الجزء 1 RNA-Seq الجزء 1 المستند إلى مجموعة النسخ النصية De Novo واكتشاف الجينات من Cistanche Deserticola Fleshy Stem

للمزيد من المعلومات أرجو الأتصال:Joanna.jia@wecistanche.com

الملخص

الخلفيات

Cistanche Deserticolaهو نبات طفيلي غير ضوئي تمامًا وله قيمة طبية كبيرة ويتم توزيعه بشكل أساسي في صحراء شمال غرب الصين. يعتبر جذعها اللحمي المجفف منشطًا حاسمًا في الطب الصيني التقليدي مع دور رئيسي في تحسين الوظيفة الجنسية للذكور وتقوية المناعة ، ولكن تم إجراء القليل من الدراسات الآلية جزئيًا بسبب نقص الموارد الجينومية والنسخية.

Cistanche deserticola له العديد من التأثيرات ، انقر هنا لمعرفة المزيد

نتائج

في هذه الدراسة ، أجرينا تسلسلًا عميقًا للنسخة في الجذع السمين لـجيم الصحراء، وحوالي 8 0 مليون قراءة تم إنشاؤها باستخدام تسلسل طرفي Illumina على النظام الأساسي HiSeq2000. باستخدام مجمّع الثالوث ، حصلنا على 95787 تسلسلًا نصيًا بأطوال نصية تتراوح من 200 نقطة أساس إلى 15698 نقطة أساس ، بمتوسط ​​طول 950 قاعدة وطول N50 يبلغ 1519 قاعدة. تم تحديد 63،957 نسخة بشكل نشط باستخدام FPKM أقل من أو يساوي 0.5 ، حيث تم شرح 30،098 نسخة مع أوصاف الجينات أو مصطلحات علم الجينات عن طريق تحليلات التشابه التسلسلية مقابل العديد من قواعد البيانات العامة (Uniprot و NR و Nt في NCBI و KEGG). علاوة على ذلك ، حددنا جينات الإنزيم الرئيسية المشاركة في التخليق الحيوي للجنين وجليكوسيدات فينيلثانويد (PhGs) والتي من المعروف أنها المكونات النشطة الأساسية. تم تحديد أربعة جينات فينيل ألانين أمونيا لياز (PAL) ، وهي أول إنزيم رئيسي في التخليق الحيوي للجنين و PhG ، بناءً على مقارنة التسلسلات وتحليل النشوء والتطور. تم اقتراح مسارين للتخليق الحيوي للـ PhGs لأول مرة.

الاستنتاجات

بشكل عام ، أكملنا تحليلًا عالميًا لـجيم الصحراءنسخة جذعية سمين باستخدام تقنية RNA-seq. تم تحديد مجموعة من جينات الإنزيم المتعلقة بالتخليق الحيوي للجنين والجليكوزيدات الفينيلثانويد من النصوص المجمعة والمشروحة ، كما تم التنبؤ بالعائلة الجينية لـ PAL. ستوفر بيانات التسلسل من هذه الدراسة مورداً قيماً لإجراء أبحاث التخليق الحيوي لجليكوسيدات الفينيثانويد المستقبلية والدراسات الجينومية الوظيفية في هذا النبات الطبي المهم.

مقدمة

جيم الصحراءهو جنس عالمي من النباتات الصحراوية المعمرة من عائلة Orobanchaceae ، وهو نوع لا يقوم بعملية التمثيل الضوئي تمامًا وعادة ما ينمو نباتات طفيليات تحت الأرض [1]. يتطفل على جذور نبات البازاموفيت هالوكسيلون أموديندرون (Chenopo- diaceae) [1 ، 2] ، والذي يسكن بشكل أساسي الصحاري وشبه الصحاري نظرًا لتحمله العالي للجفاف والملوحة [1 ، 3].جيم الصحراءيُظهر مقاومة قوية للظروف البيئية القاسية ويتم توزيعه بشكل أساسي في شمال غرب الصين [4-6] ، خاصة في منغوليا الداخلية وقانسو وشينجيانغ. يعتبر من الأنواع البرية المهددة بالانقراض في السنوات الأخيرة بسبب زيادة استهلاك البشر [5 ، 6]. يُطلق على C. تم تسجيله في البداية في Shen Nong Ben Cao Jing (قاموس المواد الطبية الصينية ، 1977) [11] منذ حوالي 1800 عام وكان يعتبر أحد المصادر الرئيسية للأعشاب الطبية الصينية Cistanche.

