جزء Ⅰ القيمة المساعدة من Herba Cistanches عند استخدامها مع الستاتين في نماذج المورين

إيلين وات ، وتشون فاي نغ ، وتشي مان كون ، وتشينج زانج ، وسي جاو ، وبريان توملينسون ، وكلارا بيك سان لاو

1 معهد الطب الصيني ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ.

2 مختبر مفتاح الولاية للكيمياء النباتية والموارد النباتية في غرب الصين ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ.

3 قسم الصيدلة السريرية ، قسم الطب والعلاج ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ. ساهم إيلين وات وتشون فاي نج بالتساوي في هذا العمل. يجب توجيه المراسلات وطلبات المواد إلى CBSL (البريد الإلكتروني: claralau@cuhk.edu.hk)

لمزيد من المعلومات: emily.li@wecistanche.com

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات حول Cistanche

الملخص

من المعروف أن العقاقير المخفضة للكوليسترول تعاني من مشاكل تسمم العضلات.هيرباسيستانش(HC) هو عشب صيني يستخدم تقليديا للألم في الخاصرة والركبتين. اقترحت دراستنا السابقة في المختبر أنه يمكن أن يحمي من سمية العضلات التي يسببها الستاتين. ومع ذلك ، فإنه لم يتم التحقيق في تأثير وقائي في الجسم الحي. كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كان المستخلص المائي منهيرباسيستانش(HCE) يمكن أن يمنع سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين في الفئران وما إذا كان Herba Cistanche E يمكن أن يكون له أيضًا آثار مفيدة في تقليل فرط كوليسترول الدم الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون وارتفاع نسبة الكوليسترول في الكبد ، وبالتالي تقليل جرعة سيمفاستاتين عند استخدامه في العلاج المشترك. من نتائجنا ، استعاد Herba Cistanche E بشكل كبير التخفيض الناجم عن سيمفاستاتين في أوزان العضلات وخفض ارتفاع كرياتين كيناز البلازما في الفئران.هيرباسيستانشكما حسّن E أيضًا من انخفاض مستويات الجلوتاثيون في العضلات الناجم عن سيمفاستاتين ، وإمكانية غشاء الميتوكوندريا العضلي ، وتقليل التهاب العضلات الناجم عن سيمفاستاتين. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي HCE إلى خفض وزن الكبد ، ومستويات الدهون الكلية في الكبد ، ومستويات الدهون في البلازما في الفئران التي تتغذى على نسبة عالية من الدهون. في الختام ، قدمت دراستنا في الجسم الحي أدلة على أنهيربا سيستانشE له تأثيرات وقائية محتملة على السمية التي يسببها سيمفاستاتين في العضلات ، وأيضًا تأثيرات مفيدة على الكبد الدهني غير الكحولي الناتج عن النظام الغذائي وفرط شحميات الدم عند استخدامه بمفرده أو بالاشتراك مع سيمفاستاتين بجرعة مخفضة.

تم توثيق مثبطات اختزال HMG-CoA ، والمعروفة أيضًا باسم الستاتين ، جيدًا لتكون مفيدة لمرضى فرط كوليسترول الدم الذين يعانون من مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية المتوسطة والعالية. تعمل الستاتينات ، وهي إحدى فئات العقاقير الطبية الأكثر مبيعًا في العالم ، عن طريق تثبيط اختزال HMG-CoA إلى حمض الميفالونيك خلال المرحلة المبكرة من مسار الميفالونات لتقليل تخليق الكوليسترول الداخلي 2 ، 3. على الرغم من أن الستاتين عادة ما يتم تحمله جيدًا ، أحد أهم وأشهر الآثار العكسية السريرية هو تشوهات العضلات الهيكلية ، والتي يمكن أن تتراوح من ألم عضلي حميد إلى اعتلال عضلي شديد 4 ، 5. في دراسة استقصائية كبيرة أجريت على 10409 شخصًا فرنسيًا من خلال مقابلة هاتفية ، 10 بالمائة من المرضى يتلقون أبلغ علاج الستاتين عن أعراض عضلية ، أدى منها 30 في المائة من هؤلاء المرضى الذين يعانون من الأعراض إلى توقف العلاج 6. قدمت فرقة العمل المعنية بسلامة الستاتين التابعة لجمعية الدهون الوطنية توصيات لإدارة الأعراض المرتبطة بالعضلات لدى المرضى الذين يخضعون للعلاج بالعقاقير المخفضة للكوليسترول. بشكل عام ، يُنصح في المرضى الذين يعانون من أعراض شديدة مثل ارتفاع الكرياتين كيناز (CK) بأكثر من 5 × ULN ، يجب حجب الستاتين ، حتى يتم تطبيع مستوى CK مرة أخرى. نتيجة لحدوث هذه الآثار الجانبية ، وعدم وجود علاج فعال لتسمم العضلات الناجم عن الستاتين ، هناك بالتالي دافع للبحث عن علاجات جديدة لإدارة مشاكل العضلات التي يسببها الستاتين.

