تعمل جليكوسيدات فينيلثانول من سيستانش هيربا على تحسين البيئة المكروية لورم نقص الأكسجة وتعزيز تأثيرات أوكساليبلاتين عبر مسار إشارات HIF ‑ 1

تواصل مع تينا للمزيدtina.xiang@wecistanche.com

الملخص. سرطان الكبدهو أحد أكثر أنواع الأورام الخبيثة شيوعًا ويتميز بارتفاع معدل الخباثة والتقدم السريع والمراضة والوفيات. تم الإبلاغ عن Oxaliplatin (OXA) ليكون لها كفاءة ملحوظة ضد المتقدمةسرطان الكبدمع سمية يمكن تحملها. في الأورام الصلبة ، تعزز البيئة المكروية ناقصة التأكسج انتقال اللحمة اللحمية الظهارية (EMT) ، والتي يمكن أن تحفز أيضًا مقاومة الأدوية لسرطان الكبد للأدوية البلاتينية. هيربا سيستانش (Cistanche tubulosa) كثيرا ما تستخدم في الطب الصيني التقليدي وفينيل إيثانولجليكوسيداتمنهيربا سيستانش(CPhGs) هي المكونات النشطة الرئيسية. هدفت الدراسة الحالية إلى التحقيق في آثار CPhGs على قابلية الحياة ، والاستماتة ، والهجرة ، وغزو خلايا سرطان الكبد. تم تقسيم خلايا سرطان الكبد HepG2 إلى مجموعات التحكم و DMSO و CoCl2 و OXA و OXA plus CoCl2 و CPhGs plus OXA plus CoCl2. بعد ذلك ، تم إجراء النسخ العكسي ‑ الكمي وتحليل اللطخة الغربية لتحديد مستويات التعبير عن نقص الأكسجة ‑ العامل المحرض 1 (HIF ‑ 1) ، أوكسيديز ليسيل 2 (LOXL2) ، والجينات والبروتينات المرتبطة بـ EMT (أي E ‑cadherin and Twist) ، من أجل التحقيق في آثار CPhGs على سرطان الكبد. أظهرت النتائج أن CPhGs يمكن أن تعزز آثار OXA على سرطان الكبد ، وتمنع الهجرة والغزو ومعدل موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، أدى علاج CPhGs بشكل فعال إلى تقليل تنظيم HIF ‑ 1 و LOXL2 و Twist وتنظيم E-cadherin. أشارت النتائج الحالية إلى أن CPhGs تسببت في زيادة كبيرة في الحساسية تجاه OXA وقمع EMT الناجم عن نقص الأكسجة في سرطان الكبد عن طريق تثبيط مسار إشارات HIF-1. لذلك ، يمكن اعتبار CPhGs محسسًا فعالًا للأدوية البلاتينية ، والذي يمكن أن يحسن فعالية العلاج الكيميائي لدى مرضى سرطان الكبد.

مقدمة

سرطان الكبدهو ورم خبيث يصيب عادة الجهاز الهضمي ويتكون من أنواع أولية وثانوية. الأوليةسرطان الكبد is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1 ، 000 ، 000 الوفيات المرتبطة بسرطان الكبد بحلول عام 2030 ، ومن بين الحالات المؤكدة حديثًا ، فإن تلك الموجودة في الصين القارية ستشكل 46.6 بالمائة.

تم الإبلاغ عن Oxaliplatin (OXA) لممارسة تأثيرات مثبطة على نمو سرطان الكبد مع سمية يمكن تحملها في البيئات السريرية. ومع ذلك ، فإن الكفاءة الكلية للعلاج الدوائي القائم على البلاتين يعيقها مقاومة الخلايا السرطانية (4). من المعروف جيدًا أن سرطان الكبد يُظهر حساسية أقل للعلاج الكيميائي مقارنة بأنواع السرطان الأخرى. ساهمت مقاومة الأدوية المتعددة لسرطان الكبد في مقاومته للعديد من العوامل العلاجية (5). في دراسة سابقة ، أفاد Xie و Zhong (6) بذلكخلايا HepG2أظهر حساسية ضعيفة للأدرياميسين ، 5 فلورويوراسيل ، وسيسبلاتين تحت ظروف نقص الأكسجة. على الرغم من حقيقة أن عوامل العلاج الكيميائي التي تحتوي على البلاتين هي خيارات العلاج الرئيسية للسرطان ، فإن مقاومة هذه الأدوية موجودة بين المرضى. علاوة على ذلك ، لا يزال تشخيص مرضى سرطان الكبد ضعيفًا (7،8). حتى الآن ، بُذلت جهود مكثفة للتحقيق في مقاومة الأدوية وتحسين حساسية الأدوية لدى مرضى سرطان الكبد.

