الجزء 1: التأثيرات الكلوية للنترات غير العضوية بعد نقص التروية - ضخه في الكلى

لمزيد من المعلومات. اتصلtina.xiang@wecistanche.com

نبذة مختصرة

خلفية: إصابة نقص التروية الكلوية ضخه (IR)هو سبب شائع لإصابة الكلى الحاد(AKI) ، المرتبط بالإجهاد التأكسدي وانخفاض النشاط الحيوي لأكسيد النيتريك (NO) ، وزيادة خطر الإصابةفشل كلوي مزمن(كد) وأمراض القلب والأوعية الدموية (سي في دي). قد يكون للاستراتيجيات الجديدة التي تعيد توازن الأكسدة والاختزال آثار علاجية أثناء القصور الكلوي الحاد والمضاعفات المرتبطة به.

هدف: للتحقيق في القيمة العلاجية لتعزيز مسار النترات - النتريت - NO أثناء تطور القصور الكلوي والقلب والأوعية الدموية الناجم عن الأشعة تحت الحمراء.

طُرق: تم إعطاء ذكور C57BL / 6 J نترات الصوديوم (10 مجم / كجم ، IP) أو السيارة قبل ساعتين من إقفار الكلى اليسرى (45 دقيقة) متبوعًا بمكملات نترات الصوديوم في مياه الشرب (1 مليمول / كجم / اليوم) للأسبوعين التاليين. تم قياس ضغط الدم ومعدل الترشيح الكبيبي وجمع الدم والكلى واستخدامهما في التحليلات الكيميائية الحيوية والنسيجية وكذلك دراسات تفاعل الأوعية الكلوية. تم استخدام الخلايا البطانية الكبيبية المعرضة لنقص الأكسجة ، مع أو بدون أنجيوتنسين ، للدراسات الميكانيكية.

نتائج: ارتبط الأشعة تحت الحمراء بانخفاض وظائف الكلى وارتفاع طفيف في ضغط الدم ، بالإضافة إلى إصابات الكلى والالتهاب والخلل البطاني وزيادة مستويات Ang والنشاط الوعائي بوساطة Ang II ، والتي تم تخفيفها جميعًا بالنترات. علاوة على ذلك ، فإن العلاج بالنترات (في الجسم الحي) والنتريت (في المختبر) أعاد لا نشاط بيولوجي وقلل من الإجهاد التأكسدي وإصابات الميتوكوندريا.

الاستنتاجات: العلاج الحاد بالنترات غير العضوية قبل الإصابة بنقص التروية الكلوية قد يكون بمثابة نهج علاجي جديد للوقاية من القصور الكلوي الحاد ومرض الكلى المزمن والمخاطر المرتبطة بالتطورضعف القلب والأوعية الدموية.

انقر للوصول إلى المورد لتجربة cistanche

1 المقدمة

إن إصابة الكلية بنقص التروية - ضخه (IR) ، المرتبطة بالزرع وجراحة المجازة القلبية والصدمة ، هي من المخاطر الرئيسية للإصابة بإصابة الكلى الحادة (AKI) وأمراض الكلى المزمنة اللاحقة (CKD) [1]. الآليات الأساسية معقدة وتنطوي على الإجهاد التأكسدي المرتبط بإعادة ضخ الدم ، ونقص أكسيد النيتريك ، وتنشيط الخلايا المناعية ، والتي تؤدي معًا إلى خلل وظيفي في البطانة [2 ، 3]. ركزت الأبحاث الجارية على إيجاد علاجات جديدة وفعالة للوقاية من أمراض القصور الكلوي الحاد وعلاجها وتطورها إلى مرض الكلى المزمن ، مثل الشروط المسبقة الإقفارية عن بعد ، وانخفاض درجة الحرارة الموضعي المؤقت ، بالإضافة إلى التدخلات الدوائية الجديدة [3،4].

