الجزء 2: جزيء إصابة الكلى -1 أحد المستقبلات المحتملة لفيروس السارس -2

لمزيد من المعلومات. اتصلtina.xiang@wecistanche.com

المظاهر السريرية لفيروس كورونا

1. فترة الحضانة طويلة ، وأهم أعراضها الحمى والتعب والتهاب الحلق والسعال. يمكن أن تكون الحمى حمى شديدة أو حمى معتدلة أو حمى منخفضة ؛

2. الرضع وكبار السن ليسوا نموذجيين وغالبًا ما يصاحبهم أزيز وضيق في التنفس. في الحالات الشديدة ، قد يحدث تلف متعدد الأنظمة ؛

3. السعال الجاف في مراحله المبكرة يكون بشكل رئيسي انتيابي وحاد مثل السعال الديكي الذي يؤثر على النوم والأنشطة. في المرحلة اللاحقة ، يكون السعال عبارة عن بلغم ، والبلغم شرير ، ويحتوي أحيانًا على كمية صغيرة من الدم ، وبعضها مصحوب بأزيز ؛

4. بعض المرضى لديهم أعراض خفيفة وقد لا يعانون من الحمى. معظم المرضى لديهم تشخيص جيد ، وعدد قليل من المرضى في حالة حرجة أو يموتون ؛

5. متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، الصدمة الإنتانية ، الحماض الأيضي المقاوم للعلاج ، وخلل التخثر.

كيفية الوقاية من فيروس كورونا الجديد ، فإن تحسين مناعة الفرد هو الوسيلة الأكثر فاعلية لمحاربة الفيروس. يُعرف Cistanche ، الذي تم استخدامه ككنز مغذي منذ العصور القديمة ، باسم "صحراءالجينسنغ"وهو ملك تعزيز المناعة. Cistanche - ملك تعزيز المناعة

أثبتت الأبحاث الطبية الحديثة أنه بالإضافة إلى وظائف تغذية وتقوية الجسم ، فإن Cistanche لها تأثيرات علاجية مهمة في الوقاية من الأورام ، ومكافحة الشيخوخة ، ومكافحة عدم انتظام ضربات القلب ، وتثبيط موت الخلايا المبرمج ، وتحسين المناعة. محاباة.

المجموع الجلوكوزيدات من Cistancheهي المكونات النشطة للجينسنغ لتنظيم وظيفة المناعة ، والتي يمكن أن تحسن وظيفة المناعة ليس فقط للأشخاص العاديين ولكن أيضًا للأشخاص الذين يعانون من ضعف في وظيفة المناعة.

أكدت الملاحظة السريرية أن Cistanche له تأثير علاجي معين على الأورام الخبيثة ، وله تأثير واضح في زيادة عدد الكريات البيض. يمكن أن يؤدي تناول الجينسنغ أثناء العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي إلى تقليل الآثار السامة والجانبية للعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، وتسريع إصلاح الأنسجة التالفة ، ومنع نقص الكريات البيض ؛

مناقشة

لمحاربةCOVID {0}} جائحة، فهم عميق لكيفية ذلكSARS-CoV -2يغزو الخلايا البشرية له ما يبرره. أشارت الدراسات إلى الإصابة المباشرة بفيروس SARS-CoV -2 فيالكلىبالإضافة إلى الرئة (Braun et al.، 2020؛ Farkash et al.، 2020). ومع ذلك ، يظل الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 هو المستقبل الوحيد المعروف جيدًا والذي قد يتوسط في هذا الغزو. علاوة على ذلك ، فإن المدارية الكلوية لـ SARS-CoV -2 وما يرتبط بهاإصابة في الكلىيبدو غير قابل للتفسير من خلال انخفاض مستوى ACE2 نسبيًا عند الغزو الفيروسي (Kuba et al. ، 2005). هنا ، تقترح دراستنا أن KIM1 ، وهو مؤشر حيوي منظم بشكل كبير لإصابة الكلى (Yang et al. ، 2015) ، يتوسط غزو الكلى SARS-CoV -2 كمستقبل.