في ظل ظروف نقص التأكسج ، تحدث إعادة تكوين الأوعية في الخلايا السرطانية ، مما قد يؤدي إلى الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة (EMT) وتقليد الأوعية الدموية (VM). قد يعزز EMT و VM لاحقًا الغزو والورم النقيلي البعيد. علاوة على ذلك ، تم التكهن بأن EMT يلعب دورًا كقوة دافعة لتطور السرطان (9). بالإضافة إلى ذلك ، تشارك العوامل المحفزة بنقص الأكسجة (HIFs) في تكوين الأوعية الجديدة ، واستقلاب الطاقة ، والتكاثر الخلوي ، والغزو ، والورم الخبيث (10).

Lysyl oxidase (LOX) like 2 (LOXL2) هو عضو في عائلة LOX ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بالارتباط التساهمي المتقاطع للكولاجين والإيلاستين ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تليف وهو ضروري لسلامة المصفوفة خارج الخلية ( 11). في دراسة سابقة ، تم اعتبار LOXL2 وثيق الصلة بنقائل الخلايا السرطانية (12). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن LOXL2 يعدل التسبب في المرض وتطور أنواع عديدة من السرطان الخبيث من خلال مسارات خارج وداخل الخلايا ، والتي كانت مؤشرات مهمة لتقييم سوء التشخيص (13 ، 14).

هيربا سيستانشهو عشب منشط ينتشر بشكل شائع في المناطق الصحراوية ، وقد استخدم بشكل متكرر في الطب الصيني التقليدي (15 ، 16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa) هو دواء عشبي طبيعي يُزرع عادة في منطقة شينجيانغ ذاتية الحكم. تعمل جليكوسيدات فينيل إيثانول من Herba Cistanche (CPhGs) كأحد المكونات النشطة الرئيسية لـ Herba Cistanche. في السابق ، أشار Hu et al (17) إلى أن CPhGs يمكن أن تخفف إصابة الكبد في الفئران الحاملة للورم H22 وتمنع نمو الخلايا السرطانية. تم اقتراح أن الآلية الأساسية قد تكون مرتبطة بتخفيض بروتين مصل الدم ويمكن أن تعزز المناعة في الفئران.

في هذه الدراسة ، نموذج نقص الأكسجينHepG2تم تحفيز خلايا سرطان الكبد باستخدام CoCl2. على هذا الأساس ، تهدف الدراسة الحالية إلى التحقيق في آثار OXA على تكاثر الخلايا السرطانية وموتها وهجرتها وغزوها في وجود CPhGs في ظل ظروف نقص الأكسجة. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف مستويات التعبير عن mRNA والبروتين لـ HIF ‑ 1 و LOXL2 و E cadherin و Twist. علاوة على ذلك ، تم التحقيق في الآليات الدقيقة الكامنة وراء تأثيرات CPhGs على التسبب في سرطان الكبد.

المواد والأساليب

خط الخلية. تم توفير خط خلايا سرطان الكبد HepG2 ، كما تم تحديده باستخدام طريقة STR ، من قبل معهد الأبحاث السريرية ، أول مستشفى تابع لجامعة شينجيانغ الطبية (أورومتشي ، الصين). تمت زراعة الخلايا في DMEM عالي الجلوكوز (HyClone ؛ Cytiva) يحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS ، Hyclone ، Cytiva) عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

إعداد CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. The content of CPhGs was >80 في المائة ، من بينها محتوى إشيناكوسيد وفيرباسكوز 44.5 في المائة و 16.1 في المائة على التوالي. تم جمع سيقان C. tubulosa (Schrenk) Wight في أكتوبر 2016 من شينجيانغ ، الصين. تم التعرف على المصنع من قبل الدكتور Junping Hu. تم إيداع جميع عينات القسائم هذه (رقم 201610) في معشبة النبات ، كلية الصيدلة ، جامعة شينجيانغ الطبية ، شينجيانغ ، الصين.

تصميم تجريبي. خلايا HepG2(5x104 / مل) بتركيزات مختلفة من CPhGs (5 ، 25 ، 50 ، 100 ، 200 ، و 500 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية (24 ساعة بعد البذر) لفحص CPhGs ‑ L / M / جرعة H.خلايا HepG2(5 × 1 0 4 / مل) تم تقسيمها إلى المجموعات التالية: 1) المجموعة الضابطة ، المزروعة في DMEM عالي الجلوكوز ؛ 2) مجموعة DMSO ، مزروعة في 0.1 بالمائة DMSO (v / v) ؛ 3) مجموعة CoCl2 (مجموعة نماذج نقص الأكسجة) ، المستزرعة في DMEM خالٍ من المصل يحتوي على 100 ميكرومتر من CoCl2 ؛ 4) مجموعة OXA (مجموعة التحكم الإيجابية) ، المزروعة في 5 ميكرومتر OXA (Beijing Solarbio Science & Technology Co.، Ltd.) ؛ 5) مجموعة OXA plus CoCl2 ، المستزرعة في 5 ميكرومتر من OXA مع 100 ميكرومتر من CoCl2 ؛ و 6) مجموعات CPhGs ، المعالجة بـ CPhGs ‑ L / M / H (25 و 50 و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي) مع 5 ميكرومتر OXA و 100 ميكرومتر من CoCl2.

