الجزء 1: رسم خريطة للتفاعل اللاجينومي والترانسكريبتومي أثناء تكوين الذاكرة والاستدعاء في مجموعة إنغرام الحصينية

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

الرجاء النقر هنا للجزء 2

Asaf Marco1،2، *، Hiruy S. Meharena1،2، Vishnu Dileep1،2، Ravikiran M. Raju1،4، Jose Davila- Velderrain3، Amy Zhang2، Chinnakkaruppan Adaikkan1،2، Jennie Z. Young1،2، Fan Gao1، Manolis Kellis3،5 ، Li-Huei Tsai1،2،5 ، *

1Picower Institute for Learning andذاكرة، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.

2 قسم الدماغ والعلوم المعرفية ، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.

3 مختبر علوم الكمبيوتر والذكاء الاصطناعي ، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.

4 قسم طب الأطفال حديثي الولادة ، مستشفى بوسطن للأطفال ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.

5Broad Institute of Harvard and MIT ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.

انقر لمتجر فيتامين Cistanche وسيستانش للذاكرة

الملخص

تبرز العمارة الجينية ثلاثية الأبعاد والإيبيجينوم كعوامل رئيسية في التنظيم الديناميكي لبرامج النسخ المختلفة المطلوبة للوظائف العصبية. هنا نستخدم نظام وضع العلامات المعتمد على النشاط في الفئران لتحديد الحالة اللاجينية ، وبنية الجينوم ثلاثي الأبعاد ، والمشهد النسخي لخلايا engram على مدى عمرذاكرةالتشكيل والاستدعاء. النتائج التي توصلنا إليها تكشف عن ذلكذاكرةيؤدي التشفير إلى حدث تمهيد جيني ، يتميز بإمكانية وصول متزايدة للمُحسِّنات دون تغييرات نسخية مقابلة.ذاكرةيؤدي التوحيد لاحقًا إلى إعادة التنظيم المكاني لشرائح الكروماتين الكبيرة وتفاعلات المروج-المحسن. أخيرًا ، مع إعادة التنشيط ، تستخدم عصبونات engram مجموعة فرعية من تفاعلات denovolong-range ، حيث تم توصيل المُحسِّنات المحضرة مع المروجين الخاصين بها من أجل تنظيم الجينات المشاركة في ترجمة البروتين المحلية في الأجزاء المتشابكة. بشكل جماعي ، يوضح عملنا النسخة النصية الشاملة ويمكن للمستخدمين عرض النصوص والبيانات وطباعتها ونسخها وتنزيلها واستخراج المحتوى في مثل هذه المستندات ، من أجل البحث الأكاديمي ، مع مراعاة شروط الاستخدام الكاملة دائمًا: http: //www.nature. com / author / editorial _ سياسات / ترخيص.html # terms

* المراسلة مع: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

الكاتب الاشتراكات:

قامت AM و L.-HT بوضع تصور للمشروع وتصميمه. أجرى كل من AM و AZ تجارب سلوكية و ISH و immunostaining و MARIS. أجرى CA حقن الفيروس والمناعة. أجرى كل من AM و HSM تجارب ATAC-seq. أجرى AM و AZ تجارب RNA-seq النووية. أجرت AM و HSM و VD تجارب PC-Hi-C و Hi-C. قامت AM و HSM و VD و RMR و JDV بإجراء تحليل ATAC-seq. أجرت AM و RMR و HSM و VD و FG تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي النووي. أجرت AM و VD و HSM و RMR تحليل PC-Hi-C و Hi-C. ساعد جميع المؤلفين في تفسير البيانات. كتب AM و HSM و VD و RMR و JZY و MK و LHT المخطوطة مع مدخلات من جميع المؤلفين. قدمت LHT الأدوات وأشرفت على المشروع.

تضارب المصالح:

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

المشهد فوق الجينوم عبر عمرذاكرةالتشكيل والاستدعاء في فرقة engram الحصين.