يساهم جزيء أكسيد النيتريك (NO) في تنظيم القلب والأوعية الدموية واستتباب الكلى وقد ثبت أنه يلعب دورًا وقائيًا أثناء إصابات الأشعة تحت الحمراء [5،6]. ومع ذلك ، أثناء الحدث الإقفاري ، يؤدي نقص الأكسجين إلى الإضرار بوظيفة سينسيز البطاني (eNOS) ، مما قد يساهم في "ظاهرة عدم إعادة التدفق" في الأنسجة الإقفارية أثناء مرحلة إعادة التروية. يؤدي هذا بدوره إلى انتشار إصابات الخلايا الطلائية البطانية والأنبوبية [7] ، والتي تساهم في تطوير وظائف الكلى المنخفضة. بالإضافة إلى نقص الأكسجة خلال فترة نقص تروية الدم ، فإن الإنتاج المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) المتولدة بشكل زائد عن طريق فوسفات النيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADPH) والميتوكوندريا أثناء مرحلة إعادة التروية تنظف NO [8]. قد يكون للنهج الجديدة التي تقلل الإجهاد التأكسدي وتحافظ على عدم وجود نشاط حيوي قيمة علاجية في المعركة ضد الفشل الكلوي الناجم عن الأشعة تحت الحمراء.

كان يُنظر سابقًا إلى النترات غير العضوية (NO3) والنتريت (NOZ) كمنتجات خاملة نسبيًا مشتقة من أيض NO. ومع ذلك ، فقد أظهر البحث الذي تم إجراؤه لأكثر من عقدين أن هذه الأنيونات يمكن أن تخضع للتحول البيولوجي ، من خلال التخفيضات التسلسلية ، ومرة ​​أخرى تشكل NO وأنواع أكسيد النيتروجين الأخرى النشطة بيولوجيًا [9]. يتم تعزيز نشاط مسار النترات- النتريت- NO البديل هذا أثناء ظروف نقص الأكسجة وانخفاض درجة الحموضة عندما يصبح نظام NOS الكلاسيكي معطلًا [10].

يعد النظام الغذائي ، بالإضافة إلى نظام NOS ، مصدرًا مهمًا لتداول النترات والنتريت ، نظرًا لارتفاع مستويات النترات على سبيل المثال في الخضار الورقية الخضراء. ارتبطت مكملات النترات والنتريت غير العضوية بتأثيرات القلب والأوعية الدموية الإيجابية ، بما في ذلك خفض ضغط الدم ، في كل من الدراسات التجريبية والسريرية [11]. كما تم عرض تأثيرات حماية الأعضاء في النماذج التجريبية لإصابة الأشعة تحت الحمراء للكبد [12] والدماغ [13] والرئة [14] والقلب [12 ، 15]. ومع ذلك ، لا تزال القيمة العلاجية المحتملة للنترات والنتريت غير العضوية في إصابة الكلى بالأشعة تحت الحمراء مثيرة للجدل. كما تمت مراجعته مؤخرًا [5] ، النتائج المتغيرة في نماذج الأشعة تحت الحمراء ، باستخدام العلاج بالنتريت ، ربما بسبب الاختلافات في الجرعة المستخدمة ، وطريقة الإعطاء ، ومدة العلاج ، بالإضافة إلى النموذج التجريبي نفسه [16 ، 17]. أظهرت العديد من الدراسات التجريبية التأثيرات الوقائية لمكملات النترات الغذائية في نماذج أمراض القلب الكلوي ، من خلال آليات تتضمن تثبيط الإجهاد التأكسدي وتحسين النشاط الحيوي لأكسيد النيتروجين وكذلك تعديلاستجابات التهابية[5]. حتى الآن ، هناك معرفة محدودة حول آثار العلاج بالنترات غير العضوية في إصابة الكلى بالأشعة تحت الحمراء. لقد أثبتنا سابقًا أن المعالجة الغذائية المزمنة بالنترات تضعف الإصابات الكلوية اللاحقة الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء [18]. ومع ذلك ، هناك قدر أقل من المعرفة فيما يتعلق بالقيمة المحتملة لتعزيز مسار النترات- النتريت- NO في بداية الأشعة تحت الحمراء لتقليل مخاطر الإصابة بـ AKI و CKD. إذا كان هذا وقائيًا ، فقد يكون له تطبيقات سريرية واسعة في المرضى المعرضين لخطر الإصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي على سبيل المثال أولئك الذين يخضعون لعملية جراحية كبرى.