فحص جدوى الخلية. تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا ‑ 8 (CCK ‑ 8) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Beijing Solarbio Science & Technology Co.، Ltd.) وكما هو موضح سابقًا (18). تم زرع الخلايا (2. 0 x103 خلية / بئر) في أطباق بئر 96. بعد ذلك ، حوالي 24 ساعة بعد البذر ، تمت معالجة الخلايا لمدة 48 ساعة وفقًا لظروف العلاج في كل مجموعة. تم استبدال الوسيط بـ 100 ميكرولتر عالي الجلوكوز DMEM ، متبوعًا بإضافة 10 ul كاشف CCK-8 ؛ تم تحضين الخلايا لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تم قياس الكثافة الضوئية باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعددة الكشف (Thermo Fisher Scientific ، Inc.) عند 450 نانومتر. تم تحضير ستة مكررات لكل حالة.

تحديد معدل موت الخلايا المبرمج. تم تحديد معدل موت الخلايا المبرمج باستخدام مجموعة أدوات اكتشاف Apoptotic الخاصة بـ Annexin V / PI (شركة Beijing Solarbio Science & Technology Co.، Ltd.). تم تلقيح خلايا HepG2 (5 × 1 0 5) في 6 أطباق بئر عند 37 درجة مئوية في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، بعد 24 ساعة تقريبًا من العلاج ، تمت زراعة الخلايا في DMEM خالٍ من المصل لمدة 4 ساعات. تم هضم الخلايا بعد ذلك باستخدام التربسين بنسبة 0.25 في المائة (Gibco ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) ، متبوعًا بثلاث غسالات على الأقل باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد مسبقًا. عند الطرد المركزي عند 167.7 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم تعليق الخلايا بمخزن مؤقت للربط 1X وتم تعديل التركيز إلى 1 ~ 5x106 / ml ، ثم ملطخ بـ 5 ul Annexin V FITC و 5 ul PI لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم خضعت الخلايا لقياس التدفق الخلوي باستخدام مقياس التدفق الخلوي BD LSRFortessa (BD Biosciences) وبرنامج FlowJo 10.6.2 (Tree Star ، Inc.).

فحص التئام الجروح. تم فحص التأثيرات المثبطة لـ CPhGs على هجرة الخلايا عن طريق مقايسة التئام الجروح (19). تم زرع الخلايا في 6 أطباق جيدة حتى يتم الحصول على 1 0 0 بالمائة من الطبقة الأحادية المتكدسة. بعد ذلك ، جُرحت الخلايا باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، وغُسلت ببرنامج تلفزيوني ، وحضنت بعلاجات في وسط خالٍ من المصل. بعد العلاج بالعقاقير ، تم قياس سرعة التئام الجرح عند 0 و 12 و 24 و 48 ساعة على التوالي. تم الحصول على صور الجرح باستخدام مجهر الفلورسنت (نيكون Ti S ، اليابان) بتكبير x10. تم قياس إغلاق الجرح بمسافة الجرح في كل فترة وتم التعبير عنها كنسبة مئوية من مسافة الجرح الأولية عند 0 ساعة.

فحوصات ترانسويل. تم تقييم غزو الخلية بواسطة فحوصات ترانسويل. تم تعليق الخلايا (1 × 1 0 5 خلايا / مل) في 2 0 0 مايكرولتر عالي الجلوكوز DMEM بدون FBS. تم زرع الخلايا بعد ذلك على الآبار العلوية المطلية بـ Matrigel والمغطاة بغشاء مرشح البولي إيثيلين تيريفثاليت (حجم المسام ، 8.0 ميكرومتر). تم وضع إجمالي 500 مايكرولتر عالي الجلوكوز DMEM يحتوي على 10 بالمائة FBS في الغرفة السفلية. تم استخدام مسحات قطنية لإزالة الخلايا الموجودة على السطح العلوي للمرشح بعد 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم إصلاح الخلايا التي غزت من خلال الغشاء بنسبة 4 في المئة بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تم تلوين الخلايا بنسبة 0.1 بالمائة من الكريستال البنفسجي لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. لوحظت غزو الخلايا تحت المجهر الفلوري (نيكون Ti S) بتكبير x100.

النسخ العكسي ‑ PCR الكمي (RT ‑ qPCR). تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا HepG2 باستخدام كاشف TRIzol® (Invitrogen ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) وتم إجراء تخليق (كدنا) باستخدام مجموعة كاشف PrimeScript RT (Takara Bio ، Inc.) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء qPCR على نظام 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems؛ Thermo Fisher Scientific، Inc.) باستخدام TB green ™ Premix Ex Taq ™ (Takara Bio، Inc.) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم سرد المواد الأولية المستخدمة في qPCR في الجدول الأول. وتألفت شروط PCR من تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، متبوعة بـ 40 دورة من تغيير الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. أخيرًا ، تم تحليل نتائج التضخيم باستخدام طريقة 2 ‑ ΔΔCq (20).