يعتمد تكوين وحفظ الذكريات طويلة المدى على التعبير الجيني المنسق وتوليف البروتينات المشبكية 1. تعمل هذه العمليات الجزيئية ضمن مجموعة محددة من الخلايا العصبية ، يشار إليها باسم خلايا engram2-4. قدمت الأساليب الحديثة باستخدام التعبير المعتمد على النشاط للمراسلين إطارًا لاستكشاف مجموعة engram5-8 ، لكن الآليات الجزيئية التي تحكمذاكرةالتخزين والاسترجاع لا يزالان غير مفهومين. على وجه التحديد ، تظهر التعديلات اللاجينية والعمارة الجينية ثلاثية الأبعاد كعامل رئيسي في التنظيم الديناميكي للتعبير الجيني 9-17 ، وهناك تقدير متزايد لأهميتها في الوظيفة العصبية والتطور والمرض 14، 16، 18

هنا ، استخدمنا نموذج فأر إعادة التركيب المستهدف في السكان النشطين (TRAP) ، حيث يتم تمييز الخلايا العصبية النشطة التي تعبر عن البروتين المرتبط بالهيكل الخلوي المنظم ، (Arc) ، بشكل دائم بطريقة محفزة. تنشيط الخلايا العصبية أثناءذاكرةتم فرز الترميز والتوحيد والاستدعاء وإخضاعها لتسلسل الحمض النووي الريبي النووي (nRNA-seq) ، ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة Transposase باستخدام التسلسل (ATAC-seq) ، والتقاط التشكل الكروموسومي (Hi-C). بياناتنا تثبت ذلكذاكرةيؤدي الترميز إلى زيادة على مستوى الجينوم في إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، دون تغييرات متوقعة في التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، نوضح أن المرحلة المتأخرة من دمج الذاكرة كانت مرتبطة بإعادة توطين مقاطع الكروماتين الكبيرة (المقصورات الفرعية) من البيئات غير النشطة إلى البيئات المتساهلة ، وإعادة تنظيم مشهد تفاعل المُحسِّن والمُحسِّن. أخيرًا ، إعادة تنشيط الخلايا العصبية أثناءذاكرةيترافق الاسترجاع مع تفاعلات denovopromoter-المحسن ، باستخدام مجموعة فرعية كبيرة من المعززات التي تم تحضيرها أثناءذاكرةالتشفير. ترتبط تفاعلات المُحسِّن والمُحسِّن هذه بتغيير قوي في التعبير عن الجينات المشاركة في تخليق البروتين المحلي والتشكل التشابكي.

نتائج

التحديد الزماني والمكاني لخلايا إنغرام المنشطة والمعاد تنشيطها

كان تتبع نشاط الخلايا العصبية بمرور الوقت أحد التحديات الرئيسية عند دراسة خلايا engram ، حيث تعود علامات النشاط العصبي ، والمعروفة باسم الجينات المبكرة الفورية (IEGs) ، إلى خط الأساس بعد فترة وجيزة من الاستقراء. للتغلب على هذا القيد ، استفدنا من نموذج TRAP5،6 ، الذي يتطلب جينات معدلة ، أحدهما يعبر عن CreERT2 من مروج Arc يعتمد على النشاط والآخر يسمح بالتعبير عن مراسل البروتين الفلوري الأصفر (eYFP) ، في Cre- بطريقة تعتمد. ينتج عن إدارة عقار تاموكسيفين (TAM) لفئران TRAP تسمية eYFP دائمة في الخلايا العصبية القوسية النشطة. بدون TAM ، يتم الاحتفاظ بـ CreERT2 في السيتوبلازم ولا يتم التعبير عن eYFP (البيانات الموسعة الشكل 1 أ). خضعت الفئران TRAP إلى نموذج بافلوفيان الكلاسيكي لتكييف الخوف السياقي (CFC) (الشكل 1 أ) ، وهي طريقة شائعة الاستخدام لدراسة الذكريات المكروهة. بعد ما يقرب من 1.5 إلى 2 ساعة من التعرض للـ FS ، تم جمع الأدمغة لتحديد i) ثعلب بروتين رابط لـ RNA -1 homolog 3 (Rbfox3) يُعرف أيضًا باسم NeuN plus و eYFP بالإضافة إلى الخلايا العصبية المميزة التي تم تنشيطها أثناء التعرض الأولي (المنشط في وقت مبكر) ، والتي يمكن تمييزها عن 2) NeuN plus / eYFP- عصبونات الحالة القاعدية غير النشطة (القاعدية) (الشكل 1 أ). بعد خمسة أيام ، في حالة عدم وجود استرجاع ، قمنا بجمع 3) NeuN plus / eYFP plus الخلايا العصبية التي تم تمييزها في يوم التدريب ، مما يدل على المدى الطويلذاكرةالتوحيد (المنشط المتأخر). في