في هذه الدراسة ، استخدمنا نموذج فأر للإصابة بالأشعة تحت الحمراء الكلوية للتحقيق في الفوائد المحتملة لعلاج النترات الحادة مباشرة قبل الحدث الإقفاري. تم الجمع بين هذا مع الدراسات الميكانيكية خارج الجسم الحي وتجارب زراعة الخلايا في المختبر مع علاج النتريت. افترضنا أن تعزيز مسار النترات - النتريت - NO من شأنه أن يعزز حماية الكلى ضد إصابة الأشعة تحت الحمراء من خلال تعديل الإجهاد التأكسدي وعدم النشاط الحيوي وكذلك وظيفة الميتوكوندريا.

2. الطرق

2.1. الوكلاء

ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم الحصول على جميع الكواشف من Sigma-Aldrich ، السويد.

2.2. الحيوانات والكلى نموذج نقص التروية ضخه

تم الحصول على الفئران C57BL / 6 J (ذكر ، 10 أسابيع) من مختبرات Janvier Lab (فرنسا) وتم وضعها في مرافق الحيوانات الخاصة بنا في Karolinska Institutet في ظل ظروف يتحكم فيها المناخ مع 12- دورة فاتحة / مظلمة وتم توفيرها مع طعام القوارض القياسي وماء الصنبور. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية الإقليمية للتجارب على الحيوانات (معرف البروتوكول: N139 / 15) وتم تنفيذها وفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ومع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU لإجراء تجارب على الحيوانات.

بعد أسبوع واحد من التأقلم ، تم إعطاء الفئران الدواء الوهمي (NaCl) أو نترات الصوديوم (NaNO3) داخل الصفاق (1 0 مجم / كجم) قبل ساعتين من نقص تروية الكلية اليسرى من جانب واحد. تم فحص الكلية اليمنى لكنها تركت سليمة. تم إجراء جراحات الشام بنفس الطريقة ولكن بدون لقط الكلى اليسرى. تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين وتم الاحتفاظ بدرجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 درجة باستخدام مصباح تدفئة ووسادة تدفئة ذاتية المراقبة طوال الجراحة. بعد الجراحة ، عولجت الفئران إما بنترات الصوديوم (1 مليمول / كجم / يوم) أو دواء وهمي لمدة أسبوعين حتى الإنهاء.

2.3 قياس ضغط الدم

تم قياس ضغط الدم في الفئران باستخدام طريقة الكفة غير الغازية قبل الإنهاء ، وتم تكييف الفئران على طبق دافئ عند 35 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم وضعوا في مصدات بلاستيكية. تم إرفاق كفة بجهاز استشعار نبضات هوائية بالذيل ، وتم تسجيل قيم ضغط الدم بنظام CODA (Kent Scientific ، Torrington ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تدريب الحيوانات باستخدام أدوات التقييد على لوحة التدفئة قبل ثلاثة أيام على الأقل من تسجيلات ضغط الدم. تم جمع الضغط الشرياني الانقباضي والانبساطي والمتوسط ​​على مدى 3 أيام متتالية وتم تجميع المتوسط ​​الفردي لجميع القيم المقبولة للتقييم.

2.4 حصاد الأنسجة

قبل الإنهاء ، تم وضع الفئران في أقفاص استقلابية لجمع البول لحساب معدل الترشيح الكبيبي (GFR). تم بعد ذلك تخدير الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين وتم جمع عينات الدم من خلال الوريد الأجوف السفلي. تم طرد جميع العينات على الفور عند 6000 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في وجود EDTA (Sigma-Aldrich ، ستوكهولم ، السويد) ، التركيز النهائي 2 ملي مولار. تم نقل عينات البلازما إلى أنابيب جديدة وتجميدها على الفور في الجليد الجاف وتخزينها أخيرًا عند درجة -80. تم ​​استخراج الكلى وتقطيعها إلى عدة أجزاء لتجارب وظائف الأوعية الدموية خارج الجسم الحي (الشرايين بين الفصين والشرايين الواردة) ، الأنسجة ( تلطيخ HE و PAS) ، والتقدير الكمي لموت الخلايا المبرمج والالتهاب (Tissue-Tek الأمثل لقطع درجة الحرارة (OCT) دمج وتجميد لتلوين TUNEL و F4 / 80).

