الجزء 2: كالباستاتين يمنع إصابة أنجيوتنسين بوساطة من خلال صيانة الالتهام الذاتي

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

الرجاء النقر هنا للجزء 1

الرجاء النقر هنا للجزء 3

ينشط Angel plus HSD نشاط calpain في خلايا الأقدام التي تساهم في حصار الالتهام الذاتي

نظرًا لأنه تم العثور على نشاط calpain (1) ليتم تنشيطه بواسطة Angel في العديد من أنواع الخلايا و (2) لتقسيم العديد من البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي ، فقد تساءلنا عما إذا كان حصار الالتهام الذاتي الذي يتم إجراؤه بواسطة AngII plus HSD يمكن أن يعزى إلى زيادة نشاط calpain الناجم عن Angl. وجدنا أولاً أن الخلايا البودوسية الأولية عبرت عن الأشكال الثلاثة المنتشرة في كل مكان من الكالب (الشكل 3 أ). أظهرنا بعد ذلك أن AngII يحفز نشاط الكالبين في الخلايا الأولية. تم حظر هذا الارتفاع في نشاط calpain بواسطة مثبط الكالبيين الانتقائي (الشكل 3 ب). استخدمنا فأرًا مع تعبير إضافي عن الجينات المعدلة للكالباستاتين (مما يؤدي إلى انخفاض نشاط الكالباينات) لتقييم دور الكالب في AngII بالإضافة إلى HSD بوساطةالكلىإصابةوحصار البلعمة الذاتية. أظهرت الخلايا البودوسيتية الأولية من الفئران CST'g انخفاضًا في نشاط calpain استجابةً لـ AngII عند مقارنتها بالخلايا البودوسية من الفئران الضابطة (الشكل 3 ج). وهكذا ، فإن الإفراط في التعبير عن كالباستاتين في الخلايا البودوسية قلل من تنشيط الكالب بوساطة AngII.

سيستانشتوبولوسالديه الكثيرتأثيراتانقر هنا لمعرفة المزيد

قمنا بعد ذلك بتقييم مستويات الالتهام الذاتي في الخلايا البودوسية من الفئران CSTTg. أنشأنا الفئران CST باستخدام التحوير GFP-LC3. سمح مراسل LC 3- GFP بإحصاء autophagosomes كـ GFP plus / P62 plus dots. سوف يتراكم P62 في مجاميع في الخلايا عندما يتم حظر التدفق الذاتي. في الحالة القاعدية ، قمنا بحساب عدد أقل من GFP بالإضافة إلى P62 بالإضافة إلى النقاط (الشكل 4 أ ، ب ، هـ) وأقل تراكمًا لـ P62 (الشكل 4 ج ، د ، و) في خلايا بودوسيت من الفئران CST1g GFP-LC3 مقارنة بالخلايا البودوسيتية العادية

الشكل 4|تقييم التدفق الذاتي في الخلايا البادئة لفئران كالباستاتين المعدلة وراثيا (CST9). (أ ، ب) صور التألق المناعي التمثيلية للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (الأخضر) و P62 (الأحمر) في الكبيبات من الفئران 12- GFP-LC3 و CST'GFP-LC3 القديمة. تشير رؤوس الأسهم إلى GFP بالإضافة إلى P62 بالإضافة إلى autophagosomes. (ج ، د) صور مناعية تمثيلية للتعبير عن P62 (أخضر) و Podocalyxin (PODXL ؛ أحمر) في الكبيبات من الفئران 12- GFP-LC3 و CST'9 GFP-LC3 القديمة. تشير الأجزاء الفرعية ذات الشكل الأولي إلى نسبة تكبير أعلى. كانت النوى ملطخة بـ Hoechst （blue） .Bars=50 ميكرومتر. （ه） التحديد الكمي لعدد LC3 زائد P62 زائد النقاط لكل خلية بودوسيت. اختبار مان ويتني: ** P =0. 0065. (و) التحديد الكمي لمنطقة P62 plus لكل قسم كبيبي. اختبار مان ويتني: * P=0. 0420.In (e، f)، n =5 GFP-LC3 الفئران و n =8 CST'9 GFP-LC3 الفئران. تم تقديم القيم كمؤامرات فردية ويعني ± SEM. لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على الإصدار عبر الإنترنت من هذه المقالة على الفئران GFP-LC3 ، مما يشير إلى زيادة التدفق الذاتي في خلايا بودوسيت الفئران ذات الوفرة العالية من كالباستاتين.