مجموعة مختلفة ، تم إعادة تعريض الفئران للمحفز المشروط وتم فحص تعبير بروتين ARC الداخلي اللاحق بعد 1.5 - 2 ساعة من إعادة التعرض. مكّن ذلك من تحديد iv) الموجبة المزدوجة NeuN plus / eYFP plus / الذاتية Arc بالإضافة إلى الخلايا العصبية engram التي تم تنشيطها أثناء التدريب وإعادة تنشيطها أثناءذاكرةاستدعاء (معاد تنشيط). وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن إعادة تركيب الحمض النووي قد لا يحدث بالكامل بعد 1.5-2 ساعة من FS ، فقد لاحظنا توطينًا مشتركًا عاليًا (متوسط ​​84 بالمائة) بين بروتين Arc الداخلي ومراسل Arc: eYFP (البيانات الموسعة الشكل 1 ب) ، والذي كان أيضًا بما يتفق مع التقارير السابقة 20.

للتأكيدذاكرةالترميز والاستدعاء أثناء CFC ، تم تسجيل سلوك التجميد أثناء التدريب وإعادة التعرض للإشارات المسببة للخوف (البيانات الموسعة الشكل 1 ج). تمشيا مع المنشورات السابقة 6،20 ، أظهرت بياناتنا زيادة كبيرة في عدد الخلايا العصبية eYFP plus (النشطة المبكرة والمتأخرة) في قرن آمون ، مقارنة بالفئران التي ظلت ساذجة لـ CFC في قفصها المنزلي (F (2 ، 70)=240. 3 ، ص<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

يرتبط تكوين الذاكرة بزيادة إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، في الغالب على المعززات

لفهم القوى الجزيئية التي تحكم برامج النسخ المختلفة بشكل أفضل ، قمنا بقياس التغييرات على مستوى الجينوم لإمكانية الوصول إلى الكروماتين عبر مراحل مختلفة منذاكرة. تم تجميع أنسجة الحصين وتعرضت نوى معزولة (البيانات الموسعة الشكل 2 أ ، الجدول التكميلي 1) لإعداد مكتبة ATAC-seq. كشف تحليل المناطق التي يمكن الوصول إليها تفاضليًا (Diffbind ، وضع DESeq2) بين جميع المجموعات السكانية (الشكل 2 أ) أن معظم التغييرات في حالة الكروماتين تحدث أثناء المرحلة المبكرة من تكوين الذاكرة ، حيث توجد 7 مناطق 862 عبر اكتساب الجينوم إمكانية الوصول (Basal مقابل المبكر ، الجدول التكميلي 2). في المقابل ، لاحظنا تغييرات طفيفة نسبيًا في حالة الكروماتين عند الانتقال من المنشط المبكر إلى المتأخر المنشط (582 DAR) وبين الخلايا العصبية المتأخرة النشطة والمعاد تنشيطها (725 DARs) ، مع تداخل بنسبة 48 بالمائة بينهما (البيانات الموسعة الشكل 2 ب) ). بشكل ملحوظ ، حددنا نسبة كبيرة (52 في المائة) من DAR المكتسبة بشكل ثابت والتي أصبحت أكثر سهولة في المنشط المبكر وبقيت متاحة في كل من الخلايا العصبية النشطة المتأخرة والمعاد تنشيطها (الشكل 2 ب ، ج ؛ الجدول التكميلي 2). ومن المثير للاهتمام ، أنه في حين تم إثراء كل من التغييرات المبكرة (القاعدية مقابل المبكرة) والمكتسبة بشكل ثابت DARs للمناطق بين الجينات ، تم إثراء تغييرات الكروماتين المتأخرة (في وقت مبكر مقابل المتأخر والمتأخر مقابل إعادة التنشيط) لمواقع المروج ، (الشكل 2 د).

تم توفير البصيرة الوظيفية من خلال تقييم كيفية تمييز DARs من خلال تعديلات هيستون المختلفة. استخدمنا أولاً ChromHMM لإنشاء نموذج حالة الكروماتين من دراستين مستقلتين استخدمت أنسجة الحصين السائبة قبل وبعد صدمة القدم 21،22. بعد ذلك ، أجرينا تحليل إثراء أضعاف (لوحظ على التوزيع المتوقع) لـ DARs لهذه الحالات المختلفة وكشفنا أن تغييرات الكروماتين المبكرة و DARs المستقرة تم إثرائها لعلامات المعززات (الشكل 2 هـ ؛ البيانات الموسعة الشكل 2 ج ، الجدول التكميلي 3) .

