الجزء 1 الآثار الوقائية لجليكوسيدات فينيليثانول من سيستانش توبولوسا على التليف الكبدي الناجم عن الألبومين في الفئران

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

الملخص

خلفية:Cistanche tubulosa هو دواء عشبي صيني تقليدي يستخدم على نطاق واسع لتنظيم المناعة.فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche(CPhGs) من هذا المصنع هي المواد الفعالة في المقام الأول. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم الآثار الوقائية والعلاجية لمركبات CPhG على التليف الكبدي الناجم عن BSA في الفئران والآليات الجزيئية ذات الصلة التي تشمل الخلايا النجمية الكبدية. تم استخدام Biejiarangan (BJRG) ، وهو دواء عشبي صيني تقليدي آخر ، كعنصر تحكم إيجابي. الطريقة: في التجارب المجراة ، تم تقسيم 75 فأرًا SD بشكل عشوائي إلى 6 مجموعات: عادية (معالجة بالماء المقطر) ، نموذج (معالج BSA) ، عقار إيجابي (BSA- معالج بالإضافة إلى BJRG 6 0 {{29} } مجم / كجم / يوم) ومجموعات BSA المعالجة بالإضافة إلى CPhGs (125 و 25 0 و 5 0 0 مجم / كجم / يوم). مؤشرات الكبد والطحال ، مستويات مصل الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST) ، ألانين أمينوترانسفيراز (ALT) ، حمض هيكساديسينويك (HA) ، اللامينين (LN) ، النوع الثالث من البروكولاجين (PCIII) ، النوع الرابع من الكولاجين (IV-C) ، هيدروكسي برولين ( تم قياس Hyp) ، وتحويل عامل النمو 1 (TGF - 1) في كبد الفئران. تم تقييم درجات الأنسجة المرضية لتليف الكبد لكل مجموعة باستخدام تلطيخ H&E و Masson ثلاثي الألوان. تم تحديد تعبير TGF - 1 ، والكولاجين 1 (Col-I) ، والكولاجين III (Col-III) بطريقة تلطيخ كيميائي مناعي. تم تقييم هذه التأثيرات بشكل أكبر في المختبر من خلال تحديد مستويات التعبير عن NF-B p65 و Col-I من خلال التحليلات الكمية في الوقت الحقيقي PCR. تم فحص تعبير البروتين Col-I أيضًا بواسطة النشاف الغربي. النتائج: جميع مجموعات الجرعات (125 ، 25 0 ، و 500 مجم / كجم / يوم) من CPhGs قللت بشكل كبير من مؤشر الكبد والطحال ، وانخفاض مستويات ALT ، AST ، HA ، LN ، PCIII ، IV-C في الدم ، محتوى TGF - 1 (P <0.01 ،="" p=""><0.01 ،="" و="" p=""><0.01) ،="" ومحتوى="" hyp.="" كما="" خففت="" cphgs="" بشكل="" ملحوظ="" من="" تورم="" خلايا="" الكبد="" ومنع="" بشكل="" فعال="" نخر="" خلايا="" الكبد="" وتسلل="" الخلايا="" الالتهابية.="" أظهرت="" النتائج="" الكيميائية="" النسيجية="" المناعية="" أن="" cphgs="" قللت="" بشكل="" كبير="" من="" تعبير="" tgf="" -="" 1="" (p=""><0.01 ،="" p=""><0.01 ،="" و="" p=""><0.01) ،="" col-="" i="" ،="" و="" col-iii.="" أظهرت="" التأثيرات="" المختبرية="" لـ="" cphgs="" (100="" و="" 75="" و="" 50="" و="" 25="" ميكروغرام="" مل)="" على="" hsc-t6="" أن="" cphgs="" قللت="" بشكل="" كبير="" من="" تعبير="" الرنا="" المرسال="" عن="" nf-b="" p65="" و="" col-i="" ،="" كما="" قللت="" cphgs="" من="" التعبير="" البروتيني="" col-i.="" الاستنتاجات:="" إن="" cphgs="" لها="" تأثير="" كبير="" مضاد="" للتليف="" الكبدي="" ،="" ويمكن="" استخدامها="" كعوامل="" واقية="" من="" الكبد="" لعلاج="" التليف="">

الكلمات المفتاحية: التليف الكبدي ، Cistanche tubulosa ، فينيليثانول غليكوزيد ، Chemokine BSA ، الوقاية والعلاج.