تحليل لطخة غربية. تم استخراج البروتينات من الخلايا المعالجة لمدة 48 ساعة عن طريق التجانس في محلول تحلل RIPA (Thermo Fisher Scientific ، Inc.) الذي يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز. تم تحديد محتوى البروتين الخلوي باستخدام طريقة BCA. تم بعد ذلك فصل البروتينات (4 0 ميكروغرام) بواسطة SDS PAGE على هلام بنسبة 10 بالمائة ونقلها إلى غشاء PVDF. تم حظر الغشاء في حليب خال من الدسم بنسبة 5 في المائة لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، وتم تحضينه بالأجسام المضادة الأولية التالية: ‑actin (1: 5 ، 000 ؛ cat. no. bs ‑ 0061R ؛ BIOSS) ، HIF ‑1 (1: 1، 000؛ cat. no. ab179483؛ Abcam)، LOXL2 (1: 500؛ cat. no. ab179810؛ Abcam)، E ‑ cadherin (1: 1، 000 ؛ cat. no. bs ‑ 1 000 9R؛ BIOSS) و Twist1 (1: 500؛ cat. no. bs ‑ 2441R؛ BIOSS) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. تم تحضين الغشاء بعد ذلك بالأجسام المضادة الثانوية IgG H&L الماعز المضادة للأرنب (1: 2000 ؛ القط رقم ab205718 ؛ Abcam) لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل باستخدام TBS 0.05 بالمائة Tween ‑ 20 ، تم تصور البقع باستخدام نظام اللمعان الكيميائي المحسن (Amersham ؛ Cytiva). تم قياس الكثافة النسبية للنطاقات عن طريق تحليل قياس الكثافة باستخدام برنامج ImageJ2x (الإصدار 2.1.4.7 ؛ Rawak Software Inc.) ، وتم تطبيع مخططات قياس الكثافة للنتائج لشدة ‑actin.

تحليل احصائي. تم استخدام برنامج SPSS 19. 0 (SPSS، Inc.) لتحليل البيانات. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري وتم تحليلها بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق. ص<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" all="" experiments="" were="" performed="" at="" least="" in="">

نتائج

آثار CPhGs على حيوية الخلية. عولجت خلايا HepG2 بتركيزات مختلفة من CPhGs (5 ، 25 ، 50 ، 100 ، 200 ، و 500 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة (24 ساعة بعد البذر). كما هو مبين في الشكل 1 ، كان هناك انخفاض كبير في قابلية الخلايا المعالجة بـ 200 و 500 ميكروغرام / مل من CPhGs مقارنةً بمجموعة التحكم (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

تعزز CPhGs تأثيرات OXA على سرطان الكبد. تم تقييم تأثيرات CPhGs على قابلية خلية HepG2 المعدلة OXA لاحقًا (الشكل 2). بعد 48 ساعة تقريبًا ، أدى الجمع بين CPhGs و OXA إلى انخفاض كبير في قابلية خلايا HepG2 مقارنةً بتلك الموجودة في مجموعة OXA plus CoCl2. على وجه التحديد ، تثبط CPhGs ‑ M plus OXA plus CoCl2 و CPhGs ‑ H plus OXA plus CoCl2 بشكل كبير قابلية خلايا HepG2 مقارنةً داخل مجموعة OXA plus CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

يمنع CPhGs هجرة وغزو خلايا سرطان الكبد. لمزيد من دراسة الإمكانات الغازية والقدرة على الهجرة لخلايا سرطان الكبد بعد العلاج بـ CPhGs و OXA ، تم إجراء فحوصات التئام الجروح و Transwell. أشار اختبار التئام الجروح إلى أنه ، مقارنةً بمجموعة DMSO ، تم تقليل انتقال خلايا HepG2 بعد العلاج باستخدام CoCl2 و OXA و CPhGs (200 أو 500 ميكروغرام / مل) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" were="" markedly="">

آثار CPhGs و OXA على موت الخلايا المبرمج. بعد العلاج بمزيج من CPhGs و OXA لمدة 48 ساعة ، تم تلوين خلايا HepG2 بـ Annexin V FITC و PI ، متبوعًا بقياس التدفق الخلوي لتحديد موت الخلايا المبرمج الخلوي. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، أظهرت مجموعات المعالجة المشتركة (CPhGs L / M / H plus OXA plus CoCl2) ارتفاعًا تدريجيًا في نسبة الخلايا المبرمج مع زيادة تركيز CPhGs. تم توطين معظم الخلايا التي عولجت بـ CPhGs و OXA في منطقة Q4 ، مما يشير إلى أن مزيج CPhGs و OXA تسبب في موت الخلايا المبرمج في المرحلة المبكرة. بالمقارنة مع مجموعة OXA plus CoCl2 ، تم اكتشاف ارتفاع كبير في معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا في المجموعات التي عولجت بـ OXA و CoCl2 وجرعات معتدلة أو عالية من CPhGs (P).<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