مقتطفات منجيم الصحراءتمتلك مجموعة واسعة من الوظائف الطبية ، خاصةً للاستخدام في تحسين الوظيفة الجنسية ، وتوحيد لون الكلى ، وحماية الكبد ، والنشاط الخفيف ، وتقوية الذاكرة ، وتنظيم المناعة ، والنشاط المضاد للأكسدة ، ومضاد الالتهاب ، والنشاط المضاد للفيروسات ، إلخ [7-10 ، 12- 15]. المكونات النشطة بيولوجيًا الرئيسية لـ C. حتى الآن ، تم عزل أكثر من 20 جليكوسيدات فينيل إيثانويد من جذع العصارةجيم الصحراء[9 ، 14 ، 16]. من بينها ، أكتيوسيد وإشنكوسايد مكونان رئيسيان لهما أنشطة دوائية مهمة [2 ، 16] ، وتم توثيقهما كمعايير جودة لـجيم الصحراءفي الصيدلة الصينية (إصدارات 2005 و 2010). ثلاثة مكونات كيميائية من PhGs هي حمض عضوي ، والسكاريد ، و phenylethanoid ، ومع ذلك ، لا تزال التفاصيل المتعلقة بمسارات التخليق الحيوي للفينيلثانويد غير مفهومة جيدًا فيجيم الصحراء.

على الرغم من الأهمية التجارية والطبية لـجيم الصحراء، البيانات الجينومية والنسخية لهذا النوع محدودة للغاية. لا توجد ESTs متاحة في قاعدة بيانات NCBI ولا تزال معلومات الجينوم الكاملة لهذا النوع غير متوفرة باستثناء تسلسل جينوم البلاستيدات الخضراء [1]. تعيق البيانات النصية المحدودة دراسة آليات التخليق الحيوي PhG. يمكن لتقنية RNA-seq أن تولد تسلسلات للأجزاء المعبر عنها من الجينوم المستهدف [17] وتحديد الجينات [18] باستخدام منصات تكنولوجيا NGS (مثل Applied Biosystems SOLiD و Illumina HiSeq و Roche 454). لقد أصبح أكثر شيوعًا في تجميع النسخ من novo [19-22] ، نظرًا لأنه نهج فعال من حيث التكلفة وقوي مع دقة عالية ونطاق ديناميكي واسع [23-25] ، خاصةً لأنه يتمتع بميزة استكشاف النصوص ذات الوفرة المنخفضة [26]. بسبب المزايا المختلفة ، فإن RNA-seq جذابة بشكل خاص للكائنات غير النموذجية ذات الموارد الجينية المحدودة [27-29]. ولكن لا يوجد بحث مفصل عن ترنسكريبتوم C. Deserticola بواسطة RNA-seq.

في هذه الدراسة ، قمنا بتسلسل نسخة جذعية لـ C. من خلال التجميع والشرح ، قمنا باستخراج الجينات المشاركة في التخليق الحيوي لـ PhG والجينات المسؤولة عن التخليق الحيوي للجنين بالكامل.

أنشأ تحليل RNA-seq الأولجيم الصحراءنص إجماعي وقدم رؤى جديدة لفهم شامل للقيمة الطبية لـجيم الصحراء.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا على نطاق واسع على نسخ الملف الشخصي لتسهيل اكتشاف الجينات المشاركة في مسارات التخليق الحيوي للمكونات الطبية المحددة في نبات طبي آخر بموارد جينومية محدودة للغاية.

سيستانشله وظائف عديدة

المواد والأساليب

جمع المواد النباتية

الجذع النضرة الطازجة لجيم الصحراءفي مرحلة التنقيب من قاعدة نباتية في BayanHot City of Alexa League في منغوليا الداخلية في شمال غرب الصين. تم الحصول على تصريح التجميع من مالك (مجموعة HongKui CongRong) لقاعدة المصنع. تم إيداع عينة القسيمة في مرفق الجينوم الأساسي في معهد بكين لعلم الجينوم ، الأكاديمية الصينية للعلوم. بعد التنظيف ، تم تقطيع الأنسجة الجذعية النضرة إلى قطع صغيرة وتجميدها على الفور في نيتروجين سائل ، ثم تخزينها في درجة -80 حتى مزيد من المعالجة.