خلفية

التليف الكبدي هو استجابة التئام الجروح لإصابة الكبد الشديدة التي تحدث في التسبب في التهاب الكبد المزمن الناجم عن عوامل مختلفة. هذه العوامل هي العدوى الفيروسية ، وإدمان الكحول ، والركود الصفراوي ، وأمراض التمثيل الغذائي وأمراض المناعة الذاتية [1-3]. يؤدي التراكم التدريجي للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وانخفاض إعادة التشكيل إلى تعطيل البنية الطبيعية للكبد ، مما يؤدي إلى التليف الكبدي [4]. يعد التليف الكبدي أمرًا بالغ الأهمية في أمراض الكبد المزمنة وغالبًا ما يتطور إلى تليف الكبد غير القابل للشفاء والسرطان. في الوقت الحاضر ، لا توجد طرق أو أدوية فعالة لعلاج التليف الكبدي. لذلك ، من الضروري إيجاد دواء مضاد للتليف الكبدي من شأنه أن يخفف من تطور إصابة الكبد إلى التليف والسرطان.Cistanche tubulosaW (من عائلة Orobanchaceae) هو نبات طفيلي يزرع على نطاق واسع في المنطقة الجنوبية من شينجيانغ في الصين [5]. عادة ما يستخدمه الناس لتنشيط الكلى وتغذية الدم وإرخاء الأمعاء وتأخير الشيخوخة. تم إدراجه رسميًا في دستور الأدوية الصيني [6]. يحتوي C. tubulosa على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة. وتشمل هذهفينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche(CPhGs) و iridoids و polysaccharides. كواحد من العديد من المكونات النشطة فيC. tubulosa، وقد أظهرت CPhGs تأثيرات مقنعة مضادة للأكسدة ، ومضادة للتعب ، وقائية عصبية ، ومضادة للالتهابات في كل من الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر [7]. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن CPhGs (فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche) لها تأثيرات كبدية. الآليات المحتملة الكامنة وراء هذه التأثيرات هي إزالة الجذور الحرة ، وحماية الأغشية الكبدية ، والتنظيم المناعي ، وتثبيط موت الخلايا المبرمج ، وتثبيط التعبير عن HBsAg و HBeAg ، وتثبيط تكرار الحمض النووي HBV وغيرها [8-11]. ومع ذلك ، فإن القليل من الدراسات في الأدبيات تتناول تأثير التليف الكبدي للرسومات. لذلك هدفت هذه الدراسة إلى تقصي تأثير التليف الكبدي للـ GPhCs باستخدام نموذج من الزلال المصل البقري (BSA) الناجم عن التليف الكبدي في الجرذان. تم فحص الآليات الجزيئية ذات الصلة في خلايا HSC-T6.

طُرق

المواد الكيميائية والكواشف

تم شراء مجموعة Hydroxyproline (التحلل المائي القلوي) (الكمية: 20140616) من معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (الصين). تم شراء مجموعات أطقم ELISA شطيرة الفئران TGF - 1 (الكمية: 238240615) من شركة Lianke Biotech Co.، Ltd. (الصين). تم توفير الجسم المضاد لـ Rabbit Anti-Collagen I (الكمية: 140619) ، والأجسام المضادة لـ Rabbit Anti-Collagen III (الكمية: 980788 W) ، والأجسام المضادة لـ Rabbit Anti-TGF - 1 (الكمية: 140619) بواسطة شركة Beijing Biosynthesis Biotechnology Co. ، المحدودة (الصين). مرفق بمصل الأغنام العادي (سائل العمل) (الدفعة: WP141214) ، PV -6000 (الكمية: WK141225) ، ومجموعة DAB (القطعة: K136621D) تم شراؤها من Zhongshan Golden Bridge Biotech Co.، Ltd. (الصين) . تم إجراء الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام 2. محلول الجسم المضاد (Alk-Phos. مقترن ، مضاد للأرنب) و 2. محلول الجسم المضاد (Alk-Phos. Conjugated ، Anti-mouse) (دفعة: 272387) تم شراؤه من شركة Invitrogen (الولايات المتحدة الأمريكية) ). تم شراء ألبومين مصل الأبقار (BSA) (Lot: SLBG8239V) من Sigma (الولايات المتحدة الأمريكية). قبل الاستخدام ، تم تحضير BSA عند 18 جم / لتر في محلول ملحي عادي ، وإزالة البكتيريا عن طريق الترشيح ، وتخزين مساحة سطح الجسم عند 4 درجات. تم خلط المادة المساعدة غير المكتملة لـ Freund التي تحتوي على 1 غرام من الدهون من شعر الأغنام (الدفعة: AF0220LA14 ، Shanghai Ye Bio-Technology Co. المحدودة (الصين) ، معقمة في الأوتوكلاف البخاري ، وتخزينها عند 4 درجات. تم الحصول على العقار الإيجابي BJRG كأقراص Biejiarangan من شركة Inner Mongolia Furui Medical Science Co.، Ltd. (الصين). تم تحضير مخزون الأدوية BJRG عن طريق التذويب أقراص BJRG في ماء مقطر بتركيز 600 مجم / كجم.

المواد النباتية

C. tubulosa(عائلة Orobanchaceae) من منطقة Minfeng في Xinjiang في الصين. تمت المصادقة على المادة من قبل الباحث جون تشاو ، المختبر الرئيسي لطب الأويغور ، معهد المواد الطبية في شينجيانغ. تم إيداع عينات القسائم في معهد المواد الطبية في شينجيانغ.