مستويات التعبير مرنا لـ HIF ‑ 1 و LOXL2 و E cadherin و Twist بعد احتضان CPhGs و OXA المشترك. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin, and Twist between the control and DMSO groups (P>0 .5 ؛ الشكل 5 أ ‑ د). على العكس من ذلك ، تسبب CoCl2 في زيادة كبيرة في مستويات تعبير mRNA لـ LOXL2 و HIF ‑ 1 و Twist مقارنةً بتلك الموجودة في مجموعة DMSO (P).<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

مستويات التعبير البروتيني لـ HIF ‑ 1 و LOXL2 و E-cadherin و Twist بعد احتضان CPhGs و OXA المشترك. أظهرت نتائج النشاف الغربي أن مستويات التعبير البروتيني لـ HIF 1 و LOXL2 و Twist قد تم تنظيمها في ظل ظروف نقص الأكسجة مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة DMSO. على النقيض من ذلك ، تم ضبط مستويات التعبير البروتيني لـ E-cadherin في ظل ظروف نقص الأكسجين (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" the="" dmso="" group,="" the="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" induced="" by="">

مناقشة

نقص الأكسجة هو سمة مشتركة في البيئة المكروية للسرطان. ويرتبط هذا بشكل أساسي بحقيقة أن تكاثر الخلايا السرطانية أسرع مقارنةً بالتشكيل الوعائي للأوعية الجديدة الشاذة. بالإضافة إلى ذلك ، تتأثر العمليات البيولوجية الأخرى ، بما في ذلك الانتشار ، والورم الخبيث ، وحساسية الأدوية بنقص الأكسجة (21). تعد البيئة المكروية التي تعاني من نقص الأكسجة للورم أمرًا حاسمًا في التسبب في السرطان وتطوره ، كما أنها مهمة أيضًا في مقاومة الأدوية وتكوين الأوعية الدموية لسرطان الكبد (22).

في هذه الدراسة ، عولجت خلايا HepG2 بتركيزات مختلفة من CPhGs ، من بينها CPhGs (200 ميكروغرام / مل) يمكن أن تسبب انخفاضًا كبيرًا في حيوية الخلية. والجدير بالذكر أن CPhGs يمكن أن تعدل الصلاحية الخلوية بطريقة تعتمد على الجرعة. في ظل ظروف نقص الأكسجين ، أدى الجمع بين OXA و CPhGs (50 أو 100 ميكروغرام / مل) إلى تثبيط جدوى خلايا HepG2 مقارنةً بعلاج OXA وحده. لوحظ اتجاه مماثل يعتمد على الجرعة في فحوصات الهجرة والغزو لخلايا سرطان الكبد. حاليًا ، تم إجراء دراسات مكثفة للتحقيق في دور موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية في التسبب في مرض الكبد (23-26). تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لعلاج سرطان الكبد من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج (27-29) ؛ لذلك ، قد يكون التداخل في موت الخلايا المبرمج HepG2 بمثابة مرشح واعد للوقاية من سرطان الكبد وعلاجه. تم تحسين موت الخلايا المبرمج لخلايا HepG2 بشكل كبير بعد العلاج بمزيج من CPhGs ‑ M / ‑H و OXA مقارنةً بالخلايا المعالجة بـ OXA وحده. لذلك ، تمت الإشارة إلى أن CPhGs يمكن أن تعزز بشكل كبير التأثيرات المضادة للورم لـ OXA.

يمكن لـ HIF ‑ 1 تنظيم مستويات التعبير عن E-cadherin و N ‑ cadherin و Vimentin ، بالإضافة إلى بعض عوامل النسخ ، مثل Snail1 / 2 و Zeb1 و Twist1. بعد ذلك ، قد يؤدي ذلك إلى فقدان القطبية الخلوية ، وتخفيف تقاطعات الخلايا الخلوية ، والتغيرات في بروتين الهيكل الخلوي ، وانتقال الخلايا السرطانية وغزوها ، مما قد يؤدي إلى انتقال الخلايا السرطانية إلى الجهاز الدوري من خلال الغشاء القاعدي. والنقائل اللاحقة (30). في هذه الدراسة ، تم استخدام CoCl2 للحث على نموذج لنقص الأكسجة ، مما أدى إلى زيادة قابلية خلايا HepG2 ، وكذلك هجرة الخلايا وغزوها. علاوة على ذلك ، تمت زيادة مستويات التعبير عن mRNA والبروتين لـ HIF-1 بشكل كبير ، مما يشير إلى أن CoCl2 تسبب في توليد

تويست و E كاديرين التعبير ؛ لذلك ، تهدف الدراسات المستقبلية إلى التركيز على المزيد من العلامات ذات الصلة بـ EMT ، من أجل تقييم التأثير المثبط لـ CPhGs على EMT الناجم عن نقص الأكسجة في سرطان الكبد.