في حين تم اقتراح مجموعة متنوعة من الآليات والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن الآثار الضارة للعقاقير المخفضة للكوليسترول ، يُعتقد أن آليات الميتوكوندريا متورطة في التأثيرات الضارة لسمية العضلات للستاتين 1. ميفالونات ليس مجرد مادة كوليسترول ، ولكنه أيضًا مقدمة لمركبات مهمة ، مثل بروتينات السيلينو ، والدوليكول ، والأوبيكوينون 7 ، 8. يمكن أن يقلل الستاتين من تنظيم بروتين السلين مثل الجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx) ، مما يضر بكثافة مضادات الأكسدة ويساهم في التأثير المعاكس لها. efects4. يمكن أن تؤدي الستاتينات أيضًا إلى استنفاد يوبيكوينون ، مما يؤدي إلى انخفاض استهلاك الأكسجين وتخليق ATP. علاوة على ذلك ، أظهرت زيادة الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي أن الستاتين يمكن أن يعمل أيضًا بشكل مباشر على ميتوكوندريا الأنسجة مما يتسبب في زيادة أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) والإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا وبالتالي المساهمة في إصابة الكبد والعضلات.

هيرباسيستانش، كامل النبات المجففسيستانشالصحراءYC Ma (عائلة Orobanchaceae) ، هي نباتات طفيلية تنمو في الغالب في المناطق الصحراوية في شمال وشمال شرق الصين. وفقًا لنظرية الطب الصيني ، تتمتع Herba Cistanches بمذاق حلو ودافئ ومالح. إنه عشب منشط صيني ينشط اليانغ ويستخدم في المقام الأول لعلاج نقص الكلى مع أعراض مثل العجز الجنسي والعقم وسرعة القذف. وهو أيضًا عشب صيني يوصف تقليديًا للمرضى لألم في الحقير والركبتين ويشيع استخدامه في التركيبات الصينية لعلاج مشاكل العضلات 12 ، 14. ومن المثير للاهتمام أن هذا أيضًا يتوافق مع الدراسات العلمية الحديثة التي أظهرت مضادات - أنشطة التعب من مستخلص Herba Cistanches الغني بالعديد السكاريد والغني بالفينيلثانويد في الفئران بعد التمرين عن طريق تقليل تلف العضلات وتحسين تخزين ATP. إلى جانب ذلك ، أظهر العمل الأخير أن مستخلص الميثانول من Herba Cistanches يمكن أن يعزز جيل ATP في الميتوكوندريا.هيرباسيستانشثبت أيضًا أنه مضاد قوي للأكسدة وكاسح للجذور الحرة في أعضاء مختلفة ، مما يقلل من الإجهاد التأكسدي وأنشطة ROS في دراسات الجسم الحي 17 ، 18. في دراسة حديثة أجراها مختبرنا ، أظهرنا أنهيرباسيستانشمنع المستخلص المائي بشكل كبير من السمية التي يسببها سيمفاستاتين في خلايا العضلات الهيكلية L6 ، بالإضافة إلى تقليل إنتاج سيمفاستاتين المستعاد بشكل يعتمد على الجرعة في إنتاج ATP في خلايا L6 ، مما يشير إلى إمكاناتهيرباسيستانشالمستخلص المائي في الحماية من سمية العضلات التي يسببها الستاتين 19. ومع ذلك ، فإن الأدلة في الجسم الحي غير متوفرة.

ومن ثم ، افترضنا ذلكهيرباسيستانشيمكن أن يكون للمستخلص المائي (HCE) آثار مفيدة على سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين. وبالتالي ، هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ما إذا كان استخدام HCE يمكن أن يقلل من سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين باستخدام نموذج حيواني في الجسم الحي ، وبالإضافة إلى ذلك ، ما إذا كان HCE يمكن أن يكون له أيضًا تأثيرات مفيدة على تقليل فرط كوليسترول الدم الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون وارتفاع نسبة الكوليسترول في الكبد. ، وبالتالي تقليل جرعة سيمفاستاتين المستخدمة.

المواد والأساليب

توثيق واستخراج المواد العشبية.

المواد العشبية الخامهيرباسيستانش(Cistanche deserticola ، مصدره منغوليا الداخلية) تم شراؤه من Zi Xin ، مورد مشهور في قوانغتشو ، الصين. تم توثيق Herba Cistanches كيميائيًا باستخدام كروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة والكروماتوجرافيا السائلة فائقة الأداء وفقًا لدستور الأدوية الصيني 201013 كما هو موضح سابقًا ، معفيرباسكوسايدوإشنكوسايد(تم شراؤها من المعهد الوطني لمراقبة المنتجات الصيدلانية والبيولوجية ، الصين) كعلامات كيميائية. بناء على المصادقة الكيميائية ، عينة قسيمة المعشبةهيرباسيستانشتم إيداعه في متحف معهد الطب الصيني بالجامعة الصينية بهونج كونج ، برقم عينة القسيمة 2014-3434.