يمكن مراقبة تدفق البلعمة عن طريق قياس تحويل الشكل السيتوبلازمي لـ LC3 ، LC 3- I ، إلى الشكل الذاتي المشقوق والفوسفاتيد إيثانول أمين LC3 ، LC 3- II ، على اللطخة الغربية . أظهرت خلايا بودوسيت من فئران CST زيادة تحويل LC 3- I إلى LC 3- II وانخفاض تعبير P62 ، في كل من وجود وغياب bafilomycin A ، (الشكل 5 أ و ب) ، مما يشير إلى زيادة التدفق الذاتي في podocytes مع الإفراط في التعبير عن calpastatin. أخيرًا ، كان تراكم نقاط GFP plus P62 plus في خلايا podocytes بعد إعطاء الكلوروكين أكثر أهمية في الفئران CST'g GFP-LC3 مقارنة بالفئران GFP-LC3 ، مما يؤكد أن الإفراط في التعبير عن كالباستاتين في دبابيس التدفق الذاتي في خلايا podocytes في الجسم الحي (الشكل 5 ج) -e). إجمالاً ، تشير بياناتنا إلى أن AngII يحفز نشاط الكالبايت في خلايا الأقدام ، وأن الالتهام الذاتي يتم تثبيطه عن طريق الكالبي في خلايا الأقدام ، وأن تثبيط نشاط الكالباينات الداخلي عن طريق الإفراط في التعبير عن كالباستاتين كافٍ لتحفيز التدفق الذاتي في الخلايا البودوسية.

الفئران CSTT9 محمية من إصابة خلية البودوسيت التي يسببها إنجيل بالإضافة إلى HSD

CSTT: الفئران لم تظهر أي شيءالكلىالتغيير حتى عمر 12 شهرًا على الأقل (الشكل التكميلي S5). قمنا بتحليل إصابة خلايا البودوسيت في الفئران CST 'أثناء علاج AngII بالإضافة إلى HSD. على الرغم من إصابة فئران WT بتصلب كبيبات خفيف وإصابة بكريات القدم بعد 4 أسابيع من ارتفاع ضغط الدم ، كما يتضح من التعبير غير الطبيعي عن podocalyxin و nephrin ، فإن الفئران CSTTg قدمت عددًا أقل من الآفات الكبيبية المتصلبة (الشكل 6 أ)

شكل 5|أكد منع تدهور البلعوم الذاتي زيادة تدفق البلعوم الذاتي في الفئران المعدلة وراثيا كالباستاتين (CSTT). (أ) تحليل لطخة غربية للتعبير عن LC3. Sequestosome 1 (SOSTM1) / P62 و ATG5 في الخلايا البدائية الأولية من النوع البري (الفئران W أو CST'9. يعمل تعبير Tubulin كتطبيع. تمت معالجة خلايا Podocytes أو لم تعالج باستخدام bafilomycin A1 (BafA1 ؛ 100 نانومتر) لمدة 4 ساعات قبل الثقافة القبض. (ب) القياس الكمي لـ LC 3- ll / 'tubulin و P62 / tubulin ratios.n=10 الفئران WT و n =8 CST'9 الفئران. يتم تقديم القيم كمخططات فردية و يعني ± SEM. تحليل ثنائي الاتجاه للتباين المقترن للعلاج: من أجل LC 3- ll / tubulin: genotype، P=0. 0008؛ treatment، P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">الكلى-international.org.

الشكل 6|يمنع الإفراط في التعبير عن كالباستاتين أنجيوتنسين إيل (أنجيل) بالإضافة إلى نظام غذائي عالي الملح (HSD) بوساطة إصابة خلايا البودوسيت. (أ ، ب)

سيستانشيمكن أن يخففمرض كلوي

صور تمثيلية لأقسام ماسون الملطخة بثلاث ألوان من الكبيبات من الفئران من النوع البري (WT و calpastatin Transgenic (CST'9) بعد 6 أسابيع من Angll plus HSD.Bars =50 um. (c ، d ، f ، g) صور مناعية تمثيلية للتعبير عن (c ، d) Podocalyxin (PODXL) و (f ، g) nephrin (NPHS1) في WT و CST'9mice بعد 6 أسابيع من Angel plus HSD و (e ، h) الكميات المرتبطة. {8}} أم. (2)

cistancheيمكن أن يعالجفشل كلوي حاد

صور التألق المناعي التمثيلية للتعبير عن ورم ويلم 1 (WT1 ؛ أخضر) و PODXL (أحمر) في الكبيبات من WT و CST'mice بعد 6 أسابيع من Angel plus HSD و (k) الكمي المرتبط بعدد خلايا WT1 plus لكل كُبيبي الجزء. كانت النوى ملطخة بـ Hoechst (أزرق). أشرطة =50 أم. في (e ، h ، k) ، يتم تقديم القيم كمخططات فردية ومتوسط ​​± SEM و n =9 الفئران WT و n =7 CSTTg الفئران. =0. 0095 in (e)، * P =0. 0249 in (h)، P =0. 7891 in (k).