2.5 قياسات النترات ، النتريت ، cGMP ، الكرياتينين ، نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) ، والأنجيوتنسين 2

تم تحليل النتريت والنترات بواسطة HPLC (ENO -20) كما هو موضح سابقًا 【19】. تم حقن عينات البلازما （10 ماي في نظام HPLC باستخدام حقنة هاميلتون. بعد ذلك ، تم فصل النتريت والنترات عن طريق كروماتوجرافيا الطور العكسي / التبادل الأيوني متبوعًا باختزال النترات إلى النتريت بواسطة الكادميوم وانخفاض النحاس. تم اشتقاق النتريت باستخدام كاشف Griess لتكوين مركبات الديازو واكتشافه عند 540 نانومتر. لمنع تدهور cGMP ، تم نقل البلازما إلى أنابيب تحتوي على مثبط PDE ، BMX (3- Isobutyl -1 methylxanthine؛ Sigma-Aldrich # I5879） لإعطاء تركيز نهائي 10 ميكرومتر）. تم استخدام العينات يتم تجميدها وتخزينها بعد ذلك في درجة -80 قبل تحليل cGMP باستخدام مجموعة ELISA (GE Healthcare # RPN226) ، وفقًا لإرشادات الشركات المصنعة.

تم الكشف عن مستويات الكرياتينين في البلازما والبول باستخدام أطقم فحص الكرياتينين اللونية (كايمان كيميكال ، # 700460 و # 500701). تم استخدام صيغة تصفية الكرياتينين (CLcr=تدفق البول Urinecrx / Plasmacr) لتقدير معدل الترشيح الكبيبي. تم الكشف عن مستويات BUN في البلازما باستخدام BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen ، # EIA-BUN). تم قياس مستويات Ang في أنسجة البلازما والكلى باستخدام مجموعة Ang I ELISA (Cloud-Clone Corp. ، # CEA005Mu) وفقًا لتعليمات الشركات المصنعة. ومع ذلك ، اختلف تحضير مستخلص الأنسجة اختلافًا طفيفًا عن التوصية. تمت إضافة 10 حجمًا 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك في 50 بالمائة من EtOH إلى الأنسجة وتم تسخينها لمدة 10 دقائق عند 100 درجة ، بالطرد المركزي 10 000 × جم 10 دقيقة. بعد ذلك تم تجميد العينات وتخزينها في درجة -80 قبل تحليلها. تم إجراء جميع قراءات الامتصاص في SpextraMax iD3 من الأجهزة الجزيئية.

2.6. عزل ونضح الشرايين البينية

تم حصاد الكلى بعد التضحية وحفظها في محلول ملح فسيولوجي بارد مثلج (PSS) حتى عزل الشرايين بين الفصين. تم تشريح الشرايين البينية الكلوية (بطول 2 مم) وتركيبها في أ

غرفة myograph (طراز 62 0 M ، Danish Myo Technology ، الدنمارك) مع PS كما هو موضح سابقًا [20]. تم تسجيل التوتر المتساوي باستخدام نظام Powerlab (Powerlab 4/30 ، AD Instruments ، أستراليا). بعد التركيب ، تمت معايرة الأوعية لمدة 20 دقيقة في PSs التي تغمرها الفقاعات بالكربوجين (95٪ O2 ؛ 5٪ CO2) عند 37 درجة ، pH7.4 ، ثم تم ضبط توتر الشرايين على النحو الموصوف سابقًا [21] ، وهو وفقًا لإجراءات التطبيع في مولفاني [22]. بعد موازنة ثانية ، تم تطبيق 0.1 مول / لتر KCl لتقييم صلاحية الحلقة الشريانية.

