت إضافة مجموعة عادية مع مستخلص Cistanche tubulosa (CT) المائي بجرعة متوسطة ؛ ب ، مجموعة عادية ؛ C ، مجموعة نموذجية ؛ D ، تمت إضافة مجموعة نموذجية مع مستخلص مائي CT عالي الجرعات ؛ E ، تمت إضافة مجموعة نموذجية مع مستخلص مائي CT متوسط ​​الجرعة ؛ F ، تمت إضافة مجموعة نموذجية مع جرعة منخفضة من المستخلص المائي المقطعي المحوسب.