وجدنا أيضًا أن SARS-CoV -2- RBD يرتبط بـ KIM1 بدرجة تقارب أعلى من تلك الموجودة في SARS-CoV-RBD و MERS-COV-RBD ، والتي من المحتمل أن تكون السبب وراء العدوى الأقوى لـ SARS-CoV -2 (ربان وآخرون ، 2020) ؛ لذلك ، فإن العدوى الكلوية ودور KIM1 في هذه الأمراض التنفسية الحادة تستحق المراجعة. والجدير بالذكر أن نتائجنا تشير إلى مواقع ربط مميزة لـ KIM1 و ACE2 على RBD الفيروسي ، وبالتالي فإن الأمر يستحق التحقق مما إذا كان KIM1 و ACE2 يتوسطان في غزو SARS-CoV -2 في هذه الأعضاء وكيفية ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن KIM1 يتم تحطيمه عبر مسارات تعتمد على الكلاذرين (Zhao et al. ، 2016) ، سيكون من المثير للاهتمام أيضًا مواصلة استكشاف العملية التابعة لـ KIM 1- بعد الارتباط الفيروسي بغشاء الخلية.

إن الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 هو أكثر المستقبلات التي تمت دراستها جيدًا لـ SARS-CoV -2 ، ومع ذلك فهو ليس هدفًا علاجيًا مثاليًا لـ COVID -19 ، حيث يتم التعبير عنه على نطاق واسع في أعضاء متعددة ويلعب أدوارًا حاسمة في تنظيم ضغط الدم والوقاية من إصابة القلب / الكلى (Imai et al.، 2005؛ Li et al.، 2020d). على النقيض من ذلك ، فإن KIM1 له ارتباط أقوى بوظائف الكلى ولا يتم التعبير عنه بشكل كبير إلا بعدإصابة كلوية(Kondratowicz et al، 2011؛ ​​Yuan et al، 2015؛ Costafreda and Kaplan، 2018) ، مما يجعله هدفًا علاجيًا أكثر تحديدًا وربما أكثر أمانًا لمرضى COVID -19 المصابين بأمراض الكلى.

باختصار ، تشير بياناتنا إلى دور حاسم لـ KIM1 في التهاب الكلى السارس -2 كمستقبل محتمل لـ SARS-CoV -2. هنا ، نقترح نموذجًا لـ "الحلقة المفرغة" بوساطة KIM1 و ACE2 (الشكل 5G) ، والذي قد يفسر المدارية الكلوية لـ SARS-CoV -2 في مرضى COVID -19. خلال المرحلة الأولية من غزو SARS-CoV -2 ، فإن المستوى الفسيولوجي الأعلى (الشكل التكميلي S1) وتقارب الارتباط (الجدول التكميلي S1) يجعل ACE2 الهدف الأساسي ، وهو ليس خاصًا بالكلى. ومع ذلك ، بعد ظهور AKL الناجم عن الفيروس ، فإن KIM1 الناتج عن التنظيم بشكل كبير يعزز بسرعة عدوى فيروسية ثانوية بوساطة KIM1 و ACE2 ، وهو أكثر تخصصًا في الكلى ، وبالتالي يؤدي إلى تفاقم تلف الكلى في حلقة مفرغة (الشكل 5G). الأساليب التي يمكنها كسر التفاعل بين SARS-CoV -2 و KIM1 ، بما في ذلك الأجسام المضادة لـ KIM1 ، ومثبطات الجزيئات الصغيرة ، والببتيدات المضادة المشتقة من KIM 1- ، قد تلقي الضوء على COVID -19 علاج او معاملة.