هيرباسيستانشتم تحضير المستخلص المائي كما هو موضح سابقًا. باختصار ، تم نقع 1 كجم من العشب الخام لمدة ساعة واحدة ، ثم الاستخلاص مرتين بالتسخين لمدة ساعة واحدة تحت التكثيف الراجع عند 100 درجة باستخدام الماء المقطر 10x. تم بعد ذلك دمج المستخلصات المائية (HCE) وترشيحها ، وتم تركيز ناتج الترشيح تحت ضغط منخفض عند 60 درجة. تم تجفيف المستخلص المركز بالتجميد حتى يجف. كانت النسبة المئوية للإنتاج 50.1 بالمائة وزن / وزن. تم تعبئة المسحوق المستخرج بالكامل وتخزينه حتى الاستخدام.

حيوانات تجريبية.

تم شراء Simvastatin من SR Pharmasolutions Ltd. تم توفير الفئران الذكور Sprague Dawley (180-200 جم) وفئران C57Bl / 6J الذكور (عمرها 8- أسبوعًا) من قبل مركز خدمات حيوانات المختبر ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ. تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة هونغ كونغ الصينية (المرجع رقم 12/074 / MIS). تم تنفيذ جميع الأساليب التجريبية من خلال المبادئ التوجيهية المعتمدة التي حددتها لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة للجامعة الصينية في هونغ كونغ. تم إيواء جميع الفئران (3 حيوانات في القفص) والفئران (5 حيوانات لكل قفص) في أقفاص عادية عادية عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 21 درجة مع 12- دورة مظلمة فاتحة. كل قفص قياسي يحتوي على أسبن كمادة للفراش. سمح لجميع الحيوانات بالحصول على الغذاء والماء.

دراسة سمية العضلات التي يسببها الستاتين في الفئران.

تم تقسيم جميع الفئران بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات (ن =5 - 1 0). كانت جميع الحيوانات تتبع نظامًا غذائيًا عاديًا. تم إعطاؤهم أيضًا الماء المقطر أو سيمفاستاتين يوميًا ، مع أو بدون علاج HCE داخل المعدة. بالنسبة للحيوانات المطلوب إعطاؤها كل من سيمفاستاتين و HCE ، تم إعطاء HCE بعد 3 ساعات من تناول سيمفاستاتين لمنع أي تفاعل كيميائي مباشر بين الأعشاب والعقاقير. تمت إذابة مستخلص الأعشاب تي أو سيمفاستاتين في 0.5 في المائة ميثيل سلولوز في ماء مقطر بتركيز معروف. تم إعطاء حجم محسوب مسبقًا داخل المعدة لكل حيوان وفقًا لوزن الفرد بحيث يحتوي الحجم المحسوب على مقدار الجرعة المقترحة المطلوبة. تفاصيل هذه المجموعات هي كما يلي:

المجموعة أ) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى الماء المقطر (مجموعة التحكم العادية)

المجموعة ب) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى سيمفاستاتين (640 مجم / كجم)

المجموعة ج) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى سيمفاستاتين (640 مجم / كجم) بالإضافة إلى جرعة منخفضة من HCE (1.1 جم / كجم من الحيوانات)

المجموعة د) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى سيمفاستاتين (640 مجم / كجم) بالإضافة إلى جرعة عالية من HCE (2.2 جم / كجم من الحيوانات)

المجموعة هـ) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى جرعة عالية من HCE (2.2 جم / كجم من الحيوانات)

تم تسجيل تناول الطعام يومياً وقياس وزن الجسم مرتين أسبوعياً. تم إعطاء العلاج لمدة 4 أسابيع. بعد ذلك تم تخدير الحيوانات باستخدام خليط من الكيتامين (100 مجم / كجم) وزيلازين (10 مجم / كجم) داخل الصفاق. تم سحب الدم عن طريق ثقب في القلب وسمح له بالتجلط. تم بعد ذلك فصل البلازما بالطرد المركزي (3 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق). تم استئصال وتخزين عضلات مختلفة (عضلات الفخذ ، عضلات الساق ، النعل ، الظنبوب الأمامي ، والعضلات الباسطة) عند درجة -80 درجة حتى التحليل.