استخراج الحمض النووي الريبي ، وبناء مكتبة (كدنا) ، وتسلسل إلومينا

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الساق النضرة باستخدام TRIzol Reagent (Invitrogen Inc. ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تمت معالجة العينات الناتجة باستخدام DNase I لإزالة أي DNA جيني. تم قياس كمية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام محلل بيولوجي Agilent 21 0 0 (Agilent Technologies) وفحص سلامته باستخدام تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز مع تلطيخ بروميد الإيثيديوم. تم استخدام عينات RNA بنسب A260 / A280 بين 1.9 و 2.1 ، ونسب RNA 28S: 18S أعلى من 1.0 ، وأرقام سلامة RNA (RINs) أقل من أو تساوي 8.5 في التحليلات اللاحقة.

تم إنشاء مكتبات RNA-seq باستخدام مجموعات تحضير عينة Illumina Truseq RNA. تم عزل Poly (A) بالإضافة إلى RNA من إجمالي RNA باستخدام Dynal oligo (dT) 25 حبة وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد التنقية ، تمت إضافة المخزن المؤقت للتجزئة لكسر مرنا إلى أجزاء قصيرة. تم تصنيع First-strand cDNA باستخدام هذه الأجزاء القصيرة كقوالب ، جنبًا إلى جنب مع SuperScript III النسخ العكسي و N6 العشوائي السداسي التمهيدي. تم بعد ذلك تصنيع cDNA من الدرجة الثانية باستخدام المخزن المؤقت ، و dNTPs ، و RNaseH ، و DNA polymerase I. وقد تعرض cDNA مزدوج السلسلة الناتج للإصلاح النهائي باستخدام T4 DNA polymerase ، و DNA polymerase I Klenow ، و T4 polynucleotide kinase ، وربطه بـ محولات باستخدام T4 DNA ligase. تمت تنقية الأجزاء المربوطة بالمحول باستخدام مجموعة استخراج PCR السريع وتم التخلص منها باستخدام المخزن المؤقت EB. بعد التحليل باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام ، تم اختيار الأجزاء المناسبة كقوالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم إجراء تسلسل مكتبة cDNA الناتجة باستخدام نظام Illumina HiSeq 2000.

تجميع نسخ دي نوفو وتقدير التعبير الجيني

تم تنظيف القراءات الأولية الناتجة عن التسلسل عن طريق إزالة تسلسل المحول (ATCTCGTATGCCGTC) باستخدام الطريقة الداخلية. ثم قمنا بتنفيذ عملية تصفية صارمة منخفضة الجودة. أولاً ، سيتم اقتطاع القواعد ذات نقاط جودة Phred أقل من 20 من النهاية 3 من التسلسل ، حتى تصل إلى قاعدة واحدة بجودة أعلى (أقل من أو تساوي 20). إذا كان طول القراءة أقل من 50 نقطة أساس ، فسيتم تجاهلها. ثانيًا ، ستتم تصفية القراءات بشكل أكبر من خلال معيار أن 70 بالمائة من القواعد في قراءة واحدة لها درجات عالية الجودة (أقل من أو تساوي 20). ثالثًا ، تم استخدام قراءات النهاية المزدوجة فقط لمزيد من التجميع. تم إجراء تجميع نسخ De novo باستخدام إصدار Trinity _20130216 [30] والذي يتكون من ثلاث وحدات برمجية متتالية: Inchworm و Chrysalis و Butterfly. تم تعيين معلمات التجميع على النحو التالي: --seqType fq - JM 300G - min _ contig _ length 200— CPU 20 - inchworm _ cpu 20— bflyCPU 20.

لتقدير وفرة النص ، تمت إعادة محاذاة قراءات نهاية الزوج المتسلسلة مع النصوص المجمعة باستخدام برنامج نصي في Trinity [31]. تم استخدام القراءات المعينة للتقدير الكمي بواسطة برنامج RSEM (RNA-Seq بواسطة Expectation Maximization) [32]. تم تمثيل وفرة الجينات أو الشكل الإسوي بالجزء لكل كيلو قاعدة من النص لكل مليون جزء معين (FPKM) قيمة ، تلك النصوص ذات قيمة FPKM التي تساوي أو تزيد عن 0. 05 تم تعريفها على النحو المعبر عنه.