و ب) وتعبير بودوكاليكسين ونيفرين المحفوظ (الشكل 6 ج-ح). وقد لوحظت مثل هذه الاختلافات في النمط الظاهري للخلية البودوسية في مرحلة لم تكن فيها كثافة نوى خلية البودوسيت مختلفة بين الفئران WT وفئران CST'g ذات ضغط الدم المرتفع (الشكل 6i-k).

وبالمثل ، بعد 6 أسابيع من ارتفاع ضغط الدم ، قدمت الفئران GFP-LC3 و CST'1 GFP-LC3 إصابة خلية البودوسيت لكن الآفات كانت أكثر بروزًا في الفئران GFP-LC3 (الشكل 7). كانت نسبة الألبومين البولي إلى الكرياتينين أعلى في الفئران GFP-LC3 بعد 4 أسابيع من AnglI plus HSD (الشكل 7 أ). لم يكن عدد Podocyte مختلفًا بين الأنماط الجينية 2 ، ولكن تعبير nephrin انخفض بشكل ملحوظ في الفئران GFP-LC3 (التحكم) (الشكل 7 ب-هـ). بالاقتران مع الحماية بوساطة كالباستاتين ، أظهر تحليل البنية التحتية إضعافًا خفيفًا وبؤريًا لعملية قدم خلية البودوسيت في الفئران GFP-LC3 التي عولجت بـ Angl plus HSD مع الحفاظ بشكل أفضل على إضعاف عملية القدم في الفئران CST'g ، على الرغم من القياس الكمي العالمي لعدد لم تكن عمليات القدم لكل طول غشاء قاعدي كبيبي (GBM) مختلفة إحصائيًا ، على الأرجح لأن إصابة الخلية البؤرية هي بؤرية وقطعية في نموذجنا (الشكل 7f-h). من الجدير بالذكر أن الضامة وتسلل الخلايا اللمفاوية التائية فيالكلىلم تكن مختلفة بين المجموعات (الشكل التكميلي S6). مجتمعة ، أظهرت هذه النتائج أن الكالباستاتين منع إصابة AngII بالإضافة إلى HSD الناجم عن إصابة خلايا podocyte.

يعيد الإفراط في التعبير عن كالباستاتين التدفق التلقائي في الخلايا البودوسية من الفئران بعد علاج Angel plus HSD

أخيرًا ، تساءلنا عما إذا كانت الحماية الكبيبية بوساطة كالباستاتين في نموذج AngII plus HSD قد تورطت في صيانة الالتهام الذاتي في خلايا podocytes. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم منع تراكم P62 الناجم عن AnglI plus HSD في خلايا podocytes في الفئران CSTTg و GFP-LC3 CST'g (الشكل 8 أ-د) ، مما يشير إلى أن كالباستاتين منع الحصار المفروض على البلعمة الذاتية البودوسيت. من الجدير بالملاحظة أن عدد GFP بالإضافة إلى P62 بالإضافة إلى وضع العلامات على phagosomes التلقائي كان مشابهًا في خلايا podocytes من الفئران GFP-LC3 و GFP-LC3 CST ذات الضغط العالي ، مما يشير إلى أن AnglI بالإضافة إلى HSD تسبب في تباطؤ تدفق البلعمة الذاتية بدلاً من توقف كامل. (الشكل 8e-g).

في التنبؤ بالسيليكو لموقع انشقاق الكالبين في بروتينات الخلية

استخدمنا العديد من أدوات السيليكو للتنبؤ بأهداف الكالب المحتملة في الخلايا البودوسية (الجداول التكميلية S1 و S2). تمت مقارنة ثلاث قواعد بيانات على الإنترنت: GPS-CCD و 4CaMPDB و 5 و DeepCalpain. درجة في تحليل السيليكو حددت العديد من بروتينات البودوسيت ، النيفرين والبودوسين فيما بينها ، والتي يمكن شقها بواسطة calpains. وبالتالي ، يمكن ربط الحماية الكبيبية بوساطة كالباستاتين بتقليل النشاط الأنزيمي لكالبين ، مما يؤدي إلى تقليل تحلل بعض بروتينات الخلايا البودوسية.

علاوة على ذلك ، ما لا يقل عن 3 بروتينات مرتبطة بالتهمة الذاتية هي أهداف مباشرة للكالب. يتم شق ATG5 بواسطة calpains ، مما يؤدي إلى حدوث اضطراب في تكوين ATG5 المركب 12- ATG5. كما أدى استخدام مثبطات الكالبيين في الجسم الحي إلى منع انقسام بروتين الالتهام الذاتي Beclin -1. 5 "في التحليل السليكي لـ يدعم موقع الانقسام المفترض على البروتينات المرتبطة بالتهمة الذاتية الفرضية القائلة بأن الكالبين يمكن أن ينظم الالتهام الذاتي من خلال الانقسام الأنزيمي لبروتينات الالتهام الذاتي.