قياس الكرياتينين في البلازما. تم تحديد نشاط كيناز كرياتين البلازما (CK) باستخدام مجموعة Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430 ، مختبر ستانبيو ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

قياس الجلوتاثيون بيروكسيديز في العضلات. تم قياس جلوتاثيون بيروكسيديز العضلي (GPx) باستخدام المجموعة المتاحة تجاريًا (703102 ، كايمان كيميكال ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم شطف أنسجة العضلات بـ PBS عند درجة الحموضة 7.4 لإزالة أي خلايا دم حمراء ، وتم تجانسها في محلول تحلل بارد 5-10 مل ، وبعد ذلك تم طرد المجانسة عند 10 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات. ثم تمت إزالة المادة الطافية ومعايرتها لنشاط GPx باستخدام المجموعة التجارية.

تحضير الكسور العضلية الميتوكوندريا والخلوي. تم تحضير كسور الميتوكوندريا والخلوي من عينات العضلات باستخدام مجموعة عزل الميتوكوندريا (MITOISO ، Sigma-Aldrich Corporation ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تمت معالجة عينات العضلات الطازجة مسبقًا بزبدة الاستخلاص ، وتقطيعها إلى قطع صغيرة ، وتجانسها في محلول الاستخلاص. ثم تم طرد متجانسات الأنسجة. تم جمع المادة الطافية وحفظها لتحليل الكسر الخلوي. تم بعد ذلك غسل حبيبات الميتوكوندريا وطردها مرة أخرى واستخدامها لتحليل جزء الميتوكوندريا.

قياس أنواع الأكسجين التفاعلي للعضلات (ROS). تم قياس ROS مع البروتوكول المعدل من الأدبيات السابقة. باختصار ، تم قياس ROS من جزء الميتوكوندريا (50 ميكروغرام بروتين / مل) باستخدام محلول DCFDA (C6827 ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الخليط عند 37 درجة لمدة 10 دقائق في الظلام ، وبعد ذلك تم تحضينه بمحلول الركيزة (10 ملي بيروفات ، 15 ملي مالات) من أجل التنشيط الضوئي. تم قياس شدة التألق كل 5 دقائق لمدة 60 دقيقة بواسطة BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader بإثارة 485 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر. تم حساب شدة الإسفار لقياس توليد ROS.

إمكانات غشاء الميتوكوندريا العضلي. تم تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا لكسر الميتوكوندريا من عينات العضلات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (MITOISO ، Sigma-Aldrich Corporation ، الولايات المتحدة الأمريكية). هذا الإجراء عبارة عن اختبار ذو نقطة ثابتة يقيس امتصاص JC -1 مع تكوين الركام J. باختصار ، تم تخفيف معلق الميتوكوندريا لاحتواء 20 ميكروغرام من البروتين وتم تحضينه بصبغة JC -1 لمدة 7 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. هذه 7- دقيقة هي وقت تم تحسينه والتحقق من صحته من قبل الشركة المصنعة باستخدام مركبات مختلفة (كما هو مذكور في بروتوكول الشركة المصنعة) نظرًا لأن التألق الملحوظ للمحلول سيرتفع إلى مستوى ثابت بعد 5-10 دقائق ، متبوعًا بانخفاض حاد في تألق JC -1 بسبب معادلة تركيزات JC -1 داخل وخارج مصفوفة الميتوكوندريا. تم قياس شدة التألق بواسطة BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader بإثارة 490 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر. تم حساب شدة الإسفار لقياس التدرجات المحتملة.

أنسجة العضلات وتقييم الالتهابات. تم تقييم الكيمياء الهيستولوجية المناعية للخلايا الالتهابية داخل العضلات بواسطة تلطيخ CD68 و CD163 كما هو موضح سابقًا. تم قطع مقاطع البارافن من 5 ميكرومتر ، وتم لصقها بشرائح زجاجية Superfrost ™ Plus (Menzel-Gläser ، ألمانيا). تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية للفئران CD68 و ED1 و CD163 ، ED2 ، (Bio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية) على الأقسام عند تخفيف 1: 100. تم اكتشاف تلطيخ محدد بواسطة EnVision ™ Systems (داكو ، الدنمارك) ، باستخدام الجسم المضاد الثانوي ، مضاد IgG المترافق بالبوليمر EnVision-HRP بتخفيف 1: 200 ، وتم اكتشافه باستخدام محلول DAB (داكو ، الدنمارك) ، متبوعًا عن طريق مواجهة الهيماتوكسيلين. ثم تم تركيب المقاطع في ثنائي بيوتيل فثالات في هيستون (DPX). تم الكشف عن وجود العدلات في العضلات عن طريق الكيمياء المناعية الكمية باستخدام برنامج ImageJ.