الشرح الوظيفي للنصوص المعبر عنها

لأنه لا توجد مجموعات شرح جيني لـ C. قمنا بتوضيح النصوص المعبر عنها من خلال المقارنة بمجموعات البيانات المحدثة Genbank Nt و Genbank Nr و TAIR 10_ pep _20101214_ بشكل منفصل باستخدام برنامج BLAST (E< =="" 1e-20).="" meanwhile,="" all="" expressed="" transcripts="" were="" translated="" into="" potential="" proteins="" according="" to="" orf="" prediction="" by="" transdecoder="" [30]="" and="" predicated="" for="" the="" conserved="" domains="" based="" on="" the="" pfam="" database="">

العنصر النشط acteoside فيcistanche

شرح علم الوجود الجيني ومسار KEGG

عن طريق محاذاة التشابه المتسلسلة لقاعدة بيانات Uniprot (http://www.uniprot.org/) ، تم الحصول على شرح Gene Ontology (GO) لجميع النصوص المجمعة باستخدام ملف الارتباط الذي تم تنزيله من (ftp://ftp.ebi.ac. uk / pub / databases / GO / goa / UNIPROT / gene _ Association. goa _ uniprot.gz). تم إجراء تجميع مصطلحات GO للجينات المعبر عنها باستخدام البرامج النصية المخصصة ، وقمنا بتوضيح الجينات في المستوى الرابع لفئات CC و BP و MF بشكل منفصل.

تم تعيين معلومات مسار KEGG لجميع تسلسلات البروتينات المتوقعة باستخدام الأداة عبر الإنترنت KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. تم إرسال التسلسلات بتنسيق Fasta إلى طلب KAAS ، وتم تنزيل الملفات الناتجة عن جميع معلومات المسارات المتعلقة بـ C. تم استخدام 13 مجموعة بيانات جينية للكائنات النباتية في KEGG للتعليق التوضيحي باستخدام طريقة BBH (أفضل إصابة ثنائية الاتجاه).

تحليل RT-qPCR

بعد الهضم باستخدام DNase I ، تم تحويل ما يقرب من 5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) أول حبلا عن طريق تفاعل النسخ العكسي باستخدام أوليجو (dT) 15 بادئة ونظام NoScript للنسخ العكسي (Promega). تم بعد ذلك تخفيف منتجات (كدنا) 10- أضعاف بماء منزوع الأيونات خالي من نوكلياز قبل استخدامها كقالب في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. تم تضخيم cDNAs محددة بواسطة GoTaq 2- Step RT-qPCR System (Promega) بحجم 2 0 ماي. تم تشكيل تضخيم PCR عند درجة حرارة التلدين 60 درجة باستخدام 7500 Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم حساب وفرة النسخة النسبية من خلال طريقة عتبة الدورة المقارنة مع الجين "comp 10579_ c0" كمعيار داخلي ، باستخدام برنامج 7500 Manager.

تم تصميم أزواج Primer لـ RT-PCR بناءً على برنامج عبر الإنترنت (http://primer3.ut.ee/) وهي مدرجة في S1 Dataset.

نتائج

تسلسل الحمض النووي الريبي وتجميع نسخة دي نوفو من الجذع السمين C.

تم استخدام جذع C. للحصول على نظرة عامة عالمية على التعبير الجيني في الجذع السمين C. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وتم تنقية polyA plus RNAs لإنشاء مكتبات RNA-seq ثنائية النهاية. تم الحصول على 79،433،734 و 86 ، و 019،176 قراءة نهائية تقابل ما يقرب من 8 مليارات و 8.6 مليار قاعدة من التسلسل باستخدام تسلسل Illumina HiSeq 2000

النظام الأساسي في عينات 2013- عام و 2014- عام (الجدول 1). بعد إزالة تسلسلات المحول وتصفية القراءات منخفضة الجودة (انظر التفاصيل في الطرق) ، تم استخدام 64831.040 قراءة نهائية عالية الجودة في عينة العام 2013- لتجميع نسخة de novo. باستخدام مجمّع تسلسل الثالوث [30] ، تم إنشاء 51719 جينًا و 95787 تسلسلًا نصيًا بأطوال نصية تتراوح من 200 نقطة أساس إلى 15698 زوجًا قاعديًا. يبلغ متوسط ​​طول النصوص المجمعة 950 قاعدة وطول N50 هو 1519 قاعدة. كشف عدد النسخ بأطوال مختلفة أن 57.32 في المائة من النسخة المجمعة كانت حوالي 500- نقطة أساس أو أكثر (الشكل 1 أ). تم تعيين قراءات نهاية الزوج عالية الجودة في عينة عام 2014- إلى النسخة المجمعة. إلى جانب ذلك ، وجدنا أن عدد النسخ لكل جين مُجمع يختلف وأن 69 بالمائة من الجينات ذات شكل إسوي واحد مضغوط بينما 31 بالمائة من الجينات عبرت عن نسختين أو أكثر (الشكل 1 ب).

