الجزء 1: فيرباسكوزيد يحمي خلايا البنكرياس ضد الإجهاد

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

أليساندرا جالي 1 بالإضافة إلى باولا مارسياني 1 بالإضافة إلى ألجيرتا ماركو 1 وسيلفيا غيزلانزوني 1 وفيديريكو بيرتوزي 2 ورافايلا روسي 3 وأليسيا دي جيانكاميلو 3 وميشيلا كاستاغنا 1 وكارلا بيريجو 1 ، *

الملخص:

تشير الدلائل الوبائية الجوهرية إلى أن النظام الغذائي الغني بالبوليفينول يحمي من الإصابة بمرض السكري من النوع 2. جليكوسيد الفينيثانويدفيرباسكوسايد / أكتيوسيدوهو مركب نباتي بوليفينوليك واسع الانتشار ، وله العديد من الخصائص البيولوجية بما في ذلك مضادات الأكسدة القوية ، ومضادات التكاثر ، والأنشطة الوقائية للأعصاب. كان الهدف من هذا البحث هو اختبار التأثيرات المحتملة لـفيرباسكوسايدعلى خلايا البنكرياس ، وهو هدف لم يتم اختباره من قبل. تم تحضين الفئران والخلايا البشريةفيرباسكوسايد(0. 8-16 أوم) لمدة تصل إلى خمسة أيام ومجموعة من التقنيات البيوكيميائية والتصوير تم استخدامها لتقييم بقاء الخلية ووظيفتها في ظل الظروف التي تسبب الإجهاد الطبيعي أو الشبكة الإندوبلازمية. وجدنا تأثير وقائي يعتمد على الجرعة منفيرباسكوسايدضد الإجهاد التأكسدي في الخلايا النسيلية والبشرية. كشفت الدراسات الميكانيكية أن البوليفينول يحمي الخلايا من الخلل الوظيفي الناتج عن الإجهاد ER ، مما يعدل تنشيط بروتين كيناز الشبكي الإندوبلازمي كيناز (PERK) من استجابة البروتين غير المطوية ويعزز ديناميكيات الميتوكوندريا. نتيجة لذلك ، تم الكشف عن زيادة الصلاحية ووظيفة الميتوكوندريا ومحتوى الأنسولين في هذه الخلايا. تقدم هذه الدراسات الدليل على ذلكفيرباسكوسايديعزز قدرة الخلايا على التعامل مع إجهاد ER ، وهو عامل مهم في اختلال وظائف الخلايا والفشل في حالات مرض السكري ويدعم الإمكانات العلاجية لـ verbascoside في مرض السكري.

الكلمات الدالة:

فيرباسكوسيد. بوليفينول. الخلايا المنتجة للأنسولين داء السكري؛ الاستعراض الدوري الشامل ؛ الاكسدة؛ الإجهاد ER. بيرك ؛ مضاد للداخل ؛ الميتوكوندريا

1 المقدمة

مرض السكري هو اضطراب مزمن يصيب مئات الملايين من الناس [1]. المسببات المختلفة تميز النوع 1 (T1D) والنوع 2 (T2D) كلاهما يتميز بنقص الأنسولين [2]. ينظم الأنسولين تركيز الجلوكوز في البلازما مما يحفز امتصاص الجلوكوز في خلايا العضلات والدهون وتعديل استقلاب الجلوكوز في الكبد. يعمل توافر المغذيات والهرمونات والمدخلات العصبية على تنظيم إفراز الأنسولين في البنكرياس والحفاظ على تركيزات الجلوكوز في الدم ضمن النطاق الفسيولوجي [3-5]. لذلك فإن خلل الخلية يؤدي إلى مرض السكري الذي يتميز بالصيام بفرط سكر الدم.

T2D هي حالة تقدمية ترتبط فيها مقاومة الأنسولين واختلالات الخلايا معًا ، وقد زادت الأدلة الحديثة الاهتمام بالدور الأساسي الحاسم للخلايا في حالة ارتفاع السكر في الدم [6،7]. في الأشخاص غير المصابين بالسمنة المفرطة ، تعوض الخلايا مقاومة الأنسولين بزيادة إفراز الهرمون. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، مع تدهور ظروفهم ، ينخفض ​​الأنسولين في الدم ويصعد مستوى الجلوكوز إلى ارتفاع السكر في الدم [8،9].