إعداد CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)

جذور مجففة ومقطعةC. tubulosa(6. 0 كجم) تم استخلاصها على التوالي تحت التكثيف ثلاث مرات مع 7 0 بالمائة من الإيثانول ، وتمت إزالة المذيب لإنتاج مستخلص الإيثانول. تمت تنقية مستخلصات الإيثانول باستخدام راتنج AB -8 للحصول على فينيل إيثانول جليكوسيدات (CPhGs). تم إذابة محاليل مخزون CPhGs المستخدمة لمجموعات الجرعات المختلفة في الدراسات على الحيوانات (500 مجم / كجم ، 250 مجم / كجم ، 125 مجم / كجم ، على التوالي) في 0.5 بالمائة (5 جم / لتر) كربوكسي ميثيل السليلوز (ملح الصوديوم).

الكمي من CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)

تم تحديد محتويات مكونين (echinacoside و acteoside) في CPhGs بواسطة HPLC باستخدام طريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا (Zhang et al. 2 0 04) [12]. تم إجراء HPLC باستخدام جهاز HPLC Shimadzu LC -10 مجهز بكاشف للأشعة فوق البنفسجية. كان عمود HPLC عبارة عن عمود Phenomenex Gemini ODS (250 × 4.6 مم ، 5 ميكرون). تتألف المرحلة المتنقلة المتساوية من ميثانول أسيتونيتريل -1 في المائة من حمض الأسيتيك (15:10:75 ، ت / ت / ت). كان الشطف لمدة 40 دقيقة وظل معدل التدفق عند 0.6 مل / دقيقة. تم الحفاظ على درجة حرارة العمود ثابتة عند 30 درجة. كان الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية عند 334 نانومتر.

الحيوانات وخط الخلايا HSC-T6

تم شراء ذكور فئران Sprague-Dawley (SD) البالغة (180-220 جم) من [درجة SPF] من مركز الحيوانات بجامعة شينجيانغ الطبية ، رقم الترخيص: SCXK (جديد) 2011-0004. تم تغذية الفئران بالطعام الخالي من مسببات الأمراض (SPF). تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالتجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في أول مستشفى تابع لجامعة شينجيانغ الطبية. تم إيواء الفئران في أقفاص في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (25 درجة و 12 ساعة في دورة الضوء / الظلام) وكان لها حرية الوصول إلى طعام الفئران القياسي ومياه الصنبور. تم تأقلم الفئران قبل العلاج. تم الحصول على خط الخلايا النجمية الكبدية للجرذان الخالد ، HSC-T6 ، من Wuhan Procell Gene Biotechnology Co.، LTD. (ووهان ، الصين). تمت زراعة خلايا HSC-T6 في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM ، بكين ، الصين) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (Gibco ، أمريكا الجنوبية) ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (بكين. ، الصين) في حاضنة رطبة عند 37 درجة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

إصابة الكبد التي يسببها BSA والعلاجات

تم تقسيم خمسة وسبعين جرذان SD بشكل عشوائي إلى ست مجموعات: عادي (معالج بالماء المقطر) ، نموذج (BSAtreated) ، عقار إيجابي (BSA-المعاملة بالإضافة إلى BJRG 600 مجم / كجم / يوم) ، و BSA المعالج بالإضافة إلى CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)(125 ، 25 0 ، 5 {{2 0} 0 مجم / كجم / يوم) مجموعات. كان لدى المجموعات المعالجة بـ BSA بالإضافة إلى CPhGs (125 ، 250 ، 5 00 ملغم / كغم / يوم) 13 جرذًا في كل مجموعة ، وكانت المجموعة الأخرى تحتوي على 12 جرذًا في كل مجموعة. ينقسم نموذج إصابة الكبد الناجم عن مساحة سطح الجسم إلى توعية أولية يتبعها هجوم مناعي) [13]. باستثناء المجموعة العادية ، تم إعطاء المجموعات الأخرى حقن متعددة تحت الجلد مع 0.5 مل (9 مجم / مل) من BSA Freund المساعد غير المكتمل في اليوم الأول واليوم 15 واليوم 22 واليوم 29 واليوم 36 للتوعية الأولية. بعد سبعة أيام من الحقنة الخامسة ، تم الحصول على الدم من خلال الضفيرة الوريدية لشبكية الفئران واختبارها من أجل الأجسام المضادة لألبومين الدم. تم الكشف عن الأجسام المضادة BSA في مصل الفئران بطريقة انتشار أجار مزدوج. تم إجراء الحقن الهجومي عن طريق إعطاء 0.4 مل من BSA في محلول ملحي عادي كان من خلال الوريد الذيلية في الفئران إيجابية الجسم المضاد BSA مرتين في الأسبوع لمدة عشر مرات. كانت التركيزات وأوقات الحقن 5. 00 ، 5.50 ، 6. 00 ، 6.50 ، 7. 00 ، 7.50 ، 8.50 ، 9. 00 ، 9.50 و 10.00 جم / لتر في اليوم 46 ، اليوم 50 ، اليوم 53 ، اليوم 57 ، اليوم 60 ، اليوم 64 ، اليوم 67 ، اليوم 71 ، اليوم 74 واليوم 78 على التوالي. في المجموعة العادية ، تم استخدام المحلول الملحي العادي للحقن المناعي الأولي (التحسس) والثانوي (الهجوم) بدلاً من مساحة سطح الجسم ، وكانت الظروف الأخرى مماثلة لتلك الموجودة في المجموعة النموذجية. المجموعة الطبيعية كانت تؤخذ عن طريق الفم بالماء المقطر بجرعة 10 مل / كجم / يوم. تم إعطاء مجموعة النموذج عن طريق الفم 10 مل / كجم / يوم 0.5 في المائة من محلول CMC-Na. تم إعطاء مجموعة الدواء الإيجابية عن طريق الفم 600 ملغم / كغم / يوم BJRG. BSA المعالج بالإضافة إلى CPhGs (125 ،