تم الإبلاغ عن HIF-1 لتعزيز التعبير عن LOXL2 ، ولتعزيز هجرة وغزو خلايا سرطان الكبد ، والتي قد تكون مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالتشخيص السيئ لسرطان الكبد (30). في دراسة سابقة ، زادت مستويات التعبير عن LOXL2 في أنسجة سرطان الكبد المجاورة بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في أنسجة السرطان (35). بالإضافة إلى ذلك ، كان مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا بغزو ورم خبيث لسرطان الكبد. أدى إسكات الجين LOXL2 بواسطة RNA الصغير المتداخل إلى منع تكاثر خلايا HepG2 و SMCC-7721 ، مما أدى إلى توقف دورة الخلية للخلايا السرطانية وزيادة موت الخلايا المبرمج (36). قام Shao وآخرون (35) بالتحقيق في العلاقة بين LOXL2 في عينات سرطان الكبد ، والعوامل الإكلينيكية ، و VM ، والتشخيص بين 201 حالة خضعت لعملية جراحية للعلاج. تم الافتراض أن LOXL2 أدى أدوارًا مهمة في التسبب في سرطان الكبد وتطوره ، والذي قد يكون بمثابة هدف لتطوير الأدوية. علاوة على ذلك ، أظهر Peng et al (37) أن LOXL2 يمكن أن ينشط مسارات إشارات Snail / E cadherin و Src kinase / التصاق كيناز التصاق ، مما قد يساهم في التسبب في تقدم EMT لخلايا سرطان المعدة. في هذه الدراسة ، في ظل ظروف نقص التأكسج ، تمت زيادة مستويات التعبير عن البروتين mRNA والبروتين لـ LOXL2 ، في حين تم تقليل تعبيره بعد العلاج باستخدام OXA. علاوة على ذلك ، أدى العلاج بمزيج من CPhGs و OXA إلى تقليل تنظيم واضح لتعبير LOXL2 ، مما قد يساعد بشكل فعال في التأثيرات المضادة للورم لـ OXA على سرطان الكبد.

هناك بعض القيود على هذه الدراسة. كان من المفترض أن تكون الدراسة الحالية قد استخدمت سطرين آخرين من خلايا سرطان الكبد ، بما في ذلك خط الخلايا SMCC-7721 ، ولكن لا يمكن استخدامهما لأنه لم يكن من الممكن شراء خطوط الخلايا هذه لأنه تم التعرف عليها بشكل خاطئ وتم اشتقاقها من خلايا هيلا. بالإضافة إلى ذلك ، لم تحلل الدراسة الحالية التأثيرات المضادة للأكسدة لتركيزات مختلفة من CPhGs في الخلايا.

في الختام ، يمكن لمجموعات CPhG تبديل البيئة المكروية للورم الناقص التأكسج لخلايا سرطان الكبد من خلال تعديل مسار إشارات HIF-1. بالإضافة إلى ذلك ، ارتفعت حساسية خلايا سرطان الكبد تجاه OXA بشكل ملحوظ استجابة للعلاج بمزيج من CPhGs و OXA. قد توفر هذه النتائج استراتيجية علاجية جديدة لتحسين حساسية سرطان الكبد للعلاج الكيميائي.

LIMEI WEN1،2 * و JUNPING HU1 * و JIAWEI ZHANG1 و JIANHUA YANG1،2

1 كلية الصيدلة ، جامعة شينجيانغ الطبية ، أورومتشي ، شينجيانغ 830054 ؛ 2 قسم الصيدلة ، أول مستشفى تابع ، جامعة شينجيانغ الطبية ، أورومتشي ، شينجيانغ 830011 ، جمهورية الصين الشعبية

تم استلامه في 29 يوليو 2020 ؛ تم القبول في 9 مارس 2021

DOI: 10.3892 / ملم .2021.12156

شكر وتقدير

لا ينطبق.

التمويل

تم دعم الدراسة الحالية من قبل مختبر شينجيانغ الرئيسي للمكونات النشطة للأدوية الطبيعية وتكنولوجيا إطلاق الأدوية (المنحة رقم XJDX1713) ، مشروع المرشح الاحتياطي لقائد الابتكار العلمي والتكنولوجي في منطقة شينجيانغ الويغورية ذاتية الحكم (المنحة رقم 2019XS14) ، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 81860735) ومؤسسة Bethune الخيرية 'Bethune · Quest بناء قدرات البحث العلمي الصيدلاني (المنحة رقم B ‑ 19 H ‑ 20200622).

توافر البيانات والمواد

تتوفر مجموعات البيانات المستخدمة و / أو التي تم تحليلها أثناء الدراسة الحالية من المؤلف المقابل بناءً على طلب معقول.

مساهمات المؤلفين

أجرى LMW و JWZ التجارب ، وصاغوا المخطوطة ، وأكدوا صحة جميع البيانات الأولية. صممت JPH و JHY الدراسة الحالية. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

موافقة الأخلاق والموافقة على المشاركة

لا ينطبق.

موافقة المريض للنشر

لا ينطبق.

