الجزء الأول|مستخلص Herba Cistanche يعزز توليد ATP للميتوكوندريا في قلوب الفئران وخلايا H9c2

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

هوي يان ليونج وكام مينغ كو

قسم الكيمياء الحيوية ، جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا ، كلير ووتر باي ، منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة ، الصين

الكلمات الرئيسية: ATP ،Cistanche Deserticola، خلايا H9c2 ، القلب ، الميتوكوندريا

الملخص

للتحقيق في الأساس الدوائي لـ "يانغ- تنشيط"عمل Herbal Cistanche [النبات الكامل المجفف منCistanche DeserticolaYC Ma (Orobanchaceae)] ، في الطب الصيني ، تم فحص تأثيرات مستخلص الميثانول من Herba Cistanche على قدرة توليد ATP في الميتوكوندريا باستخدام نموذج قلب الفئران خارج الجسم الحي ومقايسة خلية H9c2 في الموقع. أدى العلاج بمستخلص Herba Cistanche إلى زيادة قدرة تكوين ATP في عضلة القلب بطريقة تعتمد على الجرعة في الفئران ، وفقًا لتقييم القياس في المختبر. ارتبط تحفيز قدرة توليد ATP بتحسين موازٍ في نقل الإلكترون في الميتوكوندريا بدعم من البيروفات ولكن ليس السكسينات. كما أدى علاج Herba Cistanche أيضًا إلى زيادة نشاط الميتوكوندريا المركب I و III لعضلة القلب ، مع زيادة مدى التحفيز على النشاط المركب I. أنتج علاج Herba Cistanche زيادة تعتمد على الجرعة والوقت في قدرة توليد ATP للميتوكوندريا في خلايا H9c2. تشير النتائج إلى أن علاج Herba Cistanche يمكنزيادة توليد ATP في الميتوكوندريافي قلوب الفئران خارج الجسم الحي وخلايا H9c2 في الموقع ، ربما من خلالتعزيز الفسفرة المؤكسدة.

يمكن أن يحسن القسطرة وظيفة القلب ، وخفض ضغط الدم ، وخفض نسبة الدهون في الدم

مقدمة

يتضمن "تنشيط يانغ" ، الذي يجسد التعزيز العام لوظيفة الجسم في الطب الصيني ، استخدام الطاقة في قيادة العمليات الكيميائية الحيوية المختلفة.

في هذا الصدد ، يتم إنشاء ATP ، وهي العملة العالمية للطاقة في تغذية الوظائف الخلوية ، بشكل أساسي من خلال الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا. لقد افترضنا أن "يانغ تنشيط" الأعشابتمتلك القدرة على زيادة قدرة توليد ATP في الميتوكوندريا(كو وآخرون ، 2004). ويدعم هذا الاكتشاف الأخير الذي توصلنا إليه أن "الأعشاب الصينية المنشطة لليين المغذية" وليس "المغذية لليين" يمكن أن تعزز قدرة توليد ATP لعضلة القلب في قلوب الفئران خارج الجسم الحي (كو وآخرون ، 2006). تم تصنيف Herba Cistanche ، النبات الطفيلي الكامل المجفف (باستثناء الزهرة) من Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae) ، على أنه'تنشيط يانغ "عشب التنغيم في الطب الصيني التقليدي (تشين ، 1998) ، ويبدو أنه المكون الأكثر شيوعًا في عدد من براءات الاختراع الصينية ، المستخدمة في تنشيط يانغ". في الصين واليابان ، يستخدم Herba Cistanche على نطاق واسع لعلاج مجموعة من أعراض نقص اليانغ. أشارت الدراسات الدوائية أن Herba Cistanche يمكن أنكشط الجذور الحرة(شيونغ وآخرون ، 1996) ،إنتاج مهدئ(لو ، 1998) ،انتياغينغ(لي وآخرون ، 1990) ،التأثيرات المضادة للالتهابات ومضادات الالتهاب(لين وآخرون ، 2002) ، وتعزيز وظيفة المناعة(وو وآخرون ، 2005). العنصر النشط الرئيسي في Herba Cistanche هوجليكوسيدات فينيلثانويد(Ouyang et al. ، 2003) ، والتي تم العثور عليهامضاد للجراثيم ومضاد للإجهاد ومضاد للأكسدة(Xiong وآخرون ، 1998) ، وكذلك التأثيرات المضادة للاستماتة على الخلايا العصبية المستزرعة (Tian & Pu ، 2005). في الدراسة الحالية ، من أجل التحقيق في الأساس الدوائي للعمل المنشط لليانغ من Herba Cistanche ، تم فحص آثار علاج Herba Cistanche على قدرة توليد ATP في الميتوكوندريا المعزولة من قلوب الفئران خارج الجسم الحي وخلايا عضلة القلب H9c2 المستزرعة في الموقع. لاستكشاف الآلية البيوكيميائية الكامنة وراء عمل تعزيز جيل ATP ، تم أيضًا فحص تأثيرات علاج Herba Cistanche على نقل الإلكترون في الميتوكوندريا والأنشطة المعقدة من الأول إلى الرابع في قلوب الفئران.