المواد والأساليب

المواد

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 بالمائة) تم تصنيعها كيميائيًا بواسطة Genscript. تم الحصول على الجسم المضاد لـ Anti-mouse-lgG (p / n 18-8816-33) والجسم المضاد لـ rabbit-lgG (p / n 18-8817-33) من Rockland. تم شراء IgG مع SureBeads "حبات مغناطيسية بروتين G (J2112LB -02) من Bio-Rad. كان DAPI (D9542) من Sigma. كان Alex Flour 594 المسمى phalloidin (C2205S) من Beyotimes. أجسام مضادة ضد KIM1 (NBP {{ تم استخدام 15}} و Novus Biologicals) و Flag (F1804 و Sigma) و HA (H6908 و Sigma) و ACE2 (2115-1- AP و Proteintech).

اكتساب وتحليل ملفات تعريف التعبير لـ KIM1 و ACE2

للحصول على ملفات التعريف الشاملة للنسخة والبروتين لـ KIM1 و ACE2 للأنسجة البشرية ، قمنا بجمع وتحليل بيانات النسخ وملفات البروتين القائمة على الكيمياء المناعية من Human Protein Atlas (HPA ، https://www.proteinatlas.org) ، والتي أظهرت التعبير عن البروتينات البشرية وتوطينها عبر الأنسجة والأعضاء ، بناءً على التسلسل العميق للحمض النووي الريبي (RNA-seq) من 37 نسيجًا طبيعيًا وكيمياء الأنسجة المناعية على المصفوفات الدقيقة للأنسجة التي تحتوي على 44 نوعًا من الأنسجة (Uhlen et al. ، 2015). تم تسجيل أنسجة HPA RNA-seq لجين ترميز البروتين كنصوص ترميز بروتين متوسط ​​لكل مليون (pTPM) ، بما يتوافق مع القيم المتوسطة للعينات من كل نسيج. تم تحليل مستويات التعبير البروتيني القائمة على علم الأنسجة يدويًا إلى أربعة مستويات (لم يتم الكشف عنها ، منخفضة ، متوسطة ، وعالية). في الشكل التكميلي S1 ، تم سرد أعلى 10 مستويات نسخ للأنسجة ومستويات التعبير البروتيني القائمة على الأنسجة من KIM1 و ACE2 ، على التوالي ، ويتم تلخيص ملف تعريف التعبير المتداخل لـ KIM1 و ACE2.

الالتحام الجزيئي ومحاكاة الديناميكيات

تم إجراء عمليات الإرساء عبر Z-Dock (http: // zdock. umassmed.edu/). الهياكل البلورية لـ SARS-CoV-RBD (معرف PBD 2AJF) و SARS-CoV -2- RBD (PDB ID 6MOJ) و MERS-COV-RBD (معرف PDB 4L3N) و ACE2 (معرف PDB 1R42) و KIM1 Ig تم استخدام المجال V (معرف PDB 5DZO) للبحث عن نماذج ربط محتملة. تم اختيار أفضل مجمعات البروتين التي تم تسجيلها من أجل عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية التالية ، والتي تم إجراؤها بواسطة خادم ديزموند وتحليلها بواسطة Pymol2.3 و Maestro11.8.012. تم تطبيق مخطط محاكاة ديناميكيات 50 نانوثانية لدراسة المعلمات الديناميكية لمجمعات البروتين . تم حساب الطاقة الحرة الملزمة MM-GBSA بواسطة HawkDock (Misini lgnjatovic et al. ، 2016).

جذر متوسط ​​الانحراف التربيعي (RMSD) وجذر متوسط ​​تذبذب التربيع (RMSF)

تم استخدام RMSD لتقدير متوسط ​​التغيير في إزاحة مجموعة مختارة من الذرات لإطار معين كما هو موصوف (Li et al. ، 2011). تم إجراء RMSF لدراسة تغيرات الإزاحة في سلسلة البروتين (Li et al. ، 2011) .