الجلوكوز هو أهم معدل لوظائف الخلية. يؤثر تحفيز الجلوكوز على تنظيم الجينات والتعبير عن البروتينات المشاركة في العديد من وظائف الخلايا مثل تحلل السكر وتخليق الأنسولين وإفرازه [10]. يعتمد إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز على التمثيل الغذائي المؤكسد لإنتاج الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) ويتم إنتاج مستوى منخفض من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، - الخلايا ليست مجهزة جيدًا بالأنزيمات الزبّالة وهذا الضعف يجعلها شديدة التأثر بالإجهاد التأكسدي [11 ، 12]. مع ارتفاع الإجهاد التأكسدي - ينخفض ​​إنتاج الخلايا للأنسولين ، وتنتج الخلايا السيتوكينات التي تشعل تلف الخلايا من خلال التكاثر والاستماتة [13]. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من أن كتلة الخلايا المختزلة قد نُسبت سابقًا إلى موت الخلايا ، فإن الدراسات الحديثة تشير إلى دور رئيسي في إزالة التكاثر الخلوي [14 ، 15]. لقد أصبح من الواضح أن عدة مراحل تقود إلى T2D. تسبب الإهانات الأيضية والأكسدة إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) مما يؤدي إلى انخفاض تخليق الأنسولين وإفرازه ، وتتبع عمليات الذروة إطلاق السيتوكينات وقد يحدث فقد الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج وإزالة التكاثر. هذه المعرفة أساسية من أجل تطوير استراتيجيات العلاج المناسبة ، حيث يمكن مواجهة الإجهاد التأكسدي والتأكسد ، كما أن مرونة خلايا البنكرياس تسمح بإمكانية تحويل الخلايا الجذعية إلى خلايا كما ثبت في الفئران [16].

في الآونة الأخيرة ، أدى تعرض الخلايا للإجهاد التأكسدي بنجاح إلى استخدام مضادات الأكسدة الغذائية للوقاية من مرض السكري [17]. من بين الأطعمة المضادة للأكسدة الأكثر إثارة للاهتمام ، يُعرف زيت الزيتون بخصائصه المفيدة منذ الإغريق القدماء. يحتوي زيت الزيتون على كمية جيدة من الأحماض الدهنية الأحادية غير المشبعة (MUFA) والعديد من مادة البوليفينول مثل التيروزول ، والهيدروكسي إيروسول ، والأوليوروبين ، والفيرباسكوزيد.

فيرباسكوسايد، المعروف أيضًا باسم أكتيوسيد ، هو جليكوسيد فينيليثانويد مستخرج من أوليا أوروبيا ، ونباتات من أنواع فيرباسكوم ، و 23 فصيلة نباتية أخرى [18-20]. يمكن الحصول عليه أيضًا من المنتجات الثانوية لزيت الزيتون (يتم إثرائه بمياه الصرف الصحي لمعاصر الزيتون المشتقة من معالجة ثمار الزيتون) أو يتم إنتاجه من خلال نهج الهندسة الأيضية والبيولوجيا التركيبية [21].

لم يتم الإبلاغ عن أي بيانات حول التوافر البيولوجي فيرباسكوسايد في البشر ، حتى الآن. تشير الدراسات التي أجريت على الفئران وخلايا SKBR3 و Caco -2 إلى أنه قد يكون من الممكن أن يعبر فيرباسكوسايد غير المستقلب الحاجز المعوي ، ويدور في بلازما الدم ، ويمارس تأثير مضادات الأكسدة [20،22،23]. على عكس معظم البوليفينول النباتي ، يعمل فيرباسكوسايد بشكل أساسي على الخلايا من خلال تعديل النسخ الجيني لمجموعة متنوعة من الإنزيمات والعوامل التنظيمية ، مع مضادات الأكسدة ومضادات الإنزيم [24-30].

على الرغم من أن العديد من التأثيرات المفيدة لفيرباسكوسايد على صحة الإنسان معروفة ، إلا أنه لا توجد بيانات حول تأثيره على خلايا البنكرياس. نظرًا لأن الإجهاد التأكسدي والتأكسد هما أساس التسبب في مرض T2D ، فقد بحثنا فيما إذا كان العلاج فيرباسكوزيد قد يحسن قابلية الخلايا و

تعمل في الظروف المسببة للإجهاد ER وقمنا بتمييز الآليات الجزيئية لعملها. تكشف بياناتنا أن فيرباسكوسايد يمنع الإجهاد التأكسدي للخلايا ويؤدي إلى تعديل تنشيط استجابة البروتين غير المطوية وتعزيز ديناميكيات الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى زيادة قابلية الخلية للحياة ومحتوى الأنسولين.