تعبير mRNA عن الشبكة الإندوبلازمية (ER) وعلامات الإجهاد التأكسدي في الكبيبات المأخوذة من الفئران المعالجة بـ Angll plus HSD

قمنا بتقييم إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) والإجهاد التأكسدي بواسطة PCR الكمي في الكبيبات أثناء علاج AngII plus HSD (الجدول 1). في الأساس ، لم نلاحظ أي تغيير في تعبير mRNA للجينات التي تم تحليلها في الفئران glomeruli5loxlox (تكميلي من WT و Nphs2.cre Atg5 الشكل S7). بعد 6 أسابيع من ارتفاع ضغط الدم ، ظهرت الكبيبات من Nphs2. أظهرت الفئران cre Atg5loxlox ملامح مختلفة من الرنا المرسال لجينات الإجهاد ER ومسارات الإجهاد التأكسدي مع زيادة التعبير عن Sod1 و Prdxl و Atf4 و Gpxl و Hsp90b1 مقارنةً بكبيبات WT ، مما يشير إلى أن استنفاد الالتهام الذاتي في الخلايا البودوسية فضل AngII بالإضافة إلى HSD الناجم عن إجهاد ER والإجهاد التأكسدي. على العكس من ذلك ، قدمت الكبيبات من فئران CST تقليلًا في تنظيم العديد من جينات الإجهاد ER ومسارات الإجهاد التأكسدي بالإضافة إلى انخفاض التعبير عن بعض الجينات المؤيدة للاستماتة (الشكل 9).

مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن الإفراط في التعبير عن الكالباستاتين يمكن أن يمنع الإصابة الكبيبية عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي الناتج عن AngII plus HSD.

نقاش

في هذه الدراسة ، أوضحنا أنه في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن AngII بالإضافة إلى HSD ، يتم تقليل البلعمة الذاتية لخلايا البودوسيت بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، كانت الفئران ذات الحذف الخاص بخلايا البودوسيت لـ Atg5 أكثر عرضة للإصابة بـ AngI بالإضافة إلى HSD الناجم عن تصلب الكبيبات وفقدان الخلايا البودوسيتية ، مما يدل على أن الالتهام الذاتي في الخلايا البودوسية يمنع تطور اعتلال الكلية الناتج عن ارتفاع ضغط الدم ، مما يبرز الدور الحاسم للالتهام الذاتي في Angl بالإضافة إلى HSD الناجم عن podocyte إصابة. لا يُعرف سوى القليل عن المحفزات خارج الخلية التي تنظم الالتهام الذاتي الخلوي ، وهذه النتائج تلقي الضوء على التنظيم الفيزيولوجي المرضي للالتهام الذاتي للخلية بواسطة AngII.

في معظم حالات اعتلال الكبيبات البشرية ، يعتبر إمحاح عملية القدم الكبيبية سمة مميزة لإصابة الكبيبات التي تؤدي إلى بيلة بروتينية. من المحتمل أن يلعب الالتهام الذاتي دورًا أساسيًا في الحفاظ على وظيفة الخلايا البودوسية لأن هذه الخلايا المتمايزة نهائيًا تعرض معدلات عالية من الالتهام الذاتي حتى في حالة عدم وجود إجهاد. أظهرت دراسة سابقة أن الالتهام الذاتي لـ Angi pro-motes من خلال توليد أنواع من الأكسجين التفاعلي في خط خلايا خلية بادوسية مورين خالدة مشروطًا. النتائج غير واضحة. على عكس هذه الدراسة الأخيرة ، استخدمنا خلايا الفئران الأولية المستزرعة التي تحتفظ ببودوسين وتعبير النيفرين وفي نُهج الجسم الحي وليس خطوط الخلايا الفأرية. نحن نؤكد التقارير السابقة التي تشير إلى أن الخلايا البادئة بعد التقلص تظهر مستوى عالٍ بشكل غير عادي من الالتهام الذاتي التأسيسي. قياس الكمية المتزايدة من LC 3- II بعد تحفيز AngII في وجود أو عدم وجود مثبطات الليزوزومات ضروري لتحديد

ما إذا كان التدفق التلقائي يزداد أو يتم حظره. لقد أهملت الدراسات السابقة هذه الظاهرة.

هنا ، استخدمنا نموذجًا لارتفاع ضغط الدم يعتمد على نضح AnglI و HSD. تُظهر خلايا Podocytes مستقبلات ATI وتتعرض للببتيدات المفلترة المجانية مثل AngII1،6،26 ، 61-6 من المفترض أن التأثيرات الواقية للكلية المرصودة لتثبيط RAAS يمكن - جزئيًا على الأقل - بسبب الحصار المفروض على هذه الخلية البودوسية - RAAS محدد. وبالمثل ، في الدراسات المجراة

سيستانشيمكن أن يخففمرض كلوي