التعبير الكمي والشرح الوظيفي للنصوص المجمعة

تم قياس وفرة الجينات أو النسخ باستخدام حزمة RSEM ، حيث تمت إعادة محاذاة القراءات المتسلسلة مع الجينات المجمعة أو تسلسل النصوص باستخدام Bowtie وتم استخدام تلك القراءات المعينة للتقدير الكمي. تم حساب قيمة FPKM لكل جين أو نسخة ، وأخيرًا ، حددنا 63،957 و 52،857 نصًا معبرًا بنشاط (قيمة FPKM أقل من أو تساوي 0. 5) في عينات جذع سمين C. deserticola في 2 {{17} } 13 و 2014 على التوالي. تم التعبير بشكل شائع عن 44776 نسخة (70.01 بالمائة في عينة عام 2013- ، 84.71 بالمائة في عينة العام 2014-) في النسختين ، وكان الارتباط (معامل ارتباط بيرسون: 0.91979) لبيانات التعبير الخاصة بهم الموضح في الشكل S1. تم تحميل البيانات الأولية المتسلسلة إلى قاعدة بيانات NCBI SRA (أرقام الانضمام: SRX857402 و SRX858938). استخدمنا الجينات المعبر عنها المحددة في عينة العام 2013- لمزيد من التحليل. تم الحصول على معلومات الشرح الوظيفية لجميع النصوص المكتوبة باستخدام طريقتين. أولاً ، تمت محاذاة جميع النصوص المعبر عنها مع قواعد بيانات تسلسل النوكليوتيدات المعروفة (GenBank not) وقواعد بيانات تسلسل الببتيد (GenBank nr و Arabidopsis peptide) بشكل منفصل بواسطة خوارزمية BLAST. من أصل 63957 نصًا تم التعبير عنه ،

تم وضع تعليقات توضيحية على 29220 (45.7 بالمائة) وأظهرت تجانسًا مع التسلسلات في أي من قواعد بيانات الموضوعات الثلاثة باستخدام القيمة الإلكترونية المقطوعة 1e -20. وفي الوقت نفسه ، تم التنبؤ بمناطق الترميز المرشحة لجميع تسلسلات النسخ المعبر عنها باستخدام برنامج TransDecoder وتم استخدام أطول ORFs لكل نسخة للبحث في مجال Pfam. نتيجة لذلك ، تم شرح 21358 نسخة (33.4 بالمائة) استنادًا إلى قاعدة بيانات Pfam. بشكل عام ، تمت مطابقة 30،098 (47.1 بالمائة) نسخة بشكل كبير مع الجينات المعروفة في قواعد البيانات العامة من خلال الجمع بين الطريقتين المذكورتين أعلاه. تم عرض قائمة النصوص الكاملة المعبر عنها مع التعليق التوضيحي للوظيفة في البيانات التكميلية (S2 Dataset).

قمنا بمسح أفضل 20 نسخة من النصوص الأكثر تعبيرًا (الجدول 2) والتي تقابل 18.99 في المائة من جميع قراءات التسلسل ، ووجدنا أن معظمها عبارة عن جينات تستجيب لللاأحيائية.

محفزات الإجهاد. Dehydrin (DHNs) ، فئة من بروتينات الإجهاد المحبة للماء والمستقرة حراريًا مع عدد كبير من الأحماض الأمينية المشحونة التي تنتمي إلى عائلة المجموعة الثانية من التطور الجنيني المتأخر (LEA) ، هو الجين الأكثر تعبيرًا. تم الكشف عن ثلاثة نسخ مختلفة من Dehyrin (comp 28713_ c 0_ seq1 / 2/4) معبرة بشكل كبير في الجذع السمين الذي قد يكون متورطًا في حماية الخلايا من التلف الناجم عن إجهاد الجفاف. كما تم العثور على جينات أخرى مرتبطة بالإجهاد ، مثل بروتين الصدمة الحرارية ، والبروتين المرتبط بمسببات الأمراض ، والميتالوثيونين ، شديدة التعرض للضغط ، والتي قد تكون مرتبطة ببيئتها القاسية على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك ، بعض الجينات التأسيسية بما في ذلك 26S ribosomal RNA gene (comp 22329_ c 2_ seq1) ، بروتين مرتبط بأكسين مكبوت / سكون (comp 20999_ c 0_ seq1) ، تم أيضًا نسخ عامل ADP-ribosylation (comp 20499_ c 0_ seq1) بشكل كبير.