250 ، و 500 ملغم / كغم / يوم) عن طريق الفم 125 ، 250 ، و 500 ملغم / كغم / يوم CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)، على التوالى. استمرت الجرعات اليومية في الجرعات لمدة أسبوعين بعد الحقن الأخير. بعد فترة التجربة ، تم صيام الفئران لمدة 12 ساعة قبل 10 في المائة من هيدرات الكلورال ثم الموت الرحيم على الفور. تم جمع عينات المصل من كل جرذ واستخدمت على الفور. تم حصاد الكبد لغرضين: (1) الحفظ في النيتروجين السائل لمجموعات Hyp و (2) التثبيت في 10٪ فورمالدهايد للفحوصات النسيجية والكيميائية المناعية. كانت المدة الكاملة للدراسات على الحيوانات 93 يومًا.

مؤشرات الكبد والطحال

تم تشريح الكبد والطحال عن طريق فتح البطن وغسلها بمحلول ملحي طبيعي 4 درجات. بعد امتصاص الماء الزائد بورق الترشيح ، تم وزن الكبد والطحال لحساب المؤشرات المقابلة: الوزن النسبي للعضو=كتلة العضو (جم) / كتلة الجسم الفردية (جم) × 100 بالمائة [14].

تجارب الخلايا

تم طلاء خلايا HSC-T6 في لوحة بئر 96-. في البداية ، تمت زراعة الخلايا باستخدام DMEM الذي يحتوي على 1 0 بالمائة من FBS لمدة 48 ساعة. ثم تم استبدال الوسيط بـ DMEM بدون FBS لتجويع الخلايا لمدة 12 ساعة. ثم تمت زراعة الخلايا باستخدام DMEM الذي يحتوي على 5.0 نانوغرام / مل من TGF - 1 (بدون FBS) لمدة 24 ساعة. أخيرًا ، تركيزات مختلفة من CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)(100 ميكروغرام / مل ، 50 ميكروغرام / مل ، و 25 ميكروغرام / مل) ، أكتيوسيد (6 ميكروغرام / مل ، 3 ميكروغرام / مل ، 1.5 ميكروغرام / مل) ، وإشنكوسايد (500 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، و 125 ميكروغرام / مل) أجريت في صفيحة في آبار رباعية وحضنت لمدة 48 ساعة.