تحليل التعبير الجيني العضلي. تم إجراء اختبار PCR الذي يحدد ملامح الجينات المتعلقة بالإجهاد التأكسدي باستخدام مصفوفات PCR للدفاع عن الإجهاد التأكسدي للفئران (PARN -065 Z ، SABiosciences ، فريدريك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء مجموعة PCR وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق الارتباط الانتقائي بغشاء أساسه هلام السيليكا بعد تحلل وتجانس عينات العضلات في محلول ثيوسيانات الغوانيدين (RNeasy kit ، Qiagen). تم نسخ RNA عكسيًا إلى cDNA باستخدام RT2 First Strand Kit (SABiosciences ، فريدريك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت إضافة cDNA بعد ذلك إلى RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences ، فريدريك ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك ، تم تقسيم كل عينة على مصفوفات تفاعل البوليميراز المتسلسل للجرذان من الإجهاد التأكسدي ومضادات الأكسدة الدفاعية (SABiosciences ، فريدريك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تنفيذ جميع الخطوات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

دراسة فرط شحميات الدم الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون والتشحم الكبدي في الفئران.

تم تقسيم جميع الفئران بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات (ن =8 - 1 0) وتلقت ما يلي: المجموعة أ) النظام الغذائي العادي للطعام (الجدول 1) ؛ المجموعات من (ب) إلى هـ) نظام غذائي عالي الدهون (يحتوي على 21 بالمائة من الدهون و 0. 15 بالمائة كوليسترول) (الجدول 2). أعطيت وجبات لمدة 8 أسابيع للحيوانات للحث على السمنة. بعد 8 أسابيع ، تم إعطاء جميع المجموعات الغنية بالدهون الماء المقطر ، أو سيمفاستاتين يوميًا ، أو علاج HCE داخل المعدة ، بعد 3 ساعات من تناول سيمفاستاتين. تمت إذابة مستخلص الأعشاب تي أو سيمفاستاتين في 0.5 في المائة ميثيل سلولوز (شركة سيجما الدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية) في ماء مقطر بتركيز معروف. تم إعطاء حجم محسوب مسبقًا داخل المعدة لكل حيوان وفقًا لوزن الفرد بحيث يحتوي الحجم المحسوب على مقدار الجرعة المقترحة المطلوبة. تفاصيل هذه المجموعات هي كما يلي:

المجموعة أ) النظام الغذائي العادي للطعام بالإضافة إلى الماء المقطر

المجموعة ب) النظام الغذائي عالي الدهون بالإضافة إلى الماء المقطر

المجموعة ج) نظام غذائي عالي الدهون بالإضافة إلى سيمفاستاتين (50 مجم / كجم)

المجموعة د) نظام غذائي عالي الدهون بالإضافة إلى HCE (4.4 جم / كجم)

المجموعة هـ) نظام غذائي عالي الدهون بالإضافة إلى سيمفاستاتين (25 مجم / كجم) بالإضافة إلى HCE (4.4 جم / كجم)

تم تسجيل تناول الطعام يومياً وقياس وزن الجسم مرتين أسبوعياً. في نهاية 16- أسبوعًا من الدراسة ، تم التضحية بجميع الفئران بعد صيام 16- ساعة طوال الليل. تم تخدير الحيوانات بمزيج من الكيتامين (100 مجم / كجم) وزيلازين (10 مجم / كجم) داخل الصفاق. تم سحب الدم عن طريق ثقب في القلب وسمح له بالتجلط. تم فصل البلازما بالطرد المركزي (3 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق). تم استئصال الكبد وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة حتى التحليل.

قياس دهون الكبد والبلازما.

تم قياس تركيزات الدهون الثلاثية في البلازما والكوليسترول (11488872216 و 11489232216 ، Roche Diagnostics ، سويسرا) ، وكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة ومنخفض الكثافة (L-Type HDL-C و L-Type LDL-C ، Wako Pure Chemicals Industries ، اليابان) بواسطة الطرق الأنزيمية باستخدام مجموعة الأدوات المتاحة تجاريًا وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد نشاط كيناز كرياتين البلازما (CK) باستخدام مجموعة Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430 ، مختبر ستانبيو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد نسبة الدهون في الكبد الكلية بالقياس الوزني بعد الاستخراج بطريقة Bligh و Dyer. تم تحديد كمية الدهون الكبدية الفردية إنزيميًا (كما هو موضح أعلاه) بعد الذوبان في الأيزوبروبانول (سيغما الدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية).

أمراض أنسجة الكبد وتقييم الالتهابات. تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (تلطيخ H&E). تم قطع مقاطع القراد (5 ميكرومتر) من الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام مشراح ووضعها على شرائح مجهر SuperFrost Plus® (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تعرضت الأقسام لتلطيخ H&E وفقًا لطريقة Harris et al. 26 ومركب مع dibutyl-phthalate في هيستون (DPX) (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) 25.