تضارب المصالح

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

مراجع

1. سرطان الخلايا الكبدية. Nat Rev Dis Primers 2: 16019 ، 2016.

2. Gingold JA و Zhu D و Lee DF و Kasab A و Chen J: التنميط الجينومي والتوازن الأيضي في سرطانات الكبد الأولية. اتجاهات Mol Med 24: 395-411 ، 2018.

3. McGuire S: تقرير السرطان العالمي 2014. جنيف ، سويسرا: منظمة الصحة العالمية ، الوكالة الدولية لبحوث السرطان ، مطبعة منظمة الصحة العالمية ، 2015. Adv Nutr 7: 418-419 ، 2016.

4. Gholamreza K، Jadidi ‑ Niaragh F، Jahromi AS، Zandi K، and Hojjat ‑ Farsangi M: آليات مقاومة الخلايا السرطانية لعوامل العلاج المستهدفة الحالية. ورم بيول 37: 10021-10039 ، 2016.

5. Dong X و Mumper RJ: إستراتيجيات طب النانو لعلاج الأورام المقاومة للأدوية المتعددة: التقدم الحالي. الطب النانوي (لوند) 5: 597-615 ، 2010.

6. Xie Y و Zhong DW: يرتبط AEG ‑ 1 بالمقاومة الكيميائية لسرطان الخلايا الكبدية المستحث بنقص الأكسجة عن طريق تنظيم مسار PI3K / AKT / HIF ‑ 1alpha / MDR ‑ 1. EXCLI J 15: 745-757 ، 2016.

7. Xiong H و Ni Z و He J و Jiang S و Li X و He J و Gong W و Zheng L و Chen S و Li B وآخرون: يقوم LncRNA HULC بتشغيل الالتهام الذاتي عن طريق تثبيت Sirt1 ويخفف من الحساسية الكيميائية لخلايا سرطان الكبد. Oncogene 36: 3528-3540 ، 2017.

8. Gade TPF و Tucker E و Nakazawa MS و Hunt SJ و Wong W و Krock B و Weber CN و Nadolski GJ و Clark TWI و Soulen MC وآخرون: يتسبب نقص التروية في الهدوء والاعتماد على الالتهام الذاتي في سرطان الخلايا الكبدية. الأشعة 283: 702-710 ، 2017.

9. Siegel RL و Miller KD و Jemal A: إحصائيات السرطان ، 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30 ، 2017.

10. Dong LQ و Shen BQ و Ma Y: تقدم البحث في البيئة المكروية لنقص الأكسجة في سرطان الخلايا الكبدية. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258 ، 2018 (بالصينية).

11. Moon HJ، Finney J، Ronnebaum T، and Mure M: Human lysyl oxidase ‑ like 2. Bioorg Chem 57: 231‑241، 2014.

12. Ferreira S و Saraiva N و Rijo P و Fernandes AS: مثبطات LOXL2 وتطور سرطان الثدي. مضادات الأكسدة (بازل) 10: 312 ، 2021.

13. Philp CJ و Siebeke I و Clements D و Miller S و Habgood A و John AE و Navaratnam V و Hubbard RB و Jenkins G و Johnson SR: يعزز ربط المصفوفة المتقاطعة خارج الخلية نمو الخلايا الليفية ويحمي من تحلل بروتين المصفوفة في تليف الرئة. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603، 2018.

14. Galván JA و Zlobec I و Wartenberg M و Lugli A و Gloor B و Perren A و Karamitopoulou E: التعبير عن مثبطات E-cadherin SNAIL و ZEB1 و ZEB2 عن طريق الخلايا السرطانية والسدوية يؤثر على النمط الظاهري الناشئ للورم ويقترح عدم تجانس الخلايا اللحمية. الخلايا في سرطان البنكرياس. Br J Cancer 112: 1944-1950 ، 2015.

15. Gu C و Yang X و Huang L: Cistanches herba: مراجعة علم الأدوية العصبية. فرونت فارماكول 7: 289 ، 2016.

16. Fu Z و Fan X و Wang X و Gao X: Cistanches Herba: نظرة عامة على خصائصها في الكيمياء والصيدلة والحركية الدوائية. J إثنوفارماكول 219: 233‑247 ، 2018.

17. Hu Q و You SP و Liu T و Wang B و Liu X و Jiang Y: تحقيق في التأثير المضاد لسرطان الكبد الناتج عن cistanche. مسرطنة مسرطنة 30: 194-199 ، 2018.

18. Mao J و Tian Y و Wang C و Jiang K و Li R و Yao Y و Zhang R و Sun D و Liang R و Gao Z وآخرون: ينظم CBX2 الانتشار والاستماتة عن طريق فسفرة YAP في سرطان الخلايا الكبدية. ي السرطان 10: 2706-2719 ، 2019.

19. Qin Y، Liu HJ، Li M، Zhai DH، Tang YH، Yang L، Qiao KL، Yang JH، Zhong WL، Zhang Q، et al: Salidroside يحسن البيئة المكروية للورم الناقص الأكسجين ويعكس مقاومة الأدوية من الأدوية البلاتينية عن طريق مسار إشارات HIF-1. EBioMedicine 38: 25-36 ، 2018.