تحليل PCR في الوقت الحقيقي

تم تحديد مستوى تعبير mRNA لـ NF-B و p65 والكولاجين بواسطة PCR في الوقت الفعلي. لتحديد تعبيرات الرنا المرسال في خلايا HSC-T6 ، تم زرع الخلايا (4 × 105 خلايا) في ستة أطباق مع 3 مل DMEM مع 10 بالمائة من FBS وحضنت طوال الليل عند 37 درجة و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، وبعد ذلك وسائط زراعة الخلايا تم تغييرها إلى DMEM خالية من المصل. التالي ، CPhGs(فينيل إيثانول جليكوسيدات من cistanche)(1 0 0 ميكروغرام / مل ، 50 ميكروغرام / مل ، 25 ميكروغرام / مل) ، أكتيوسيد (6 ميكروغرام / مل ، 3 ميكروغرام / مل ، 1.5 ميكروغرام / مل) وإكينكوسايد (500 ميكروغرام / مل) ، 250 ميكروغرام / مل ، و 125 ميكروغرام / مل) إلى الآبار. بعد 48 ساعة من الحضانة باستخدام مركبات CPhG أو التراكيب الأحادية ، تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحريكه بقوة باستخدام الكلوروفورم لمدة 15 ثانية. بعد الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق ، تم طرد المحللة عند 12 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات. تم ترسيب الحمض النووي الريبي في الطور المائي باستخدام الأيزوبروبانول ، وتم نقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد. تم ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 0.75 بالمائة من الإيثانول ، وبعد ذلك تم تعجيل أنبوب الطرد المركزي الدقيق وطرده عند 12 ، 000 × جم عند 4 درجات لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. تمت إزالة المادة الطافية وتجفيف RNA عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. مجموعات محددة من البادئات (Sangon ، شنغهاي ، الصين) التي تم استخدامها لتضخيم الجرذ - اكتين [GenBank: NM _031144. 3] ، Collagen I [GenBank: NM _ 053304. 1] ، و NF -κB p65 [GenBank: NM _199267. 2] تم تصميم الجينات باستخدام Batch Primer 3. كانت البادئات الأمامية (fw) والعكسية (rv) كما يلي: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG ، rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA) ، NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG ، rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA) ، -اكتين (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G ، rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). تم تطبيع النتائج إلى mRNA لجين التدبير المنزلي-أكتين كعنصر تحكم داخلي وتم تقديمها كمستويات mRNA نسبية. تم إجراء ردود الفعل باستخدام 8 ميكرولتر iQ SYBR Green Supermix ، وزوج تمهيدي 1 ميكرولتر 10 ميكرولتر ، و 8.5 ميكرولتر من الماء المقطر ، و 2.5 ميكرولتر (كدنا). تم إجراء كل تفاعل بوليميريز متسلسل في الظروف التالية: 95 درجة لمدة 3 دقائق ، ثم 40 دورة من 10 ثوان عند 95 درجة ، و 30 ثانية عند 55 درجة ، و 10 ثوان عند 55 درجة - 95 درجة للتمديد ، متبوعًا بقياس التألق الفردي . تم وصف النتائج النهائية بالقيم النسبية (2- قيراط). تم إجراء الحساب والتحليل بواسطة نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل iQ5 Real-Time PCR.

تحليل لطخة غربية

تم تحديد مستويات تعبير البروتين Collagen I (Abcam، Cambridge، UK، Art No: ab3471 0) عن طريق النشاف الغربي [مع -اكتين (لو: 60008-1- lg؛ Proteintech ، الصين) كعنصر تحكم منزلي. تم تحضير مستخلصات الخلايا الكاملة باستخدام مقايسة الرادار المناعي الراديوي (RIPA) (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع كوكتيل مثبط Halt الأنزيم البروتيني بنسبة 1 بالمائة (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 بالمائة كوكتيلات مثبطات Halt phosphatase (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس تركيز البروتين وتحديد كميته بواسطة طريقة برادفورد [18]. تم فصل البروتين (10-50 ميكروغرام) على هلام SDS-PAGE بنسبة 10 بالمائة ونقله إلى أغشية PVDF (ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حظر الأغشية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع 5 في المائة من مساحة سطح الجسم ، وتم تحضين الأجسام المضادة الأولية (الجسم المضاد للكولا من الجيل الأول ، التخفيف 1: 200 أو الفأر mAb of -actin ، 1: 5000 التخفيف) عند 4 درجات طوال الليل. ألك-فوس المقابل. تم تحضين الأجسام المضادة الثانوية المترافقة عند درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تم غسل الأغشية ثلاث مرات بمحلول ملحي 1 × تريس - حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.1 بالمائة توين 20 ، وتم مسح الإشارات وتصورها بواسطة نظام التصوير GEL DOC XR (Bio-Rad). تم إجراء تحليل Densitometric على البروتينات ذات الأهمية وتطبيعها إلى -actin بواسطة برنامج GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). - تم استخدام الأكتين كرقابة داخلية.

تحليل احصائي

تم تطبيق اختبار الحالة الطبيعية لشابيرو ويلك واختبار تجانس التباين الخاص بـ Levene للتحقق من الحالة الطبيعية و You et al. مجلة دارو للعلوم الصيدلانية (2 0 15) 23:52 صفحة 4 من 13 تجانس التباين. تم استخدام تحليل التباين (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey اللاحق لتحديد الفروق الإحصائية غير المتجانسة ، والبيانات الموزعة بشكل طبيعي. تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis غير المعياري لتحليل البيانات غير الموزعة بشكل طبيعي أو المتجانسة. تم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± SD. تم تعيين الأهمية في P <0. 05.="" تم="" تحليل="" جميع="" البيانات="" بواسطة="" برنامج="" spss="" 16.0="" (جامعة="" شينجيانغ="">

نتائج

التحديد الكمي لـ CPhGs

تحتوي مركبات CPhG في C. tubulosa على اثنين من جليكوسيدات كحول فينيل إيثيل ، إشنكوسايد ، وأكتيوسيد ، وتم تحديد محتوياتها في CPhGs بواسطة تحليل HPLC (الشكل 1) لتكون 42.71 ± 0. 42 بالمائة و 14.27 ± {{7 }}. 18 بالمائة على التوالي.