2. المواد والأساليب

2.1. ثقافة الخلايا والمواد

تمت زراعة خلايا Mouse tc3 (قدمها البروفيسور هاناهان - قسم الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا [31]) في وسط RPMI 164 0 (Euroclone SpA، ECB9 0 0 ، Pero MI ، إيطاليا) مكمل بنسبة 10 في المائة (حجم / حجم) مصل عجول الجنين المعطل بالحرارة (Euroclone SpA ، ECS0180L ، Pero MI ، إيطاليا) ، 1 في المائة (v / v) البنسلين الستربتومايسين (EuroClone SpA ، ECB3001D ، Pero MI ، إيطاليا) و 1 في المائة (v / v) L-glutamine (EuroClone SpA ، ECB300D ، Pero MI ، إيطاليا). تم عزل جزر لانجرهانز البشرية في ميلانو (نيجواردا كا غراندا) من متبرعين جثامين متعددين وفقًا للإجراء الذي وصفه ريكوردي وآخرون. [32] ؛ تم تربيتها في وسط استزراع RPMI يحتوي على 5.5 مليمول / لتر جلوكوز ، و 10 بالمائة من مصل بقري جنيني معطل بالحرارة ، و 0.7 ملي مولار جلوتامين ، و 50 وحدة / مل بنسلين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (EuroClone ، SpA ، Pero MI ، إيطاليا). تم استخدام أربع جزر مختلفة ، نقاوة الجزر كانت 80 ± 10 بالمائة. تمت الموافقة على دراسات عزل الجزيرة والجزيرة من قبل لجنة الأخلاقيات بمستشفى Niguarda Ca 'Granda في ميلانو (11.12.2009). عولجت خلايا tc3 بـ 0.8 و 1.6 و 16 ميكرومتر فيرباسكوسايد (كاربوزينث ، OV08034 ، كومبتون ، المملكة المتحدة) ، وحمض كافيك وهيدروكسي إيروسول (هدية كريمة من البروفيسور ديلأجلي ، قسم العلوم الدوائية والجزيئية الحيوية ، يونيفرسيتا ديجلي ستودي دي ميلانو ، ميلانو ، إيطاليا) في وسط RPMI كامل لمدة 5 أيام ، بينما الجزر البشرية مع 16 uM verbascoside. تم استخدام الخلايا المعالجة بالميثانول / الإيثانول كعناصر تحكم. من أجل تحفيز الإجهاد التأكسدي ، عولجت الخلايا بـ H2O2 (Sigma Aldrich ، H1009 ، St. ) لمدة 7 ساعات للحث على إجهاد ER.

2.2. الكشف عن جدوى الخلية عن طريق اختبار MTT

تم طلاء الخلايا في 96 طبقًا متعدد الآبار ، وبعد خمسة أيام من معالجة فيرباسكوسايد ، تم تحضينها بـ 0. 5 مجم / مل MTT (3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل تيازول {{7}) } yl) -2 ، 5- diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich، M5655، St. Louis، MO، USA) لمدة 4 ساعات في جو رطب يحتوي على 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، تم تعليق الخلايا بلطف في 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA ، BK12611S ، Pero MI ، إيطاليا) وتم اكتشاف الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Benchmark ، قارئ الصفيحة الدقيقة ، مختبرات Bio-Rad ، Hercules CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) [33]. أجريت التجارب في ثلاث نسخ وتم التعبير عن البيانات بزيادة أضعاف على عينات التحكم.

2.3 الكشف عن موت الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي

بعد خمسة أيام من الحضانة باستخدام 16 ميكرومتر فيرباسكوسايد ، تم فصل الخلايا عن طريق 7 دقائق حضانة مع التربسين / EDTA ، وتم جمعها وطردها ؛ تم تعليق الحبيبات برفق في أملاح منخفضة من الفوسفات. كانت الخلايا ملطخة بعدد Muse TM وكاشف الجدوى (Millipore ، MCH100102 ، Burlington MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة وتحليلها من خلال قياس التدفق الخلوي. أجريت التجارب في ثلاث نسخ وتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الميتة على الإجمالي.