20. Livak KJ و Schmittgen TD: تحليل بيانات التعبير الجيني النسبي باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي وطريقة 2 (‑Delta Delta C (T)). الطرق 25: 402-408 ، 2001.

21. Vaupel P: فسيولوجيا الورم المكروية وتأثيراتها على علاج الأورام بالإشعاع. سيمين راديات أونكول 14: 198-206 ، 2004.

22. Chen C and Lou T: العوامل المحفزة بنقص الأكسجة في سرطان الخلايا الكبدية. Oncotarget 8: 46691–46703 ، 2017.

23. Schwabe RF و Luedde T: موت الخلايا المبرمج والنخر في الكبد: مسألة حياة أو موت. نات ريف جاسترونتيرول هيباتول 15: 738-752 ، 2018.

24. Kanda T و Matsuoka S و Yamazaki M و Shibata T و Nirei K و Takahashi H و Kaneko T و Fujisawa M و Higuchi T و Nakamura H وآخرون: موت الخلايا المبرمج وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية. World J Gastroenterol 24: 2661-2672 ، 2018.

25. Pittala S و Krelin Y و Shoshan-Barmatz V: استهداف سرطان الكبد والأمراض المرتبطة به في الفئران باستخدام ببتيد VDAC1 في الميتوكوندريا. الورم 20: 594-609 ، 2018.

26. Jing ZT، Liu W، Xue CR، Wu SX، Chen WN، Lin XJ، and Lin X: AKT activator SC79 يحمي الخلايا الكبدية من موت الخلايا المبرمج بوساطة TNF‑ ويخفف من إصابة الكبد التي يسببها d Gal / LPS. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 316: G387 ‑ G396، 2019.

27. Zhu YJ و Zheng B و Wang HY و Chen L: معرفة جديدة بآليات مقاومة سورافينيب في سرطان الكبد. أكتا فارماكول سين 38: 614-622 ، 2017.

28. Wei R و Cao J و Yao S: يعزز ماترين موت الخلايا المبرمج لسرطان الكبد عن طريق تثبيط مسارات ميتوفاجي و PINK1 / باركين. مرافقات الإجهاد الخلوي 23: 1295-1309 ، 2018.

29. Shen L و Zhang G و Lou Z و Xu G و Zhang G: يعزز الكريبتوتانشينون تأثير ثالث أكسيد الزرنيخ في علاج خلايا سرطان الكبد عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج من خلال تقليل تنظيم الفسفرة ‑ STAT3 في المختبر وفي الجسم الحي. BMC Complement Altern Med 17: 106 ، 2017.

30. Wu F و Zhang J و Liu Y و Zheng Y و Hu N: تحدد المتغيرات الجينية وتعبيرات البروتين HIF1 الاستجابة للعلاج الكيميائي القائم على البلاتين والنتائج السريرية في المرضى الذين يعانون من NSCLC المتقدم. خلية Physiol Biochem 32: 1566-1576 ، 2013.

31. Heerboth S ، Housman G ، Leary M ، Longacre M ، Byler S ، Lapinska K ، Willbanks A and Sarkar S: EMT والورم النقيلي. Clin Translated Med 4: 6 ، 2015.

32. Hapke RY و Haake SM: Hypoxia المستحث بالانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة في السرطان. برج السرطان 487: 10-20 ، 2020.

33. Zhao Z و Rahman MA و Chen ZG و Shin DM: وظائف بيولوجية متعددة لـ Twist1 في أنواع مختلفة من السرطان. Oncotarget 8: 20380-20393 ، 2017.

34. Goossens S و Vandamme N و Van Vlierberghe P و Berx G: إعادة تقييم عوامل النسخ EMT في تطور السرطان: ما وراء EMT و MET. بيوتشيم بيوفيس أكتا ريف كانسر 1868: 584-591 ، 2017.

35. Shao B ، Zhao X ، Liu T ، Zhang Y ، Sun R ، Dong X ، Liu F ، Zhao N ، Zhang D ، Wu L ، et al: LOXL2 يعزز محاكاة الأوعية الدموية وعدوانية الورم في سرطان الخلايا الكبدية. جي سيل مول ميد 23: 1363-1374 ، 2019.

36. Wu L و Zhang Y و Zhu Y و Cong Q و Xiang Y و Fu L: تأثير LOXL2 في سرطان الخلايا الكبدية. مول ميد ريب 14: 1923-1932 ، 2016.

37. Peng L و Ran YL و Hu H و Yu L و Liu Q و Zhou Z و Sun YM و Sun LC و Pan J و Sun LX وآخرون: يُعد LOXL2 هدفًا علاجيًا جديدًا يعزز ورم خبيث لسرطان المعدة عن طريق Src / مسار FAK. التسرطن 30: 1660-1669 ، 2009.