مؤشرات الكبد والطحال

كما تم توضيح الجدول 1 ، تم رفع مؤشرات الكبد والطحال لمجموعة النموذج بشكل ملحوظ [P <0. 0="" 1="" ،="" p=""><0.05]. تم="" تقليل="" مؤشرات="" الكبد="" والطحال="" للعقار="" الموجب="" bjrg="" و="" cphgs="" عند="" مجموعات="" الجرعات="" المختلفة="" بشكل="" كبير="" مقارنةً="" بالمجموعة="" النموذجية="" [pliver="0." 004="" ،="" pliver="0." 003="" ،="" pliver="0." 004="" ،="" pliver="0." 005="" ؛="" pspleen="0." 017،="" pspleen="0." 027،="" pspleen="0." 024،="" pspleen="0." 070="" على="" التوالي].="" كانت="" مؤشرات="" الكبد="" والطحال="" أقل="" من="" تلك="" الخاصة="" بالمجموعة="">

تأثيرات CPhGs على أنشطة ALT و AST وعلامات تليف الكبد

في هذه الدراسة ، تم زيادة مستويات مصل الإنزيمات الكبدية AST و ALT بشكل كبير في المجموعة النموذجية ، مما يعكس تلف خلايا الكبد في فئران تليف الكبد المستحثة بـ BSA. ومع ذلك ، فإن التجارب.

أظهر أن العلاج بـ BJRG (6 0 0 مجم / كجم) و CPhGs (125 ، 25 0 ، و 5 {{1 {22}}} 0 mg / kg) خفض AST بشكل ملحوظ [PAST <0. 0="" {{6="" 0}="" 1="" ،="" past=""><0. 001="" ،="" past=""><0.001 ،="" past=""><0.001 ،="" بشكل="" طيفي]="" و="" alt="" [palt="0." 117="" ،="" palt="0." 139="" ،="" palt="0." 189="" ،="" palt="0." 255="" ،="" على="" التوالي]="" في="" فئران="" التليف="" الكبدي="" .="" (الجدول="" 2).="" تمت="" زيادة="" مستويات="" ha="" و="" ln="" و="" pc="" و="" iv-c="" في="" الفئران="" النموذجية="" بشكل="" ملحوظ="" [pha=""><0.001 ،="" pln=""><0.001 ،="" ppciii="0." 002="" ،="" piv-c=""><0.001 ،="" على="" التوالي].="" مقارنة="" بمجموعة="" النماذج="" ،="" مستويات="" ha="" [pha="0." 009،="" pha="0." 007،="" pha="0." 009،="" pha="0." 023،="" على="" التوالي]="" ،="" ln="" [pln="0." 011،="" p="" ln="0." 004،="" p="" ln="0." 026،="" p="" ln="0." 069،="" على="" التوالي]،="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.="" 006،="" p="" pciii="0." 067،="" p="" pciii="0." 136،="" p="" pciii="0." 296="" ،="" على="" التوالي]="" ،="" و="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001="" ،="" p="" iv-c=""><0.001 ،="" p="" iv-c=""><0.001 ،="" p="" iv-c=""><0.001 ،="" على="" التوالي]="" في="" الفئران="" انخفضت="" بشكل="" ملحوظ="" بواسطة="" bjrg="" (600="" مجم="" كجم)="" و="" cphgs="" عند="" مجموعات="" جرعة="" مختلفة="" (125="" ،="" 250="" ،="" و="" 500="" مجم="" كجم)="" (الجدول="" 3).="" تم="" اكتشاف="" محتوى="" مرتفع="" و="" tgf="" {73}}="" أيضًا="" عن="" طريق="" قياس="" مستويات="" hyp="" في="" أنسجة="" الكبد.="" كما="" هو="" مبين="" في="" الجدول="" 4="" ،="" يعني="">كان المستوى في المجموعة النموذجية أعلى بكثير من المجموعة العادية ، لكنه انخفض بشكل ملحوظ في مجموعة BJRG ومجموعات جرعات CPhGs المختلفة. زاد التركيز الكبدي لـ TGF {0} من مجموعة النموذج في الفئران بشكل ملحوظ [P <0. 0="" 0="" 1].="" مقارنة="" بمجموعة="" النموذج="" ،="" انخفضت="" مستويات="" tgf="" -="" 1="" للعقار="" الإيجابي="" ومجموعات="" جرعات="" cphg="" المختلفة="" بشكل="" ملحوظ="" [p="" tgf="" -="" 1=""><0. 001،="" p="" tgf="" -="" 1=""><0.001 ،="" p="" tgf="" -="" 1=""><0.001 ،="" ptgf="" -="" 1=""><0.001 ،="" على="" التوالي].="" تم="" تلخيص="" النتائج="" في="" الجدول="">

فحص الأنسجة

تُظهر ملاحظات أقسام أنسجة الكبد الطبيعية الملطخة بـ H&E و Masson ثلاثي الألوان الفصيصات الكبدية والجيوب الكبدية. كان هيكل أنسجة الكبد في الفئران النموذجية مضطربًا ، وتم استبدال أنسجة الكبد والجيوب الكبدية بكمية كبيرة من النسيج الضام. ومع ذلك ، تم اكتشاف بنية خلوية طبيعية وأنسجة ضامة أقل في مجموعة العلاج من تلك الموجودة في مجموعة النموذج.