تتوافق هذه النتائج مع المنشورات السابقة ، والتي تُظهر أن تحفيز الثقافة العصبية الأولية يؤدي إلى نشاط معزز طويل الأمد. بعد ذلك ، قمنا بتحليل تداخل المواقع المستقرة الفردية مع H3K4me1 و H3K27ac21. تحدد هاتان العلامتان الهيستون مجموعات مختلفة من المعززات ، والتي يمكن إما أن تكون "معدة" (فقط H3K4me1) ، أو "نشطة" (H3K4me1 و H3K27ac) ، أو "كامنة" (بدون علامات) 18. أظهرت القمم المستقرة توزيعًا عبر كل من المعززات الأولية والنشطة (البيانات الموسعة الشكل 2 د) ، حيث تم توقع أن تكون 47 بالمائة من هذه المواقع "كامنة" (لا يوجد تداخل بين DARs وعلامات هيستون التي تم الحصول عليها بعد ساعة واحدة من FS). لتأكيد نموذجنا ، أجرينا الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) لعلامات هيستون H3K4me1 و H3K27ac ، متبوعًا بـ qPCR. تم اختيار أربعة مواقع محددة من تحليل نمذجة المُحسِّن المفترض لدينا (البيانات الموسعة الشكل 2 د ؛ المحسن 1 - تم التنبؤ به ، المحسن المتوقع 2- نشط ، المحسن 3 و 4 - كامن متوقع). بالاتفاق مع نموذجنا ، حددنا موقعين "كامنين" في الحالة القاعدية (المعززان 3 و 4) والتي تحولت إلى حالة "نشطة" أثناءذاكرةتشكيل (الشكل 2f). علاوة على ذلك ، تم العثور على المُحسِّن المفترض 1 ليكون "مُجهزًا" في الحالة القاعدية وأصبح نشطًا ، حيث كانت هناك زيادة ثابتة ملحوظة في علامات H3K27ac خلال المرحلة المتأخرة والاسترجاع (الشكل 2f). تشير هذه البيانات معًا إلى أنه تم توسيع مجموعة المحسنات التي يمكن الوصول إليها حديثًا في الخلايا العصبية المحركة لـ engram ، حيث اكتسبت المناطق الكامنة أو الأولية علامات H3K4me1 و H3K27ac وبالتالي أصبحت معززات نشطة.

لفهم الدور الوظيفي لمناطق المروجين والمعززات التي يمكن الوصول إليها ، أجرينا تحليل إثراء الحافز (الجدول التكميلي 4). تشير بياناتنا إلى أن الغالبية العظمى (70 بالمائة) من الزخارف على المروجين الذي يمكن الوصول إليه غنية بالتساوي وتم تحديدها في جميع مراحلذاكرة(البيانات الموسعة الشكل. 2 هـ). في المقابل ، أظهرت غالبية مواقع المعززات أنماطًا مميزة من الزخارف المرتبطة بعامل النسخ (TF) عبر مراحل الذاكرة المختلفة. ومن المثير للاهتمام ، أن الأشكال المعبر عنها في كل مكان من Jun Proto-Oncogene ، و Ap -1 Transcription Factor Subunit (أي Jun-Ap1) ، والعامل التنظيمي X (Rfx) لعائلة TFs ، تم إثرائها بشكل كبير فقط بعد المرحلة الأولية من الترميز (البيانات الموسعة الشكل 2 هـ). تم الإبلاغ سابقًا أن مجمع Jun-Ap1 يلعب دورًا رئيسيًا في اختيار المُحسِّن وقد يكون بمثابة رائد TF لتحديد مواقع المعززات أثناء نمو الدماغ والنشاط العصبي. تتوافق هذه النتائج مع بياناتنا التي أظهرت نسبة عالية من المواقع الكامنة / الأولية في الحالة القاعدية (الشكل 2f ، البيانات الموسعة الشكل 2 ج ، د). ومن ثم ، يبدو أن نشاط الخلايا العصبية قد يؤدي إلى ارتباط Jun-Ap1 بالمُحسِّنات الكامنة ، والتي تقوم بعد ذلك بتجنيد مُعدِّلات الكروماتين التي تنشط المُحسِّنات الكامنة. وبالمثل ، فإن إثراء زخارف عامل النسخ Yin Yang 1 (Yy1) فقط في المعززات من الحالات المبكرة والمتأخرة ، يشير إلى أن منظمة المحفز المعزز هي عملية نشطةذاكرة، حيث تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن Yy1 يسهل تكوين هذه التفاعلات طويلة المدى. بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات إلى أن المرحلة الأولية منذاكرةيغير التكوين مشهد إمكانية الوصول إلى الكروماتين في الخلايا العصبية النشطة ، مع حدوث تغييرات مستقرة طويلة الأمد في الغالب داخل مناطق المحسن.