2.4 جيل ROS

تم تقييم ROS داخل الخلايا باستخدام DCFDA (2 /، 7 / -dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich، D6883، St. تم تحميل خلايا tc3 مسبقًا بـ 15 uM DCFDA في Krebs-Ringer bufer (125 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 1.2 ملي مولار MgSO4 ، 1.2 ملي KH2PO4 ، 25 ملي مولار HEPES-NaOH درجة الحموضة 7.4 و 2 ملي كلوريد الكالسيوم)

تستكمل بـ 11 ملي جلوكوز لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تم الكشف عن محتوى ROS لمدة 30 دقيقة في ظروف القاعدية والضغط مع قارئ الألواح الدقيقة (485/528 نانومتر EX/EM) (Tecan in -nite⑧ F500 ، Tecan Group Ltd. Männedorf ، Switzerland). استندت القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية إلى ثلاث تجارب مستقلة.

2.5 النشاف الغربي

تم جمع خلايا tc3 وحلها في RIPA bufer (15 0 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 50 ملي مولار هيدروكلوريد الهيدروجين 7.6 ، 1 مم EDTA ، 1 بالمائة TERGITOLw NP40 ، 0.5 بالمائة deoxycholate) المضافة مع أبروتينين (Sigma Aldrich ، A4529 ، St. Louis ، MO ، USA) ، PMSF (Sigma Aldrich ، 10837091001 ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومثبطات روش (Sigma Aldrich ، 5892953001 ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تحديد تركيز البروتين بواسطة اختبار برادفورد [35] باستخدام برادفورد ريجنت (سيجما ألدريتش ، B6916 ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تم حل 30 ميكروغرام من البروتينات بنسبة 10 بالمائة SDS-PAGE وتم نقلها إلى أغشية النيتروسليلوز (ميليبور ، بيرلينجتون ماجستير ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعتين في حجب البوفير مع 5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم أو 5 في المائة من محلول مساحة سطح الجسم ؛ تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الأكتين المضاد للفأر - - (Novus International Inc.، NB600501، St. (هدية كريمة من البروفيسور بورجيس نيكا ، معهد علم الأعصاب ، سي إن آر ، ميلان ، إيطاليا) ، مضاد للأرنب ضد HNE (-diagnostic International Inc. ، HNE11S ، سان أنطونيو ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، فأر مضاد لـ HSP70 (Enzo Life Sciences Inc .، C92F3A -5، Farmingdale، NY، USA)، rabbit anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc.، 3033، Danvers، MA، USA)، mouse anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc . ، 4814 ، دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد للفوسفو- NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc. ، 3033 ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد للأرنب NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc. ، 8242 ، Danvers MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد للأغنام SOD1 (Merck ، KGaA ، Darmstadt ، Germania) ، مضاد للأرنب ضد PERK (Cell Signaling Technology Inc. ، 3192 ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد للأرنب ضد eIF2 (تقنية تشوير الخلايا Inc.، 5324، Danvers، MA، USA) و rabbit anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc.، 3597، Danvers، MA، USA). تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP (Dako Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند تخفيف 1: 5000. تم اكتشاف البروتينات باستخدام نظام اكتشاف ECL (Euro-Clone SpA ، Pero MI ، إيطاليا) باستخدام نظام Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH ، Bad Homburg ، ألمانيا) وتم تحديد كثافة النطاق بواسطة برنامج Image Studiow Lite (LI) -COR Biosciences لينكولن ، شمال شرق الولايات المتحدة الأمريكية) [36]. أجريت التجارب في ثلاث نسخ وتم التعبير عن البيانات بزيادة أضعاف على عينات التحكم.

2.6. إمكانات غشاء الميتوكوندريا

تم تحضين خلايا tc3 والجزر البشرية في Langerhans باستخدام 100 نانومتر MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend ، 424803 ، Campoverde Srl ، ميلان ، إيطاليا) أو 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend ، 424805 ، Campoverde Srl ، ميلان ، إيطاليا) لمدة 30 دقيقة عند 37 دقيقة درجة مئوية. تم اكتشاف شدة التألق مع قارئ اللوحات الدقيقة Tecan في nite⑧ F500 (551/576 نانومتر Ex/Em لـ Mitospyw Orange Cmtmros ؛ 490/516 nm ex/em لـ Mitospyw Green) (tecan in nite⑧ f500 ، tecan group. تم تحضين الخلايا بـ 500 ميكرومتر من H O لمدة 20 دقيقة وتم اكتشاف شدة التألق كما هو موضح سابقًا. استندت القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية إلى ثلاث تجارب مختلفة.