2.7. العزلة والنضح الدقيق للشرايين الواردة

تم تخدير الفئران C57BL / 6 J باستخدام الأيزوفلورين المستنشق وتمت إزالة الأطفال وتقطيعهم بسرعة كما هو موضح سابقًا [23-25]. تم وضع شرائح الكلى في وسط النسر المعدل من Dulbecco المثلج (DMEM). تم تشريح شرياني وارد واحد مع الكبيبات المرفقة بشكل دقيق تحت مجهر ستيريوميكروسكوبي ونقله إلى

غرفة تنظم درجة الحرارة في مرحلة المجهر المقلوب. تم إصلاح الكبيبة باستخدام ماصة صغيرة ممسكة وتم إدخال القنية الشريانية الواردة وترويتها بمجموعة من الماصات الدقيقة. تم الحفاظ على الضغط داخل اللمعة للشريان الوارد المروي عند 60 مم زئبق أثناء التجارب. وقت التشريح والإرواء الدقيق التالي اقتصر على 120 دقيقة بعد التضحية بالماوس كما هو موضح سابقًا [26]. بعد 30 دقيقة من فترة الموازنة عند 37 درجة ، تم الحصول على منحنيات الاستجابة للجرعة التراكمية لـ Ang II (10-12 إلى 10-8 مول / لتر). تم ترطيب كل تركيز من Ang II لمدة دقيقتين ، وتم تسجيل الاستجابة التضييقية ثم تم قياس قطر الشريان الوارد.

2.8. الفحص النسيجي

تم حصاد عينات الكلى وتثبيتها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة. تم دمج أنسجة الكلى الثابتة في البارافين وبعد ذلك تم تقطيعها إلى شرائح وملطخة بهيماتوكسيلين - يوزين (H&E) أو حمض شيف الدوري (PAS) للتقييم النسيجي. تم استخدام أربعة حيوانات تم اختيارها عشوائياً من كل مجموعة تجريبية للتحليل. تم التقاط عشرة حقول تم اختيارها عشوائيًا من كل قسم تحت تكبير 400 ×. تم إجراء جميع التحليلات المورفومترية بطريقة أعمى.

2.9 تلطيخ TUNEL

تم استخدام عينات الكلى المضمنة في OCT لتلطيخ TUNEL. 6- تم تحضين المقاطع السميكة بـ 20 ميكروغرام / مل بروتيناز K لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتم إجراء تفاعلات TUNEL باستخدام Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618 ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. في نهاية البروتوكول ، تم تنفيذ DAPIstaining. للتقدير الكمي ، تم اختيار ثلاثة حيوانات وثلاث مناطق ميدانية من الصورة (200 ×) بشكل عشوائي وتم تصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 800- ، تم قياس الإشارات الإيجابية باستخدام برنامج ImageJ / Fiji ، وتم حسابها على أنها نسبة الإشارات الإيجابية إلى DAPI.

2.10. تلطيخ الأنسجة المناعية والفحص المجهري متحد البؤر (F4 / 80)

تم تجميد الكلى في OCT (Tissue-Tek ، Torrence ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحضير الأقسام 6 ميكرومتر ومعالجتها بشكل أكبر. تم غسل المقاطع المجمدة بـ 1 × PBS وتم حظرها بـ 2 بالمائة من مساحة سطح الجسم في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة ثم حضنت بمضاد F4 / 80 (1:50 ، BIO-RAD Cl: A 3-1) طوال الليل بدرجة 4 غرفة باردة ، وبعد ذلك بجسم مضاد ثانوي (1: 200 خلية تشوير Tech # 4417) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، متبوعًا بالتلوين المضاد بـ 300 نانومول / لتر DAPI (4 '6- ديميدينو -2- فينيل - إندول ، ثنائي هيدروكلوريد ، إنفيتروجين) لمدة 3 دقائق. تم تصور إشارات التألق المناعي تحت مجهر Zeiss LSM 800- متحد البؤر. تم اختيار ثلاثة حيوانات وثلاثة مجال للصورة (200 ×) بشكل عشوائي. تم قياس الإشارات الإيجابية F4 / 80 باستخدام برنامج ImageJ / Fiji وتم حسابها كنسبة من الإشارات الإيجابية إلى DAPI.