التصنيف الوظيفي لجميع النصوص المعبر عنها بناءً على قواعد بيانات Gene Ontology و KEGG

تم الحصول على شرح علم الوجود الجيني (GO) من ملف ربط الهويات والتعليقات التوضيحية لـ Uniprot. في المجموع ، تم تخصيص 20907 نسخة ، تمثل 32.69 بالمائة من إجمالي التسلسلات المعبر عنها ، إلى 1745 مصطلحًا وظيفيًا. من إجمالي شروط GO الوظيفية ، شكلت التخصيصات للعملية البيولوجية الغالبية (1116 ، 63.95 بالمائة) تليها المكون الخلوي (329 ، 18.85 بالمائة) والوظيفة الجزيئية (300 ، 17.20 بالمائة). غطت الوظائف المخصصة للنصوص المعبر عنها مجموعة واسعة من فئات GO ، وتم إدراج أفضل 10 مصطلحات GO مع النصوص الأكثر شرحًا في الجدول 3. ونحن نقدم جميع توزيع النصوص المعبر عنها في ثلاث فئات علم الوجود الجيني (الوظيفة الجزيئية ، المكون الخلوي ، والعملية البيولوجية) في الملف التكميلي (S3 Dataset). تم تمثيل مصطلحات GO المتعلقة بوظائف الربط ونشاط الترانسفيريز في الغالب في فئة الوظيفة الجزيئية. حول وظائف الربط ، يمثل الربط الكاتيوني (4،394 نسخة) الأكثر وفرة ، يليه الارتباط بالنيوكليوتيد / النيوكليوزيد (3،404 نسخة في المتوسط) وربط البروتين (2422 نسخة). أثناء تواجدهم في مجموعة نشاط ترانسفيراز ، فإن معظمهم هم أولئك الذين لديهم مجموعات نقل تحتوي على الفوسفور (2256 نسخة ، 65.77 في المائة). من بين فئة المكونات الخلوية ، كانت النصوص موجودة بشكل أكبر داخل الخلايا (10،581 نسخة في المتوسط) ، بينما من بين فئة العمليات البيولوجية ، كانت النصوص أكثر مشاركة في عملية التمثيل الغذائي للبوليمر الحيوي (6،683 نسخة في المتوسط) ، متبوعة بتنظيم العملية الخلوية (4841 نسخة). النصوص) ، والتعبير الجيني (4678 نسخة) والنقل (3512 نسخة).

من أجل استخراج الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للجنين و PhG ، تم البحث في 21358 تسلسل بروتيني محتمل غير فائض مقابل تسلسلات جينية لـ 13 كائنًا نباتيًا في قاعدة بيانات KEGG ، وتم تخصيصها لـ 275 مسارًا لـ KEGG مع ما لا يقل عن 5 زيارات. تم إدراج أفضل 10 مسارات مع التسلسلات الأكثر توافقًا في الجدول 4. وكانت معظم المسارات متورطة في عمليات التمثيل الغذائي الأولية ، مثل الأحماض الأمينية أو استقلاب البروتين (ko01230 ، ko04141 ، و ko04120) ، واستقلاب الكربوهيدرات (ko01200 و ko00500) ، والنيوكليوتيدات أو التمثيل الغذائي للنيوكليوزيد (ko03018 و ko00230 و ko00240). إلى جانب ذلك ، هناك 27 مسارًا ثانويًا متعلقًا بالتمثيل الغذائي (الشكل 2) ، مثل التخليق الحيوي للعمود الفقري التربيني ، والتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد ، والتخليق الحيوي الكاروتينوي ، والتخليق الحيوي القلوي أيزوكينولين ، والتروبان ، والبيبيريدين ، والتركيب الحيوي القلوي بيريدين. توفر هذه النتائج مؤشرًا إضافيًا على أن عمليات التمثيل الغذائي النشطة كانت جارية في الأنسجة الجذعية لـ C. تم إدراج جميع النصوص المعبر عنها المرتبطة بمسارات KEGG في الملف الإضافي (S4 Dataset). على الرغم من وجود بعض المسارات المتغيرة بشكل ملحوظ بين C. المسارات ذات الصلة بالتخليق الحيوي لـ PhGs والتي يمكن أن تكون مفيدة لتوجيه الزراعة.