2.7. مورفولوجيا وديناميكيات الميتوكوندريا

تم تحميل خلايا tc3 مسبقًا بـ 100 نانومتر MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend ، 424803 ، Campoverde Srl ، ميلان ، إيطاليا) في 11 مللي مولار من الجلوكوز كريبس رينجر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم وضع العينات في غرفة التصوير وتم تصوير الحقول العشوائية باستخدام مرشح رودان من مجهر Axio Observer Z1 (Zeiss ، Oberkochen Germany). لتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا ، تم تحليل المعلمات التالية باستخدام برنامج محلل الجسيمات ImageJ: المنطقة (um2) ، والدائرية (4mArea2 / Perimeter2) والقطر الأقصى لـ Feret (um) [37].

بالنسبة لتجارب الفاصل الزمني ، تم إجراء التصوير أحادي الخلية بمعدل إطار واحد في الثانية لمدة 30 ثانية تحت السيطرة أو ظروف الإجهاد التأكسدي. لقياس المسافة التراكمية للميتوكوندريا (um2) ، تم تصحيح الصور أولاً لتبييض الصور ، ثم تم تحليل مقاطع الفيديو باستخدام Image-Pro Plus Plug-in (تتبع الكائن) (Media Cybernetics ، Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). ما يصل إلى اثني عشر

تم تصوير الخلايا في ثلاث تجارب مستقلة وقدمت البيانات كقيم متوسطة وانحرافات معيارية.

2.8. إفراز الأنسولين

تم زرع بذور لانجرهانز المعزولة بشريًا في 96- صفيحة بئر بكثافة 20 جزيرة لكل بئر ، وبعد 5 أيام من العلاج ، تم قياس محتوى الأنسولين وإفرازه في القاعدية (3.3 ملي مولار من الجلوكوز) وتحفيزها (16.7 ملي مولار من الجلوكوز ) عن طريق مقايسة مناعية ELISA (Mercodia ، 10-1113-01 ، أوبسالا ، السويد).

2.9 تحاليل احصائية

تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism 8. 0 على مكررات بيولوجية مستقلة. تم تقييم الوسائل بين مجموعتين باستخدام اختبار الطالب ذي الذيلتين والقيمة p <0. 05="" تم="" أخذها="" كدليل="" على="" الأهمية="" الإحصائية.="" تمت="" مقارنة="" الوسائل="" بين="" ثلاث="" مجموعات="" أو="" أكثر="" من="" خلال="" تحليل="" التباين="" (anova)="" ،="" متبوعًا="" باختبار="" مقارنة="" متعدد="" (tukey).="" يتم="" الإشارة="" إلى="" الاختبار="" الإحصائي="" المستخدم="" ،="" وقيم="" p="" الدقيقة="" وعدد="" النسخ="" المتماثلة="" (n)="" في="" الأساطير="" الفردية.="" تعرض="" أشرطة="" الخطأ="" في="" الأشكال="" المتوسط="" ​​±="" sd="" أو="" المتوسط="" ​​±="" se="" ،="" كما="" هو="">

3. النتائج

3.1. فيرباسكوزيد يحسن حيوية الخلايا

نظرًا لعدم وجود بيانات عن تأثير verbascoside على الخلايا ، أجرينا اختبار MTT لتقييم صلاحية الخلية وكما هو موضح في الشكل 1 أ ، لوحظ وجود اتجاه إيجابي يعتمد على الجرعة. ومن ثم ، لمزيد من الدراسات ، اخترنا تركيز 16 ميكرومتر الذي أثبت إحصائياً فعاليته في تعزيز قابلية الخلايا للحياة. من خلال قياس التدفق الخلوي درسنا تأثير خمسة أيام من الحضانة للبقاء على قيد الحياة فيرباسكوزيد على الخلية في الظروف القاعدية وبعد 2 {{21} } دقيقة من المعالجة المسبقة بـ 500 ميكرومتر من H2O2. في الحالة القاعدية ، لم يؤثر فيرباسكوسايد على بقاء الخلية ، مما يشير إلى أن قابلية بقاء الخلية المتزايدة التي لوحظت في اختبار MTT قد تكون بسبب تحسن نشاط الميتوكوندريا. في حين أنه بعد التعرض لـ H2O2 ، قلل 16 ميكرومتر من المعالجة المسبقة فيرباسكوسايد بشكل ملحوظ موت الخلايا الناتج عن الإجهاد التأكسدي (الشكل 1 ب ، ج). فيرباسكوسايد هو جزيء معقد يمكن تعديله عن طريق التحلل المائي للأنزيمات [18]. لاختبار ما إذا كانت نواتج فيرباسكوزيد يمكن أن تكون مسؤولة عن التأثير الوقائي الملحوظ ، عولجت خلايا tc3 بهيدروكسي إيروسول وأحماض المقاهي (0.8 و 16 ميكرومتر) لمدة 5 أيام. لم يعزز كلا المستقلبين قابلية بقاء الخلية ، على العكس من ذلك ، تم اكتشاف تأثير سام للخلايا ، أكثر صلة بعد التعرض لـ H O ، لتركيز 16 ميكرومتر (الشكل S1). هذا الاستنتاج يثبت أن فيرباسكوزيد وليس مستقلباته يمارس تأثير وقائي لعلاج H2O2.