2.11. زراعة الخلايا

تمت زراعة الخلايا البطانية الكبيبية للجرذان (DSMZ ACC262 ، ألمانيا) في وسط RPMI1640 (Gibco {2}}) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني و 2 ملي مل من الجلوتامين ML (Gibco 25030-082) والبنسلين والستربتومايسين (50 مجم / لتر ، جيبكو 15140-122). تم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. في تجارب نقص الأكسجة ، تم تحضين الخلايا في HBSS (Gibco 14025-092) بدلاً من الوسط الخالي من المصل في غرفة بها أكسجين بنسبة 1٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم تحضين الخلايا مسبقًا باستخدام النتريت （10 ميكرومتر ، مع / بدون مثبط أوكسيدريدوكتاز الزانثين (XOR) فيبوكسوستات (100 نانومتر) ، لمدة 30 دقيقة قبل نقص الأكسدة. تم تقييم قابلية بقاء الخلية بواسطة مقايسة PrestoBlue⑧ (Invitrogen ، A13261 ، و A13262) ، وتم تقييم معدل وفيات الخلايا عن طريق مقايسة استبعاد Trypan Blue (Sigma ، T 8154-20 ML).

2.12. الكشف عن الميتوكوندريا ROS

تم الكشف عن مستويات فوق أكسيد الميتوكوندريا باستخدام صبغة فلوروجينية (MitoSOXTM ، Invitrogen M36008). بعد العلاج ، تم تحضين الخلايا البطانية بـ 2 ميكرولتر / لتر ميتوسوكس في وسط استزراع عند 37 درجة لمدة 10 دقائق. ثم تم غسل الخلايا بـ 1 × HBSS مرتين وتم قياس إشارة الفلورسنت (قارئ SpectraMax iD3 ، الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تطبيعها مع صلاحية الخلية.

2.13. تحليل مناعي

تم تحليل عينات الكلى المجمدة أو الخلايا البطانية في محلول يحتوي على 10 مليمول / لتر Tris-HCl الأس الهيدروجيني 8 ، 150 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 5 مليمول / لتر EDTA ، 60 مليمول / لتر N- أوكتيل جلوكوزيد ، 1 بالمائة Triton X {{9 }} ، ومثبطات البروتياز ، ومثبطات فوسفاتيز البروتين. تم طرد الخلية أو محللات الأنسجة لمدة 5 دقائق عند 10 ، 000 × جم عند 4 درجات. تم نقل المواد الطافية / البروتينات إلى أنابيب جديدة وتم قياسها باستخدام Bio-Rad

فحص البروتين. تم تحليل مستخلصات البروتين التي تحتوي على كمية مكافئة من البروتينات باستخدام {0} في المائة من الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE). تم نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد البوليفينيليدين immobilon لمدة ساعة واحدة عند 300 مللي أمبير ، تم حظر الأغشية في 20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1 بالمائة توين 20 (TBS-T) التي تحتوي على 5 بالمائة خالية من الدهون. مسحوق الحليب لمدة ساعة واحدة مع وجود أجسام مضادة لمضاد TFAM (1: 2000 ، ab131607) ، ومضاد OXPHOS (1: 1000 ، ab110413) ، ومضاد الفينكولين (1: 5000 ، ab129002) (Abcam Cambridge ، المملكة المتحدة) ومضاد -كاسبيز مشقوق -3 (1: 1000 ، # 9664) (تقنية تشوير الخلايا ، بيفرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). جميع الأجسام المضادة الثانوية لتحليل اللطخة المناعية كانت من Cell Signaling Technology. بالنسبة إلى البقع الغربية ، يتم عرض أعمار الصور غير المقطوعة ، المشروحة ، كاملة الطول بعلامات MW في الملف التكميلي.

2.14. تحليل احصائي

تم تحليل المقارنات المتعددة بين المجموعات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار لاحق موصى به. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. تم إجراء جميع الحسابات الإحصائية باستخدام Graphpad Prism 8. 0. تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها p<>