ترميز الجينات المرشحة للإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للجنين

اللجنين هو ثاني أكثر البوليمرات الأرضية الطبيعية وفرة في المملكة النباتية ، حيث يؤلف ما يصل إلى ثلث المواد الموجودة في جدران الخلايا النباتية [36 ، 37]. كمكوِّن مهم لجدران الخلايا ، يساعد اللجنين في نقل المياه ، ويوفر الدعم الميكانيكي والسلامة الهيكلية ، والدفاع ضد مسببات الأمراض والحيوانات العاشبة [38-40]. هذه الأدوار من اللجنين ذات قيمة كبيرة لدعم النمو الانتصاب تحت الأرضجيم الصحراءفي الصحراء. في هذه الدراسة ، قدمنا ​​الصورة الكاملة لمسارات التخليق الحيوي للجنين فيجيم الصحراء(الشكل 3) ، حيث يتم تصنيع مونومرات اللجنين حيوياً من فينيل ألانين من خلال سلسلة من التفاعلات الأنزيمية ، بما في ذلك الهيدروكسيل ، والميثيل ، والاختزال ، وعملية البلمرة المؤكسدة. تم الكشف عن الإنزيمات المرتبطة بالتخليق الحيوي للجنين لثلاثة أشكال مركبة بشكل رئيسي في الأوعية الدموية

الأنسجة (p-hydroxyl-phenyl (H) و guaiacyl (G) و syringyl (S) lignin) و 5- hydroxyl-guaiacyl lignin الذي تم تحديده فقط في COMT (حمض الكافيين 3- O-methyltransferase ، EC 2.1.1.68) ناقصة (مثل الخراب) النباتات [41 ، 42].

أمونيا فينيل ألانين (PAL ، EC 4.3.1.24) هو أول إنزيم رئيسي في مسار التخليق الحيوي للجنين (الشكل 3) الذي يحول فينيل ألانين إلى حمض سيناميك عن طريق نزع الأمين غير المؤكسد [43 ، 44]. تم تسلسل ما مجموعه 6297 قراءة PAL وتم تجميع 7 نصوص PAL فيجيم الصحراء(الجدول 5). من خلال مقارنة أوجه التشابه التسلسلي ، وجدنا أن 4 منها (comp {2}} c 1_ seq1 / 2/3/5) لديها أكثر من 95 بالمائة تشابه مع تسلسل mRNA المعروف لـ C. deserticola (gi|289595227|gb|ADD12041.1 |) ، بينما كان لدى comp 28550_ c 1_ seq4 و comp 25940_ c 0_ seq1 77 بالمائة و 82 بالمائة على التوالي. كشفت تنبؤات ORF عن وجود 5 نسخ تحتوي على إمكانات لتشفير البروتينات ومحمولة بمجال لياز الأحماض الأمينية العطرية (PF00221.14). من بينها ، فقط النص المركب 28550_ c 1_ seq4 يمكنه ترميز تسلسل بروتين كامل من 718 من مخلفات الأحماض الأمينية. تم الإبلاغ عن أن PAL تم ترميزه بواسطة عائلة صغيرة متعددة الجينات في معظم أنواع النباتات ، مثل 4 في Arabidopsis thaliana [39 ، 45] ، 5 في Populus trichocarpa [46 ، 47] ، 3 في Scutellaria baicalensis [48] ، و 7 كوكوميس ساتيفوس [43 ، 49] ، إلخ. اقترح تحليلنا للتطور أن هناك 4 جينات ترميز PAL في C.deserticola وقمنا بتسميتها CdPAL1 و CdPAL2 و CdPAL3 و CdPAL4 ، على التوالي (الشكل S2). 4- coumarate-CoA ligase (4CL، EC 6.2.1.12) و trans-cinnamate 4- monooxygenase (CYP73A، EC 1.14.13.11) هما إنزيمان مسؤولان عن تحويل حمض سيناميك إلى p- coumaroyl-CoA في أمرين عكسيين. هم أيضًا في العمود الفقري ، وقيم تعبيرهم FPKM هي 39.57 و 51.93 ، على التوالي.

تم تصنيع أنواع اللجنين الأربعة حيويًا من خلال مسارات مختلفة تم التحكم فيها بواسطة ثلاثة إنزيمات رئيسية ، اختزال سينامويل- CoA (CCR ، EC 1.2.1.44) ، شيكيمات o-hydroxycinnamic- ميثيل ترانسفيراز (HCT ، EC 2.3.1.133) ، وتثبيط {{11) }} هيدروكسيلاز (F5H، EC 1.14.-.-). تم الإبلاغ عن CCR كنقطة تحكم في مسار اللجنين [50 ، 51] الذي حفز X-CoA (X بما في ذلك p- coumaroyl و caffeoyl و feruloyl و 5- hydroxyl-feruloyl و sinapoyl) في Y-aldehyde (Y بما في ذلك p-coumar و caffeoyl و coniferyl و 5- hydroxyl-coniferyl و sinap) ، بينما حفزت HCT p-coumar-oyl-CoA إلى حمض p-coumaroyl shikimic / p-coumaroyl quinic acid. يعمل الإنزيمان ، تمامًا مثل المفتاح ، على تنظيم التخليق الحيوي لـ P-hydroxyl-phenyl lignins أو الأنواع الثلاثة الأخرى من اللجنين.