تلطيخ وتقدير -3 Mac. تم قطع المقاطع السميكة (5 ميكرومتر) من الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام مشراح ووضعها على شرائح مجهر SuperFrost Plus® (Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء استرجاع المستضد ، متبوعًا بالحجب باستخدام كتلة البيروكسيديز (Dako Cytomation ، الدنمارك). تم تطبيق الجسم المضاد الأساسي المنقى لنظام التشغيل Mac -3 (BD Pharmingen ، الولايات المتحدة الأمريكية) على الأقسام عند التخفيف 1:50. تم اكتشاف تلطيخ محدد باستخدام EnVision ™ Systems (داكو ، الدنمارك). تم تحضين الشرائح باستخدام الجسم المضاد الثانوي ، مضاد الأرانب IgG المترافق بالبوليمر EnVision-HRP بتخفيف 1: 200. تم اكتشاف Mac -3 باستخدام محلول DAB (داكو ، الدنمارك) وتمت مقاومته باستخدام الهيماتوكسيلين. ثم تم تركيب الأقسام في DPX. تم الكشف عن وجود الضامة في الكبد بواسطة الكيمياء المناعية الكمية باستخدام برنامج ImageJ.

تحليل احصائي. تم اختبار الاختلافات بين مجموعات العلاج والمراقبة من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار المقارنة المتعددة Bonferroni بعد انتهاء الاختبار. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 6. 0 (GraphPad ، الولايات المتحدة الأمريكية). احتمالية p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

نتائج

تأثيرهيرباسيستانشE على سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين في الفئران. وزن العضلات وقياس البلازما كرياتين كيناز. تم عزل خمسة أنواع مختلفة من العضلات (عضلات الفخذ ، عضلة الساق ، النعلية ، العضلة الظنبوبية الأمامية ، والعضلات الطويلة الباسطة) من جميع الفئران المعالجة. يظهر تأثير العلاجات المختلفة على وزن العضلات في الشكل 1 أ. تسبب Simvastatin (640 مجم / كجم) في تقليل الوزن بشكل كبير في عضلات الفخذ الرباعية وعضلات الساق وعضلات الظنبوب الأمامية في الفئران ، بينما تم استعادة هذه التخفيضات بشكل كبير بواسطة HCE على عضلات الفخذ وعضلات الساق بطريقة تعتمد على الجرعة. رغمهيرباسيستانشمارس E اتجاهًا لاستعادة أوزان عضلة الظنبوب الأمامية في الفئران المعالجة بسيمفاستاتين ، ولم تصل أي من مجموعات العلاج هذه إلى دلالة إحصائية. لم يلاحظ أي تأثير معنوي للعلاج بـ HCE وحده على وزن العضلات عند مقارنته بالفئران الضابطة (الشكل 1 أ).

أظهر الشكل 1 ب آثار العلاجات المختلفة على مستويات البلازما كيناز الكرياتين (CK) في الفئران. تسبب Simvastatin في زيادة كبيرة في نشاط الكرياتين كيناز في الفئران ، والتي تم تقليلها بشكل كبير من خلال العلاجات المشتركة HCE في كلتا الجرعتين. لم يكن هناك أي تأثير معنوي للعلاج بـ HCE وحده على مستويات CK مقارنة بمجموعة التحكم. نظرًا لأنه يبدو أن gastrocnemius حساس للعلاج سيمفاستاتين وهو أكبر عضلة معزولة بالكتلة ، لذلك اخترنا هذه العضلة لمزيد من التحليل بما في ذلك قياس الجلوتاثيون بيروكسيديز العضلي (GPx) وقياس الميتوكوندريا MMP و ROS وتقييم الأنسجة العضلية والالتهابات. .

قياس الجلوتاثيون بيروكسيداز العضلي (GPx). تم قياس مستويات الجلوتاثيون بيروكسيديز في العضلات وعرضها في الشكل 2 أ. تسببت إدارة Simvastatin في اتجاه انخفاض في قياس الجلوتاثيون بيروكسيديز العضلي (GPx) في الفئران. ومع ذلك ، مارس HCE اتجاهًا لتحسين التخفيض الناجم عن سيمفاستاتين في GPx للعضلات عند كل جرعتين 1.1 جم / كجم و 2.2 جم / كجم. لم يكن هناك أيضًا تأثير معنوي لعلاج HCE وحده على مستويات GPx للعضلات مقارنة بفئران التحكم العادية.