التغييرات الديناميكية في العمارة النووية المكانية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين أثناء البدايةذاكرةيتوافق التكوين مع زيادة تواتر تفاعلات المروج-المحسن أثناءذاكرةاعد الاتصال

تبرز العمارة النووية ثلاثية الأبعاد كعامل رئيسي في التنظيم الديناميكي للتعبير الجيني ، في العديد من الوظائف العصبية. ومن ثم ، فقد كنا مهتمين بتحديد التغييرات الدقيقة التي تحدث في تنظيم الكروماتين المكاني أثناءذاكرةالتشكيل والتوحيد. لقد أنتجنا بيانات Hi-C من الحالة القاعدية و eYFP بالإضافة إلى الخلايا العصبية الموسومة (في وقت مبكر ومتأخر ، الجدول التكميلي 5). يتم فصل الكروماتين إلى جزأين نوويين منفصلين مكانيًا ، "أ" و "ب" ، يتوافقان مع الكروماتين النشط نسبيًا وغير النشط ، على التوالي. تشير الأدلة المبكرة إلى أن نشاط الخلايا العصبية والإشارات الخارجية قد يؤديان إلى إعادة تنظيم بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد. كشف تحليل حالة المقصورة الخاص بنا 15 ، 16 ، 26 (الشكل 3 أ-ج) عن إعادة توطين مقاطع الكروماتين الكبيرة من غير نشط (ب) إلى البيئة المتساهلة (أ) (والعكس بالعكس) خلال المرحلة الأولية والمتأخرة منذاكرةتشكيل (تم تبديل 212 مقطعًا من A إلى B ، و 127 من B إلى A ، بمتوسط ​​حجم ~ 436Kbp). ومن المثير للاهتمام ، أن 52 في المائة من المناطق في المرحلة المبكرة التي تحولت من B إلى A حافظت على هذه الحالة في المرحلة المتأخرة (أي بقيت في الحالة A ، الشكل 3 ب ، ج ؛ الجدول التكميلي 6). علاوة على ذلك ، تداخلت جميع هذه المناطق تقريبًا مع DAR المكتسبة من تحليل ATAC-seq الخاص بنا ، مما يؤكد انتقال المقصورة الفرعية من البيئة غير النشطة إلى البيئة المتساهلة (الشكل ثلاثي الأبعاد). تشير هذه البيانات إلى أن بعض المواقع تخضع للتبديل الجزئي عبر مراحل الذاكرة المختلفة ، وبالتالي قد تساهم في تغييرات طويلة الأجل في خصائص الخلايا العصبية ووظيفتها بعد التنشيط الأولي.

بينما اقترحت بيانات Hi-C الخاصة بنا إعادة تنظيم على نطاق واسع ، فقد ظل من غير الواضح ما إذا كانت إعادة التوجيه هذه قد أتاحت التفاعل بين ذخيرة محسِّن ومُحسِّن جديد وضبط برامج النسخ المختلفة (الشكل 3 هـ). من خلال استخدام تقنية Hi-C (pc-HiC) لالتقاط المروج ، قمنا بدراسة التغييرات الدقيقة التي تحدث في تفاعلات معززات المروج أثناء عمليةذاكرةالتشكيل والاستدعاء. في هذه الدراسة ، استخدمنا "طُعمًا" مصممة خصيصًا لاستهداف حوالي 5 000 مروجين 29. بالاتفاق مع المنشورات السابقة ، اكتشفنا حوالي 19000 (لكل مجموعة) معززات مهمة (67.5 بالمائة) ومروجين - مروجين (46.2 بالمائة) تفاعلات (بيانات موسعة الشكل 3 أ ، ب).