نماذج الماوس AKI و qPCR

تم إجراء إصابة I / R على الفئران C57BL / 6 كما وصفنا سابقًا (Chen et al ، 2015 ، 2017). بالنسبة لـ AKI الناجم عن السيسبلاتين ، تم حقن 30 مجم / كجم من وزن الجسم السيسبلاتين داخل الصفاق في 8- فئران ذكور عمرها أسبوع ، وتم التضحية بالفئران بعد 3 أيام. تم جمع عينات الدم والكلى لمزيد من التحليل ، مع n =4 لكل مجموعة حيوانات تجريبية. تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الكلى بواسطة RNAiso Plus (TaKaRa) وتم نسخه عكسيًا إلى cDNA باستخدام نظام توليف M-MLV الأول (Invitrogen). تم تقييم وفرة نصوص الجينات المحددة بواسطة qPCR. يتم توفير الاشعال المستخدمة في الدراسة (الجدول التكميلي S4).

يبني

بلازميدات تعبير الثدييات للإنسان KIM1 ، KIM1 Ig V (مخلفات KIM1 aa 20-127) ، KIM1 △ lg V (مخلفات KIM1 مقطوعة aa 20-127) ، KIM 1- CFP ، KIM1 lg V-CFP ، ACE2 ، SARS-CoV -2- RBD (SARS-CoV -2- مخلفات S aa 319-541) ، SARS-CoV -2- S ، SARS-CoV {{20 }} تم إنشاء RBD-YFP و TIM 4- YFP. تم استنساخ منتجات تضخيم PCR لشظايا (كدنا) المقابلة في ناقل قائم على مروج pRK يحتوي إما على علامة HA أو FLAG. كانت البلازميدات ذات الصلة بـ SARS-CoV -2- هدايا لطيفة من دكتور PHWang في جامعة Shandong.

ثقافة الخلية وترنسفكأيشن

تمت زراعة خط الخلايا الأنبوبية للكلى البشرية HK -2 (تم الحصول عليه من مركز الصين لجمع ثقافة النوع) في وسائط DMEM / F12 (Hyclone) تحتوي على 17.5 ملي مولار من الجلوكوز و 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني. لتقييم تأثير SARS-CoV -2 على الخلايا ، تم نقل خلايا HK -2 باستخدام بلازميدات RBD من SARS-CoV -2- S و SARS-CoV -2- ثم تم جمعها من أجل مزيد من الكشف.

IP المشترك

تم تحليل خلايا HK {0}} / HEK293T (1 × 10) في محلول مؤقت للتحلل المسبق سعة 1 مل (25 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.4150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 1 بالمائة NP -40 ، 1 ملي مولار EDTA ، 5 في المئة من الجلسرين) ، الذي تمت صياغته للمقايسات المنسدلة و IP وكعازل غسيل للخرز. بالنسبة إلى IP ، تم تحصين محللة الخلية بالجسم المضاد المحدد أو gG ذي الصلة باستخدام خرزات مغناطيسية SureBeadsTM Protein G طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسل باستخدام محلول مؤقت للتحلل المسبق يحتوي على 500 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، تم غلي الخرزات في مخزن تحميل مؤقت وتعريضها للتخثر المناعي (Wan et al. ، 2017).