تلطيخ H&E

في المجموعة الطبيعية ، لوحظت سلامة هيكلية الفصيص الكبدي بدون مناطق مداخل غير طبيعية وشبهات جيبية كبدية. تم ترتيب الحبال الكبدية بطريقة منظمة ، مع نواة دائرية وواضحة. تقع النوى في وسط الخلية ، مع وفرة من السيتوبلازم. تحتوي منطقة المدخل فقط على كمية صغيرة من الأنسجة الليفية (الشكل 2 أ). في المجموعة النموذجية ، أصيب الهيكل المفصص بأضرار بالغة. أظهرت خلايا الكبد تنكسًا مائيًا خفيفًا ، معظمها تنكس منتفخ و / أو تنكس دهني. كما لوحظ تكوين تسلل للخلايا الالتهابية ، وتضخم الأنسجة الليفية الواسع ، وتشكيل عدد كبير من الحاجز الليفي ، والفصيصات المنقسمة ، وتكاثر كبير لخلايا الكبد. أكدت هذه الملاحظات نجاح إنشاء نموذج حيواني لإصابة الفئران المناعية للتليف الكبدي (الشكل 2 ب). مقارنة بالمجموعة النموذجية ، كان هناك انخفاض في تسلل الخلايا الالتهابية في مجموعات CPhG المختلفة. كما لوحظ وجود تنخر أقل وتنكس دهني لخلايا الكبد بالإضافة إلى التخفيف من التليف. خففت CPhGs بشكل كبير من أمراض التليف الكبدي الناجم عن BSA في الفئران ، وخففت من تورم خلايا الكبد ، ومنع بشكل فعال نخر خلايا الكبد وتسلل الخلايا الالتهابية ، مما يشير إلى أن CPhGs تمارس تأثيرًا وقائيًا على التليف الكبدي الناجم عن BSA. (الشكل 2 ج-و). تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان في المجموعة الطبيعية ، كانت أنسجة الكبد طبيعية. أظهرت منطقة البوابة الكبدية عددًا صغيرًا من ألياف الكولاجين الأزرق ، وكان نسيج الكبد منظمًا بشكل طبيعي (الشكل 3 أ). بالمقارنة مع أنسجة الكبد للمجموعة الطبيعية ، تكاثر النسيج الليفي بواسطة النشرة المركزية وامتد إلى حمة الكبد. ألياف الكولاجين ممتدة ومترابطة و

يلف الفصيص بأكمله ويحيط الوريد المركزي. هذه التأثيرات ، جنبًا إلى جنب مع تليف الخلايا الكبدية ، والضرر البنيوي المفصص ، والتليف المحيط بالباب ، وتكوين الكاذب الكاذب (الشكل 3 ب) قدمت دليلاً على أن النموذج قد تم إنشاؤه. بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، تم تمديد ألياف الكولاجين في مجموعة مراقبة الأدوية الإيجابية بشكل معتدل للخارج من منطقة البوابة الطرفية (الشكل 3 ج). بالتوازي مع المجموعة النموذجية ، تم تقليل ألياف الكولاجين في مجموعات جرعات CPhG المختلفة بشكل كبير ، وتم منع تكاثر الألياف ، وانخفض تكاثر الأنسجة الليفية داخل حمة الكبد بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن CPhGs تحمي الفئران من التليف الكبدي الناجم عن BSA (الشكل 3 D-f).

تلطيخ المناعي

الأهم من ذلك ، أن التعبير عن الكولاجين من النوع الأول والكولاجين من النوع الثالث يلعبان أدوارًا أساسية في تطور التليف الكبدي ، ويمكن أن يعمل تكوينهما وترسبهما في أنسجة الكبد كمحدد مهم للفعالية المضادة للتليف الكبدي. تم تلخيص النتائج في الجدول 5

نوع الكولاجين الأول

تعبر المجموعة الطبيعية عن نوع الكولاجين الأول بشكل رئيسي في الأوعية الدموية ومنطقة البوابة. عبّرت مجموعة النموذج بشدة عن تليف الأوعية الدموية من النوع الأول من الكولاجين في مناطق المدخل. في مساحة Disse ، لوحظ تلطيخ الكولاجين من النوع الأول خطوطًا أو كتوزيع غير مكتمل. الكولاجين مغلف بالحواجز الليفية لتشكيل جزيء كاذب. في هذه التجارب ، تم تكوين عدد أقل من الحواجز الليفية لـ BJRJ (600 مجم / كجم) ومجموعات جرعة مختلفة من CPhGs (125 و 250 و 500 مجم / كجم) [PCol I=0. 002 ، PCol I {{ 6}}. 001، PCol I=0. 023، P Col I=0. 044 على التوالي]. أظهرت النتائج الدلالية أن التعبير عن نوع الكولاجين الأول كان أقل بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة النماذج (الشكل 4).