نظرًا لأن المروجين في دماغ الثدييات يمكن أن يكون تحت سيطرة عناصر تنظيمية متعددة ، قمنا بتحليل التداخل بين جميع المعززات المتفاعلة والمروجين الخاصين بهم. لقد وجدنا ذلك خلال كلذاكرةفي المرحلة ، يتفاعل نفس المروجين بشكل متكرر أكثر مع مجموعة فرعية مميزة من المعززات (أي فريد ، Basal - 3243 ، مبكر - 7602 ، متأخر - 7028 ، معاد تنشيطه - 7244 ؛ الشكل 4 أ ، ب ؛ البيانات الموسعة الشكل. 3 ج ؛ الجدول التكميلي 7). تتوافق هذه النتيجة مع المنشورات السابقة التي توضح أن المحسنات المتعددة المحيطة بالعديد من الجينات (c-Fos و Arc) ضرورية لتنشيطها ويتم تغيير تردد تفاعلها مع المروجين الخاصين بها استجابةً لعوامل إزالة الاستقطاب المختلفة في الخلايا العصبية المستزرعة. حددنا أيضًا مجموعة فرعية أصغر من التفاعلات التي كان المروجين يتفاعلون فيها مع نفس المعززات عبر مختلفذاكرةالمراحل (أي الشائعة ، ~ 31 في المائة من جميع التفاعلات ؛ الجدول التكميلي 7). علاوة على ذلك ، قدمت الخلايا العصبية المعاد تنشيطها درجات تفاعل أقوى بشكل ملحوظ (كما حسبت في شيكاغو ، الشكل 4 ب ؛ البيانات الموسعة الشكل ثلاثي الأبعاد). ومن ثم ، على الرغم من أن عدد التفاعلات الفريدة كان متشابهًا عبر الحالات المبكرة والمتأخرة والتي أعيد تنشيطها ، تشير درجات التفاعل الأقوى إلى أن تفاعلات المُحسِّن والمُحسِّن المحددة تحدث بشكل متكرر أكثر أثناء الذاكرة

اعد الاتصال. تم التحقق من صحة هذه الفكرة بشكل أكبر من خلال تجارب 3C ، مع بادئات مصممة لقياس تواتر التفاعل بين المُحسِّن المختار (E) والمروجين الجيني (P) الذي يشفر لعامل بدء الترجمة حقيقية النواة 3 الوحدة الفرعية D (Eif3d) أو مستقبلات الجلوتامات ، مؤثر في التباين ، كاينات 3 (Grik3) (الشكل 4 ج). أظهرت بياناتنا أن الخلايا العصبية المعاد تنشيطها لديها زيادة كبيرة في وتيرة التفاعل بين محفز Eif3d والمحسن المحدد ، مقارنةً بالمجموعات السكانية الأخرى (الشكل 4 ج). بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات إلى أن تفاعلات المُحسِّن والمُحسِّن تحدث بشكل متكرر أثناءذاكرةاعد الاتصال.

بعد ذلك ، سألنا ما إذا كانت التفاعلات الديناميكية طويلة المدى التي تم تحديدها عبر الكمبيوتر الشخصي HiC تتوافق مع مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها بشكل أكبر ، كما هو محدد عبر ATAC-seq. هذا من شأنه أن يؤكد أن زيادة إمكانية الوصول لها نتيجة وظيفية في إحداث تفاعلات جديدة للمُحفِّز-المُحسِّن. لتحقيق ذلك ، قمنا بمقارنة التداخل بين المعززات المتفاعلة في كل مجموعة خلايا بـ DARs (المرصودة) أو مجموعة عشوائية من المواقع الجينومية التي يمكن الوصول إليها (المتوقعة). كشف تحليلنا عن تداخل كبير بين كل من DAR المكتسبة في الخلايا العصبية المبكرة النشطة و DAR المكتسبة بثبات مع المعززات المتفاعلة ، في جميع مجموعات الخلايا (All Ps <0. 0001="" ،="" البيانات="" الموسعة="" الشكل="" 3="" هـ).="" في="" المقابل="" ،="" حدثت="" التغييرات="" في="" إمكانية="" الوصول="" إلى="" الكروماتين="" خلال="" المرحلة="" المتأخرة="">ذاكرةلم يتداخل التوحيد وإعادة التنشيط بشكل كبير مع المعززات المتفاعلة (البيانات الموسعة الشكل. 3 هـ). تشير هذه النتائج معًا إلى أن اكتساب إمكانية الوصول أثناء تشفير الذاكرة يعد حدثًا أوليًا وأن هذه المواقع الأولية تشارك في تفاعلات محسّن وظيفي de-novo خلال مراحل لاحقة منذاكرةتشكيل - تكوين. يتضح هذا المشهد الديناميكي من خلال تصور المناطق الجينومية حول عامل بدء الترجمة حقيقية النواة 5 وحدة فرعية A (Eif5a) جين (الشكل 4 د). يسلط هذا التشريح الجزيئي الزمني لعمر engram الضوء على مدى تنسيق الإعداد الأولي للحالة اللاجينية للخلية أثناءذاكرةيسهل الترميز والدمج التفاعلات طويلة المدى أثناء إعادة التنشيط.