فحص الحنق

تم اكتشاف التفاعل داخل الخلايا بين KIM1 و SARS-CoV -2- بواسطة اختبار قياسي قائم على FRET (Karpova and McNally ، 2006) باستخدام KIM 1- CFP و SARS-CoV -2- RBD-YFP . باختصار ، تم نقل بلازميدات تعبير الثدييات التي تعبر عن KIM 1- CFP أو KIM1 Alg V-CFP باستخدام SARS-CoV -2- RBD-YFP إلى -293 الخلايا التائية. بالنسبة للاكتشاف المستند إلى مقياس الطيف الضوئي الفلوري ، تم جمع الخلايا وفحصها بعد 24 ساعة من تعداء العدوى ، وتم اكتشاف المحللة بواسطة مقياس الطيف الضوئي الفلوري F -2700 (Hitachi) عبر مسح الطول الموجي (500-600 نانومتر) ومسح الوقت (435) / 527 نانومتر ، إثارة / انبعاث). بالنسبة للكشف القائم على البؤر ، تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 تحت عدسة موضوعية عالية الطاقة (40 ×) (قناة CFP: 435/485 نانومتر ، الإثارة / الانبعاث ؛ قناة YFP : 485/527 نانومتر ، الإثارة / الانبعاث ؛ قناة FRET: 435/527 نانومتر ، الإثارة / الانبعاث) (Li et al ، 2020b). تم تضمين Cotransfection من CFP و YFP غير المقترن كعنصر تحكم سلبي كما هو موصوف (Karpova and McNally ، 2006). تم الكشف عن التفاعل بين KIM1 و ligand TIM4 الخاص به بواسطة اختبار FRET كعنصر تحكم إيجابي (Rong et al ، 2011).

CRISPR-Cas 9- توسط بالضربة القاضية لـ KIM1

تم استخدام البروتوكولات القائمة على CRISPR-Cas 9- لهندسة الجينوم كما هو موصوف (Zhang et al. ، 2017). يتم توفير تسلسل دليل RNA المستهدف لـ KIM1 (الجدول التكميلي S4).

وسم FITC والفحص المجهري (كنفوكل)

تم إجراء ملصق FITC كما وصفنا سابقًا (Li et al ، 2020b ؛ Zhang et al. ، 2020). باختصار ، تم تحضين SARS-CoV -2- RBD باستخدام FITC (نسبة مولارية 1: 5) بين عشية وضحاها ، ثم تمت إضافة 5 ملي مولار NHCl لإيقاف التفاعل وإخماد FITC غير المتفاعل. تم غسيل المحلول مرتين وتجفيفه بالتجميد لاستخدامه مرة أخرى.

تم تحضين خلايا HEK293T (5 × 1 0 9) أو خلايا HK -2 (1 × 107) باستخدام FITC أو FITC-SARS-CoV -2- RBD （100ug / مل لمدة 2. بالنسبة إلى فحوصات الاستيعاب القائمة على الببتيد ، تمت إضافة AP1 أو AP2 （50μM） بالاشتراك مع FITC-SARS-CoV -2- RBD （100 ميكروغرام / م）. بعد التثبيت باستخدام 4 في المائة (وزن / حجم) فورمالدهايد ، تم تلوين أغشية الخلايا باستخدام Alex Flour 594 المسمى phalloidin （2ug / ml ، وتم تلطيخ النوى بواسطة DAPI （1ug / m） ، ثم تم تصويرها باستخدام Leica TCS مجهر متحد البؤر SP8. لكل مجموعة ، تم تضمين ما لا يقل عن 100 خلية من خمسة حقول تحت عدسة موضوعية عالية الطاقة (64 ×) في التقييم. تم عرض صور تمثيلية. تم إجراء القياس الكمي للصور بواسطة ImageJ1.8.0.

فحوصات جدوى الخلية

تم طلاء الخلايا عند 3000-4000 خلية لكل بئر في 96- من أطباق البئر. عند التقاء 80 في المائة ، تم علاج الخلايا المحتضنة بـ SARS-CoV -2- RBD （100 ميكروغرام / مل مع أو بدون AP1 أو AP2 × 1050100 ميكرومتر）. بعد ذلك ، تمت إضافة 10ul MTT 5 مجم / مل لكل منهما

حسنًا لمدة 4 ساعات ، تمت إزالة الوسيط ، وأضيف DMSO. تم تطبيع الامتصاصية المقاسة عند 490 نانومتر لمجموعة التحكم المعنية.

تحليل احصائي

تم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SD. تم تقييم فروق ذات دلالة إحصائية من خلال اختبار الطالب ثنائي الذيل. قيمة P على الوجهين<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">