نوع الكولاجين الثالث

تم التعبير عن نوع الكولاجين الثالث بشكل ضعيف في المجموعة الطبيعية ، وعرضت المناطق المحيطية المحيطة بالبوابة والأوردة الكبدية كمية صغيرة من اللون الأصفر الناعم بدلاً من الألياف المستمرة (الشكل 5 أ). في المجموعة النموذجية ، أظهرت ألياف الكولاجين حبالًا عريضة وسميكة ، مما يشير إلى تعبير قوي ، وتقع بشكل أساسي في مناطق الأنسجة المدخل والأنسجة الليفية (الشكل 5 ب). كانت ألياف الكولاجين من BJRJ (600 مجم / كجم) ومجموعات الجرعات المختلفة من CPhGs (125 و 250 و 500 مجم / كجم) خيطية وموزعة حول الوريد المركزي ومناطق البوابة. بالمقارنة مع مجموعة النموذج ، تم تقليل ألياف الكولاجين بشكل كبير ، وكان التلوين شاحبًا ورقيقًا ، وكان التلوين الكيميائي المناعي إيجابيًا بشكل ضعيف (الشكل 5 ج-و). توضح هذه النتائج شبه الكمية أن الخلايا المعبر عنها إيجابيًا في مجموعات الجرعات الإيجابية والمختلفة [PCol III=0. 015 ، PCol III=0. 001 ، PCol III=0. 010 ، و كانت P Col III=0. 037 ، على التوالي] مختلفة عن تلك الموجودة في مجموعة النموذج.

TGF - 1

كان هناك القليل من التعبير عن TGIF {{0}} في خلايا كبد الفئران الطبيعية. اقتصر التعبير على عدد صغير من الخلايا الخلالية (الشكل 6 أ). في المجموعة النموذجية ، تم توزيع تعبير TGF - 1 على نطاق واسع في منطقة المدخل ، والمساحات الليفية ، والخلايا النجمية الكبدية ، والخلايا الالتهابية ، والجدار الجيبي والسيتوبلازم. أظهرت منطقة مدخل معينة تعبيرًا إيجابيًا قويًا مع تلطيخ أصفر مائل إلى البني (الشكل 6 ب). كان هناك قدر ضئيل من التعبير في منطقة المدخل والحاجز الليفي لـ BJRJ (600 مجم / كجم) ومجموعات جرعة مختلفة من CPhGs (125 و 250 و 500 مجم / كجم). تم تقليل مدى التلوين الإيجابي في هذه المجموعات بشكل ملحوظ مقارنة مع مجموعة النموذج. انخفض التلوين في الخلايا الخلالية في الحاجز الليفي وسيتوبلازم الخلايا الالتهابية (الشكل 6 ج-و). كشفت النتائج شبه الكمية أن BJRJ ومجموعات جرعة مختلفة من CPhGs [P TGF - 1=0. 001، P TGF - 1 <0.001، p="" tgf="" -="" 1="0." 009،="" ptgf="" -="" 1="0" .004="" ،="" على="" التوالي]="" كانت="" ذات="" دلالة="" إحصائية="" مقارنة="" بمجموعة="" النموذج.="" كما="" ذكرنا="" سابقًا="" في="" المقالة="" ،="" tgf="" -="" 1="" هو="" سيتوكين="" مهم="" في="" الفيزيولوجيا="" المرضية="">

تليف ، وتحفيز إنتاج المصفوفة خارج الخلية [19]. أظهرنا أن مستوى TGF - 1 زاد في مجموعة النموذج بطريقة تتفق مع شدة تليف الكبد. كانت مستويات تعبير TGF - 1 في الكبد متوافقة مع مستويات TGF في الدم - 1. يشير هذا إلى أن CPhGs يمكن أن تقلل بشكل كبير من تليف الكبد بسبب تعبير TGF - 1 من خلال المشاركة في تخليق وتدهور ECM. يمكن للتعبير عن الكولاجين من النوع الأول ونوع الكولاجين الثالث و TGF - 1 اكتشاف العملية المرضية للتليف الكبدي. انخفضت مستويات تعبيرهم في مجموعات العلاج بشكل كبير وأوضحت أن CPhGs يمكن أن تحسن نشاط الكولاجيناز ، والحفاظ على التوازن الديناميكي لتخليق ECM وتدهوره ، وبالتالي تأخير ومنع تكوين تليف الكبد.