يمكن للمكونات الفعالة لـ Cistanche أن تنظف العديد من الجذور الحرة النشطة للأكسجين

المواد والأساليب

الكيماويات وزراعة الخلايا والمواد العشبية

تم شراء ATP و ADP و 3- [4 ، 5- dimethylthiozol -2- yl] -2 ، 5- diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) من شركة Sigma Chemical Co (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على محلول Luciferase (ATPlite) من PerkinElmer (بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ومصل الأبقار الجنيني (FBS) من GIBCO BRL Life Technologies (جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء خط الخلايا H9c2 من ATTC (Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير Herba Cistanche من قبل تاجر أعشاب محلي (Lee Hoong Kee). تم توثيق العشب من قبل المورد ، وتم إيداع عينة قسيمة (HKUSTY00301) في قسم الكيمياء الحيوية ، جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST).

استخراج الأعشاب

تم تقطيع Herba Cistanche (1 0 0 جم) إلى قطع صغيرة ثم استخلاصها بالتسخين تحت التدفق في 300 مل ميثانول عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم تكرار الإجراء مرتين. تم تجفيف المستخلص المجمع عن طريق تبخير المذيب تحت ضغط مخفض ، وتم الحصول على مستخلص الميثانول من Herba Cistanche بمعدل 39 بالمائة (وزن / وزن). أشار التحليل الكيميائي إلى أن مستخلص الميثانول من Herba Cistanche يحتوي على إجمالي الصابونين ، والفلافونويد الكلي ، والقشور الكلية ، والسكريات بتركيزات 1.62٪ (وزن / وزن) ، 0.08٪ ، 0.15٪ ، 75.6٪ على التوالي.

االاعتناء بالحيوان

تم الحفاظ على ذكور فئران Sprague-Dawley البالغة (من 8 إلى 10 أسابيع ؛ 250-300 جم) في ظل 12- دورة مظلمة / فاتحة في غرفة يتم التحكم فيها بالهواء / الرطوبة عند حوالي 22 درجة مئوية ويسمح بالغذاء والماء حسب الرغبة في مرافق رعاية الحيوان في HKUST. تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة ممارسة البحث في HKUST.

العلاج من الإدمان

تم تقسيم الحيوانات بشكل عشوائي إلى مجموعات ، في كل مجموعة من خمسة إلى ستة حيوانات. في مجموعات المعالجة ، تم إعطاء الجرذان داخل المعدة مع مستخلص الميثانول من Herba Cistanche (مذاب / معلق في الماء) بجرعات يومية متزايدة ({0}. 031 - 0.5 جم / كجم) لمدة 3 أيام. حصلت الحيوانات الضابطة على الماء فقط. بعد أربع وعشرين ساعة من آخر جرعة ، تم الحصول على القلب من الحيوانات المخدرة بالفينوباربيتال وإخضاعها للتحليل الكيميائي الحيوي.

إعداد كسور الميتوكوندريا وقياس قدرة توليد ATP (ATP-GC) خارج الجسم الحي

تم استئصال عينات نسيج البطين الأيسر من القلب وشطفها باستخدام محلول متساوي التوتر مثلج مثلج (0. 32 M سكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 50 ملي مولار تريس / حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4). تم تحضير أجزاء الميتوكوندريا القلبية بالطرد المركزي التفاضلي في محلول متساوي التوتر عند 4 درجة مئوية. تم تحضير متجانسة القلب بنسبة 10 بالمائة (وزن / حجم) عن طريق تجانس النسيج البطيني المفروم باستخدام الخالط الزجاجي التفلون عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 20-30 ضربة كاملة. تم طرد المجانسة عند 600 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة النوى وحطام الخلية. تم بعد ذلك طرد المادة الطافية عند 8000 × جم لمدة 30 دقيقة لترسيب الميتوكوندريا (إيفان ، 1992). تم تعليق الكريات في 1 مل من المخزن المؤقت متساوي التوتر وإعادة تكوين كسور الميتوكوندريا. تم قياس ATP-GC في الميتوكوندريا للحيوانات غير المعالجة بواسطة طريقة Leung et al. (2005)

يمكن أن يؤخر عديد السكاريد Cistanche التنكس الفسيولوجي للأعضاء وتنكس مورفولوجيا الخلية