3.2 يعدل فيرباسكوسايد توازن الأكسدة والاختزال ويمارس تأثيرًا مضادًا للداخل في الخلايا

لقد تأكدنا أولاً في خلايا tc3 من التأثيرات المضادة للداخل ومضادات الأكسدة من فيرباسكوزيد التي لوحظت في أنواع الخلايا الأخرى [24 ، 29 ، 34]. تم تقييم نشاط الكسح فيرباسكوسايد ROS بخلايا tc3 المسمى بمسبار خلوي قابل للنفاذ من نوع ROS DCFDA (2 / ، 7 / -dichlorofuorescein diacetate). كما هو مبين في الشكل 2 أ ، تم الكشف عن انخفاض كبير في محتوى ROS بعد المعالجة المسبقة فيرباسكوسايد ، سواء في ظل ظروف الإجهاد القاعدية والتأكسدية.

كشفت تحليلات اللطخة الغربية عن انخفاض ملحوظ في علامات الإجهاد التأكسدي acrolein و 4- hydroxynonenal (HNE) في الخلايا المعالجة فيرباسكوسيد. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا زيادة في تعبير ديسموتاز الفائق (SOD1) ، مما يشير إلى أن فيرباسكوزيد يمارس نشاطه المضاد للأكسدة على الأرجح بآليتين مختلفتين ، مباشرة كزاحم ROS وبشكل غير مباشر عن طريق تحفيز التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة (الشكل 2 ب ، ج).

تم تقييم التأثير المضاد للداخل للخلايا فيرباسكوسايد على الخلايا من خلال تقييم تنشيط مسار NFKB ، وهو أهم مسار مؤيد للداخل في هذه الخلايا [38]. من خلال تحليل اللطخة الغربية ، وجدنا تعبيرًا منخفضًا عن مثبط العامل النووي kappa B (IKB) والعامل النووي kappa-light-chain-Enhancer (NFKB) ، وانخفاض ملحوظ في فسفرة NFKB في الخلايا المعالجة مسبقًا ، مما يدعم فرضية فعالية فيرباسكوسايد لتقليل في الخلوية الذخيرة (الشكل 2 د ، ه).

3.3 يقوم فيرباسكوسايد بتعديل استجابة البروتين غير المطوية للخلايا

ثم حللنا بعمق الآلية الجزيئية التي من خلالها يمارس فيرباسكوسايد أدوارًا مضادة للأكسدة ومضادة للداخل ، مع التركيز على الشبكة الإندوبلازمية التي تظهر كمستشعر رئيسي لإشارات التمثيل الغذائي والتوتر في الخلايا. في ظل ظروف الإجهاد ، تصنع العضية استجابة متجانسة ، تُعرف باسم استجابة البروتين غير المطوية (UPR) ، والتي تهدف إلى استعادة وظيفة ER ؛ ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط لهذا المسار يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج [39 ، 40].

علامات زيادة إجهاد ER هي تنظيم بروتينات المرافقين وتفعيل استجابة UPR. كشف تحليل النشاف الغربي للخلايا المعالجة باستخدام فيرباسكوسايد عن انخفاض مستويات بروتين الصدمة الحرارية 70 (HSP70) وبروتين الغلوبولين المناعي الملزم (الشكل 3 أ ، ب). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن انخفاض كبير في تعبير ER كيناز (PERK) الذي يشبه بروتين كيناز RNA وخفض الفسفرة في ناقلته النهائية ، عامل بدء الترجمة حقيقية النواة 2 (eIF2).

انقر هنا للجزء 2