كان F5H مفتاحًا فرعيًا آخر ينظم syringyl lignin و 5- hydroxyl-guaiacyl lignin. تشمل الإنزيمات المهمة الأخرى حمض الكافيك 3- O-methyltransferase (COMT ، EC 2.1.1.68) ، caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT ، EC 2.1.1.1 0 4) ، وكحول سيناميل ديهيدروجينيز ( CAD ، EC 1.1.1.195) تم التعبير عنها أيضًا. تم سرد معلومات التعبير التفصيلية في الجدول 6. ستوفر جينات الإنزيم المحددة في هذه الدراسة مورداً قيماً للدراسات الجينومية الوظيفية في هذا النبات الطبي المهم. تم اختيار 10 جينات مرتبطة بمسار التخليق الحيوي للجنين في الجدول 6 للتحقق من RT-qPCR لتأكيد نتائج RNA- seq الخاصة بنا (الشكل 4) ، وأشارت ارتباطاتها العالية (معامل ارتباط بيرسون: 0.90343) إلى دقة عالية وإمكانية استنساخ تحليل النسخ. . تسرد مجموعة بيانات S1 تسلسلات التمهيدي المستخدمة في هذا التحليل.

سيستانشله تأثيرات عديدة

ترميز الجينات المرشحة للإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي لـ PhGs

من المعروف أن جليكوسيدات فينيلثانويد (PhGs) هي المكونات النشطة الأساسية فيجيم الصحراءمع أنشطة تحسين القدرة الجنسية ، وإزالة الجذور الحرة ، ومكافحة الشيخوخة [7-10]. ثلاثة مكونات كيميائية من PhGs هي حمض عضوي ، السكريد ، و فينيل إيثانول aglycon (الشكل 3). الحمض العضوي بما في ذلك حمض الكافيك وحمض الفيروليك وحمض الكوماريك هي منتجات من مسار التخليق الحيوي للفينيل بروبانويد. مكونات السكريات بما في ذلك الجلوكوز ورامنوز هي منتجات لمسارات استقلاب الكربوهيدرات ، مثل استقلاب النشا والسكروز والسكر الأميني وأيض سكر النوكليوتيدات ، وأيض الفركتوز والمانوز ، وما إلى ذلك ، ومع ذلك ، فإن مسار التخليق الحيوي لجزء الفينيثانول لم يتضح بعد. هنا ، قدمنا ​​مسارين محتملين للتخليق الحيوي للفينيل إيثانول بناءً على بيانات التسلسل الخاصة بنا. أحدهما هو مسار حمض الكافيك أو مسار حمض الفيروليك ، المعروف أيضًا باسم مسار حمض سيناميك والذي يشبه مسار العمود الفقري للتخليق الحيوي للجنين. يعتمد الآخر على مسار التمثيل الغذائي للفينيل ألانين (الشكل 3) ، حيث يتم الحصول على فينيل ألانين إلى فينيل إيثانول من خلال "مسار Enrlich" المعروف الذي تم العثور عليه لأول مرة في الخميرة منذ قرن مضى وتم التحقق من صحته في زهور البطونية [52 ، 53] ، الطماطم [ 54] ، وارتفعت [55 ، 56]. تم الكشف عن أربعة جينات إنزيمية تقوم بتشفير الأسبارتات / التيروزين أمينوترانسفيراز ، وهستدينولفوسفات أمينوترانسفيراز ، وأوكسيديز الأمين الأولي المسؤولة عن تحويل فينيل ألانين إلى فينيل إيثانول في ساق C. قد يتأكسد منتج فينيل إيثانول بشكل إضافي بواسطة أحادي أوكسيجيناز أو ميثيله بواسطة ميثيل ترانسفيراز إلى مشتقاته (فينيل إيثانول أجليكون) التي شاركت في التخليق الحيوي لـ PhG. باختصار ، تم اقتراح مسارين مفترضين للتخليق الحيوي للفينيل إيثانول aglycon من أجل C.