قياس نقل الإلكترون في الميتوكوندريا

قياس نقل الإلكترون في الميتوكوندريا المعزولة ، والذي يعتمد على تقليل MTT ، وفقًا [1] المتكون كما وصفه Cohen et al. (1997). تم تحضير الميتوكوندريا بتركيز بروتين 1 مجم / مل مع محلول حضانة مؤقت (25 0 ملي سكروز ، 5 0 ملي مولار HEPES ، 10 ملي KH2PO4 ، 2 ملي MgCl2 ، 1 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 7.4) . تم خلط قسامة (40 ميكرولتر) من الميتوكوندريا مع 100 ميكرولتر لكل من 15 ملي بيروفات أو 0.5 ملي سكسينات و 0.42 مجم / مل MTT. تم تحضين خليط التفاعل عند 37◦مئوية لمدة 10 دقائق مع رج لطيف. بعد الحضانة ، تم إنهاء خليط التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من محلول تحلل (10 في المائة ، وزن / حجم ، كبريتات دوديسيل الصوديوم ، و 45 في المائة ثنائي ميثيل فورماميد ، معدل إلى الرقم الهيدروجيني 4.7 مع حمض الأسيتيك الجليدي). بعد الوقوف لمدة 5 دقائق ، تم أخذ قراءات الامتصاص لخليط التفاعل باستخدام قارئ لوحة ميكروتيتر (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم الإبلاغ عنها كفرق بين 570 نانومتر و 630 نانومتر. تم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من القيمة المتوسطة للمجموعة الضابطة (أي Herba Cistanche - غير المعالجة).

زراعة الخلايا

تمت زراعة خلايا H9c2 ، وهي عبارة عن خط خلوي دائم مشتق من الخلايا العضلية القلبية (Hescheler et al. ، 1991) ، كطبقات أحادية في DMEM مع 10 بالمائة (v / v) FBS. احتوى الوسط على جلوكوز (4.5 جم / لتر) وجلوتامين (4.5 ملي مولار) ، مكمل بـ NaHCO3 (17 ملي مولار) ، بنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، وستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل). نمت جميع الخلايا في جو من 5 في المئة (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون في الهواء عند 37 درجة مئوية. تم استبدال الوسيط بوسط جديد كل يومين أو ثلاثة أيام. تمت زراعة مخزون من الخلايا في دورق مزرعة بحجم 75 سم 2 وتم تقسيمه قبل التقاء بنسبة زراعة فرعية تبلغ 1:10. بالنسبة لمقايسة ATP-GC ، تم زرع خلايا H9c2 بكثافة 2.5 × 104 خلية / بئر في لوحة بئر 24-. بعد ربط الخلية ، تم تطبيق مستخلص Herba Cistanche (المذاب في محلول ملحي مخزون بالفوسفات ؛ PBS) في الوسط ، وتم تحضين الخلايا لفترات متزايدة (2-16 ساعة) من الزمن. أعطيت خلايا التحكم (غير المعالجة) PBS فقط.

قياس ATP-GC في الموقع

بعد فترات الحضانة الموضحة بمستخلص HerbaCistanche بتركيزات متزايدة (5 {{1 0} - 3 0 0 ميكروغرام / مل) ، تم إجراء اختبار ATP-GC. تم استنشاق الوسط وعولجت الخلايا باستخدام الديجيتونين (50 ميكروغرام / مل) في مخزن مؤقت للحضانة (120 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 5 ملي KH2PO4 ، 2 مم EGTA ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.1 ملي MgCl2،0.5 بالمائة BSA ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 دقائق عند 37 ◦ ج. بعد شفط thedigitonin ، تمت إضافة الجلوتامات (5 مم) ، malate (5 مم) ، و ADP (60 ميكرومتر) إلى الخلايا لتوليد ATP في الميتوكوندريا ، والتي تمت مراقبتها على فترات زمنية متزايدة تتراوح من 0 إلى 15 دقيقة. تم إنهاء التفاعل بإضافة 60 ميكرولتر من حمض البيركلوريك (30 بالمائة ، وزن / حجم) ، وبعد ذلك تم طرد مخاليط التفاعل عند 600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم خلط قسامة (120 ميكرولتر) من المادة الطافية بـ 90 ميكرولتر من 1.4 ميكرولتر KHCO3 للتحييد. تم طرد المخاليط مرة أخرى عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتم قياس المواد الطافية لمحتوى ATP كما تم وصفه سابقًا. تم تقدير ATP-GC للخلايا غير المعالجة عن طريق حساب المنطقة الواقعة تحت منحنى الرسم البياني (AUC1) لرسم ATP المتولد (بروتين nmol / mg) مقابل الوقت (0-15 دقيقة) وتم التعبير عنه بوحدات عشوائية. بالنسبة للخلايا المعالجة بـ HerbaCistanche ، تم تطبيع قيم AUC1 لزيادة أوقات الحضانة (3 ، 5 ، 7 ، 10 ، 15 دقيقة) إلى قيمة تحكم متوسطة ذات صلة من العينات غير المعالجة وتم التعبير عنها كنسبة مئوية تحكم. بعد ذلك ، تم حساب المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC2) للرسم البياني الذي يرسم قيم التحكم في النسبة المئوية مقابل وقت الحضانة (3-15 دقيقة) والتعبير عنها بوحدات عشوائية. تم التعبير عن بيانات المجموعات المعالجة بـ Herba Cistanche كنسبة مئوية من عنصر التحكم من المعادلة:

[AUC2 (HerbaCistanche - معالج) / AUC2 (غير معالج)] × 100 بالمائة

قياسات المركب الأول والرابع وأنشطة السترات التركيبية

تم قياس أنشطة سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا (ETC) من خلال طرق القياس الطيفي باستخدام ركائز محددة معقدة (NADH للمركب I ، والسكسينات للمركب II ، وديسيلوبيكوينول للمركب III) كما هو موصوف (Grad & Lemire، 2004؛ Hsu et al. ، 2005 ؛ مارك وآخرون ، 2001). تم قياس نشاط IV المركب باستخدام مجموعة مقايسة السيتوكروم c أوكسيديز من Sigma. تم قياس نشاط سينثاز سترات الميتوكوندريا بطريقة Srere (1969).

فحص البروتين

تم تحديد تركيزات البروتين لكسور الميتوكوندريا والخلية باستخدام اختبار بروتين BioRad باستخدام ألبومين مصل البقر كمعيار ({0}. 038 - 0.600 مجم / مل).

تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع البيانات على أنها تعني ± خطأ معياري لهم (SEM). تم تحليلها من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). تم إجراء مقارنات متعددة لاحقة مع LSD. قيم P.<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

نتائج

آثار علاج Herba Cistanche على عضلة القلب ATP-GC في الفئران

كما هو مبين في الشكل 1 ، العلاج بمستخلص Herba Cistanche بجرعات تصل إلى 0. أدى 5 جم / كجم إلى زيادة ATP-GC في عضلة القلب بطريقة تعتمد على الجرعة في الجرذان ، حيث بلغت درجة التحفيز 89 بالمائة بجرعة من 0. 5 جم / كجم.

آثار علاج Herba Cistanche على نقل الإلكترون في الميتوكوندريا في قلوب الفئران

تم قياس مدى نقل الإلكترون في الميتوكوندريا المعزولة عن طريق مراقبة تقليل MTT. كانت الركيزة المستخدمة للمقايسة إما بيروفات أو سكسينات.

الشكل 1 تأثير علاج Herba Cistanche على قدرة توليد ATP في الميتوكوندريا في قلوب الفئران خارج الجسم الحي

كل شريط يمثل ± SEM ، مع n {0}. تم علاج الحيوانات عن طريق الفم باستخدام HerbaCistanche بالجرعات اليومية المحددة لمدة 3 أيام. تم قياس قدرة التوليد ATP كما هو موضح في "المواد والطرق". تم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من التحكم فيما يتعلق بالقيم (AUC2) لمجموعة التحكم غير المعالجة ذات الصلة. تختلف اختلافًا كبيرًا عن مجموعة التحكم غير المعالجة ؛ تختلف معنوياً عن المجموعة المعالجة بـ Herba Cistanche عند 0.5 جم / كجم.

الشكل 2. آثار علاج Herba Cistanche على نقل الإلكترون في الميتوكوندريا في قلوب الفئران

يمثل كل شريط متوسط ​​± SEM ، مع n {0}. (أ) تم قياس النقل الإلكتروني للميتوكوندريا المدعوم من البيروفات (ب) بواسطة السكسينات باختزال MTT ، كما هو موضح في "المواد والطرق". تم التعبير عن البيانات في النسبة المئوية لقيم التحكم غير المعالجة [المدعومة من البيروفات: OD57 0 nm− OD63 0 nm =0. 0 206 ± 0.0001 (SEM) ، n {{ 10}} ؛ دعم سكسينات: ذكر ، 0.255 ± 0.015 ، ن=5]. تختلف اختلافًا كبيرًا عن مجموعة التحكم غير المعالجة ؛ تختلف اختلافًا كبيرًا عن مجموعة 0.5 جم / كجم.

كما هو مبين في الشكل 2 أ ، زاد علاج Herba Cistanche اعتمادًا على الجرعة من مدى النقل الكهربائي للميتوكوندريا المدعوم بالبيروفات في قلوب الفئران ، مع التحفيز الأمثل الذي يمكن ملاحظته بجرعات 0. 5 جم / كجم. على أي حال ، لم يتم الكشف عن أي تغييرات مهمة في مدى نقل الميتوكوندريا الإلكتروني المدعوم بالسكسينات في قلوب الفئران التي عولجت هربا كيستانش (الشكل 2 ب).

للجزء 2 ،الرجاء الضغط هنا.