جهد غشاء الميتوكوندريا (MMP) وقياس ROS. تسبب علاج Simvastatin (640 مجم / كجم) في انخفاض كبير في MMP العضلي (الشكل 2 ب). تم تحسين هذا التخفيض بالاعتماد على الجرعة في الفئران التي تتلقى العلاج المشترك لـ HCE و simvastatin (الشكل 2 ب). من ناحية أخرى ، من المثير للاهتمام أن مجموعة علاج سيمفاستاتين وحدها قد خفضت بشكل ملحوظ مستويات الميتوكوندريا العضلية ROS مقارنة بمجموعة التحكم العادية (الشكل 2 ج). ومع ذلك ، فإن علاج HCE المعطى للفئران المعالجة بسيمفاستاتين قد مارس اتجاهًا يعتمد على الجرعة لاستعادة مستويات ROS في الميتوكوندريا العضلية إلى المستوى الطبيعي. لم يكن هناك أيضًا تأثير معنوي لمعاملة HCE وحدها في الجرذان مقارنة بمجموعة التحكم العادية لكل من قياس MMP و ROS للميتوكوندريا.

أنسجة العضلات وتقييم الالتهابات. تم تحليل عضلات المعدة من الفئران التي أعطيت علاجات مختلفة تشريحياً وأظهرت المقاطع الملطخة التمثيلية في الشكل 3 أ. أظهرت حيوانات المجموعة الضابطة الأقسام النسيجية للعضلات الطبيعية. في المقابل ، كشفت أقسام H&E من الحيوانات التي عولجت بسيمفاستاتين عن تسلل للعلامات الالتهابية (الأسهم الصفراء) ، والتي انخفضت بشكل كبير في تلك الأجزاء العضلية للفئران بالنظر إلى مزيج سيمفاستاتين و HCE. تم إجراء تحليلات كيميائية مناعية أيضًا لوجود الضامة CD68 و CD163 في الشكلين 4 أ و 5 أ ، على التوالي ، مع تحديد كميات الضامة المعينة الموضحة في الشكلين 4 ب و 5 ب. كشف التحليل الكيميائي الهيستوكيميائي المناعي لأجزاء العضلات عن وجود البلاعم (CD68) في الفئران المعالجة بسيمفاستاتين (اللون البني) ، والذي انخفض بشكل كبير في الفئران بالنظر إلى العلاج المشترك HCE عند كلتا الجرعتين (الشكل 4 ب). لم يلاحظ أي التهاب كبير في الحيوانات المعالجة بالـ HCE وحدها. وبالمثل ، كشف التحليل الكيميائي الهيستوكيميائي المناعي لأقسام العضلات عن وجود الضامة الإيجابية للقرص المضغوط 163- في الفئران المعالجة بسيمفاستاتين (تلوين بني) ، والتي انخفضت بشكل كبير في الفئران نظرًا للمعالجة المشتركة لـ HCE عند 2.2 جم / كجم (الشكل 5 ب) ). لم يلاحظ أي التهاب كبير في الحيوانات المعالجة بالـ HCE وحدها.

تحليل التعبير الجيني العضلي. لتحديد تأثيرات سيمفاستاتين و HCE على الجينات المتعلقة بالإجهاد التأكسدي داخل العضلات ، تم إجراء اختبار PCR الذي يحدد الجينات المتعلقة بالإجهاد التأكسدي باستخدام صفيفات الجرذ التأكسدي والدفاع المضاد للأكسدة PCR. تم تحليل الجينات التي تأثرت بشكل كبير بمعالجة سيمفاستاتين وعرضها في الشكل 6. بالنسبة للتعبير عن الجينات المنظمة لمضادات الأكسدة ، زادت الفئران المعالجة بالسيمفاستاتين (640 مجم / كجم) من التعبير عن الجينات المنظمة لمضادات الأكسدة. يشمل Tese الجلوتاثيون بيروكسيدات (GPx) GPx1 و GPx7 ، وغيرها من البيروكسيدات بما في ذلك Serpinb1b والنادي (الشكل 6 أ). خفض HCE في كلتا الجرعتين (1.1 أو 2.2 جم / كجم) هذه الزيادات التي يسببها سيمفاستاتين في GPxs وغيرها من بيروكسيدات إلى المستويات الطبيعية. من ناحية أخرى ، أدى علاج HCE وحده إلى زيادة كبيرة في مستويات التعبير عن GPx1. فيما يتعلق بالتعبير عن الجينات التي تنظم استقلاب ROS ، تسبب سيمفاستاتين بشكل كبير في التعبير عن جينات التمثيل الغذائي لأكسيد الفائق الأخرى ، بما في ذلك Cyba و Ncf1 و Ncf2 و Scd1 و Ucp2. وبالمثل ، قلل HCE عند كلتا الجرعتين بشكل كبير من هذه الزيادات (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، تسبب سيمفاستاتين في التعبير عن الجينات المؤكسدة المستجيبة للإجهاد بما في ذلك Apoe و Ccl5 و Txn1 ، بينما تم تقليل هذه التعبيرات بشكل كبير في الحيوانات المعالجة بـ HCE عند كلتا الجرعتين (الشكل 6 ج). من ناحية أخرى ، تسبب سيمفاستاتين في انخفاض كبير في التعبير الجيني لـ Txnip. لم يكن هناك تأثير معنوي لـ HCE على التخفيض الناجم عن سيمفاستاتين في التعبير الجيني لـ Txnip (الشكل 6 ج). مارس Simvastatin أيضًا زيادة كبيرة في التعبير عن الجينات التي تنظم ناقلات الأكسجين بما في ذلك Slc38a1 و Vim. قلل العلاج المشترك HCE من التعبير عن هذه الجينات في كلتا الجرعتين (الشكل 6 د).

آثار الاستخدام المشترك لـ Simvastatin و HCE على تناول الطعام ووزن الجسم في الفئران. أظهر الشكل 7 أ المدخول الغذائي اليومي للفئران لجميع مجموعات العلاج. تسبب النظام الغذائي عالي الدهون في زيادة كبيرة في المدخول الغذائي اليومي للحيوانات مقارنة بالحيوانات التي تتغذى على الطعام (ص<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

قياس وزن الجسم الأسبوعي. بعد 16 أسبوعًا من التغذية الغنية بالدهون ، اكتسبت الحيوانات التي تتغذى على HF وزنًا أكبر بشكل ملحوظ من الحيوانات التي تتغذى على الطعام (الشكل 7 ب). ومع ذلك ، لم يكن هناك تأثير معنوي بين الفئران التي تتغذى على HF وجميع مجموعات العلاج التي تتغذى على HF. لم يكن هناك أيضًا فرق كبير بين الفئران التي تتغذى على HF والتي تتلقى العلاج المشترك لسيمفاستاتين وفئران HCE مقابل الفئران التي تتغذى على HF والتي تتلقى علاج HCE أو سيمفاستاتين وحده (الشكل 7 ب).

آثار الاستخدام المشترك لسيمفاستاتين و HCE على فرط شحميات الدم والتشحم الكبدي في الفئران. قياس نشاط دهون البلازما والكرياتين كيناز. يوضح الشكل 8. مستويات الدهون في البلازما لجميع الفئران. وبالمقارنة مع الفئران العادية التي تتغذى على الطعام ، كان لدى الفئران التي تتغذى على HF مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من الكوليسترول الكلي في البلازما (TC) ، والتي انخفضت بشكل ملحوظ في جميع مجموعات العلاج (الشكل 8 أ) . الفئران التي تغذت على HF والتي عولجت بسيمفاستاتين و HCE كان لها TC أقل بكثير من البلازما مقارنة بالحيوانات HF المعطاة سيمفاستاتين بمفردها أو حيوانات HF المعطاة HCE وحدها (p.<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

انخفاض TG في البلازما مقارنة بالفئران التي تتغذى على HF والتي أعطيت علاج سيمفاستاتين وحده (ص<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">قياس الدهون في الكبد.

ارتبطت تأثيرات مجموعات العلاج المختلفة على تضخم الكبد الناجم عن HF (تضخم الكبد) مع انخفاض كبير في محتوى الدهون الكبدي الكلي ، معبرًا عنه بالملليغرام من الدهون لكل كبد (الشكل 9 أ). كان إجمالي محتوى الدهون في الكبد أعلى بشكل ملحوظ في الفئران التي تتغذى على HF مقارنة بالفئران العادية التي تتغذى بالطعام (3. 0- أضعاف أعلى ، ص<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

كما هو مبين في الشكل 9 ب و ج ، أظهر قياس الكوليسترول الكلي للكبد (TC) والدهون الثلاثية في الكبد (TG) أن الفئران التي تتغذى على HF لديها مستويات مرتفعة من كلا الدهون مقارنة بالفئران العادية التي تتغذى بالطعام (أي 3. {4} } أضعاف الزيادة في TC ، ص<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

تقييم التهاب الكبد. تم إجراء تلطيخ كيميائي مناعي للتلطيخ لوجود الضامة (Mac -3) (الشكل 10 أ). كشف التحليل الكيميائي الهيستولوجي المناعي لأقسام الكبد عن وجود ماك -3 في كل من الفئران التي تتغذى على نسبة عالية من الدهون وتلك التي تتغذى بالطعام الطبيعي (اللون البني). تم زيادة هذا الالتهاب بشكل أكبر في الحيوانات المعالجة بسيمفاستاتين ، على الرغم من أن هذه الزيادة لم تصل إلى دلالة إحصائية. ومن المثير للاهتمام أن علاج HCE ، مع أو بدون العلاج المشترك لسيمفاستاتين ، قلل بشكل كبير من الالتهاب في الفئران التي تتغذى على نسبة عالية من الدهون. عند المقارنة بين جميع مجموعات العلاج ، فإن علاج HCE ، مع أو بدون العلاج المشترك سيمفاستاتين كان له أيضًا التهاب أقل بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة علاج سيمفاستاتين (ص.<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

أكمل القراءة ...