عزل وتنقية تحضيري لأربعة مركبات من نبات نبات الديزرتيكولا YC Ma بالكروماتوغرافيا عالية السرعة بعكس التيار

1 المقدمة

Cistanches deserticolaواي سي ما، وهو نوع منسيستانشسالذي ينتمي إلىOrobanchaceaeعائلة، هو الطب الصيني التقليدي المعروف لعلاج قصور الكلى، والعقم عند النساء، ونزف الدم المرضي، وتعذر الأداء العصبي، والإمساك الشيخوخة [1]. وهو نبات طفيلي ينتشر على نطاق واسع في شمال غرب الصين. حتى الآن، عدة مركبات، بما في ذلكجليكوسيدات فينيليثانويد (PhGs)وقد تم عزل القزحيات والقشور من هذا النوع [2]. تم الإبلاغ عن أن بعض PhGs تمتلك أنشطة مضادة للأكسدة وواقية للكبد وواقية للأعصاب [3-6]. ومع ذلك، فإن إجراء عزل وتنقية PhGs صعب ويستغرق وقتًا طويلاً. علاوة على ذلك، فإن الطرق الكروماتوغرافية المتعددة الكلاسيكية لا تستخدم فقط كمية كبيرة من المذيبات العضوية ولكنها تعطي أيضًا استردادًا أقل للعينة. كروماتوغرافيا التيار المضاد عالي السرعة (HSCCC)، وهي تقنية كروماتوغرافية لتقسيم السائل إلى سائل خالية من الدعم، توفر استردادًا ممتازًا للعينات مقارنة ببعض الطرق التقليدية وقد تم استخدامها على نطاق واسع لفصل وتنقية المنتجات الطبيعية المختلفة [7-9] . على الرغم من أن العديد من PhGs قد تم تنقيتها منهاسيستانشسجنس وآخرون بواسطة HSCCC [10-14]، لم تُبلغ أي ورقة عن تنقية الأكتيوسيد، والإيزواكتيوسايد، والسيرينجاليد A 3'- -L-رامنوبيرانوسايد و2'-أسيتيل لاكتيوسيد في نظام ثنائي الطور واحد.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

في هذا البحث، نقدم طريقة بسيطة لفصل وتنقية أربعة PhGs من C. deserticola. أخيرًا، تم الحصول على 30.9 مجم من الأكتيوزيد، و13.0 مجم من الإيزواكتيوسيد، و12.5 مجم من سيرينجاليد A 3'- -L-rhamnopyranoside و7.2 مجم من 2'-أسيتيللاكتيوسيد في خطوة واحدة للفصل. من 297 ملغ من الكسر بنقاء 99%، 95%، 99%، و98% على التوالي. تم توصيف هياكلها بناءً على البيانات الطيفية 1 H و 13 C-NMR وأطياف HR-MS. تظهر هياكل PhGs الأربعة المحددة في هذا التحقيق في الشكل 1.

2. النتائج والمناقشة

2.1. تحليل HPLC للمستخلص الخام

تم تحليل الجزء المخصب المكون من مستخلص البوتانول n من C. deserticola بواسطة HPLC-UV. كان العمود المستخدم هو Accurasil C18 (250 مم × 4.6 مم، المعرف 5 ميكرون) (Thermo-Fisher Scientific Instruments، مدينة، اختصار الولاية، الولايات المتحدة الأمريكية)، وكان الطور المتحرك عبارة عن ماء الميثانول (30:70، v / v). وكان معدل التدفق 1 مل / دقيقة. تم ضبط الطول الموجي للكاشف عند 254 نانومتر. يظهر الرسم اللوني HPLC في الشكل 2. تتوافق القمم من 1 إلى 4 مع الأكتيوسيد (1)، والإيزواكتيوسايد (2)، والسيرينجاليد A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) و2'-أسيتيللاكتيوسايد (4)، على التوالي. .

2.2. اختيار نظام المذيبات على مرحلتين

يعتمد الفصل الناجح بواسطة HSCCC إلى حد كبير على اختيار نظام مذيب مناسب ثنائي الطور، وتم اختيار نظام المذيبات ثنائي الطور وفقًا لقيم معامل القسم (K) لكل مكون مستهدف ويجب أن يكون النطاق الأمثل لـ K من {{ 2}).5 إلى 2.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين المناعة PHGS75% ECH 30% ACT 12%

في التجربة، تظهر قيم K للمكونات المستهدفة للعديد من أنظمة المذيبات ثنائية الطور في الجدول 1 (على الرغم من أنها أعلى قليلاً بالنسبة للذروة 4، فقد أظهرت النتائج أنها مقبولة). من بينها، أسيتات إيثيل-ن-بوتانول-إيثانول-ماء (40:6:6:50، حجم/حجم/حجم/حجم) أعطت معاملات تقسيم مناسبة للمركبات المستهدفة. في النهاية، تم استخدام نظام المذيبات المكون من أسيتات إيثيل-ن-بوتانول-إيثانول-ماء (40:6:6:50، حجم/حجم/حجم/حجم) لعزل وتنقية أربعة مركبات من C. deserticola، كما هو موضح في الشكل 3. كما هو موضح في الشكل 2، كشف تحليل HPLC لكل جزء من HSCCC أن أربعة PhGs نقية (أكتيوسيد، 99%؛ إيزواكتيوسيد، 95%؛ سيرينجاليد A 3′- -L-rhamnopyranoside 99% و2′- يمكن الحصول على أسيتيل لاكتيوسيد 98% من الجزء الخام.

3. التجريبية

3.1. جهاز HSCCC

كانت المعدات المستخدمة في هذه الدراسة عبارة عن نظام كروماتوجرافيا مضاد للتيار عالي السرعة TBE {{0}} B (Shanghai Tauto Biotech Co.، Shanghai، China) مع ثلاثة أعمدة فصل لفائف تحضيرية متعددة الطبقات متصلة في سلسلة (القطر من الأنبوب=2.6 مم، الحجم الإجمالي=300 مل) وحلقة عينة 2{{10}} مل. كان نصف قطر الدورة أو المسافة بين محور الحامل والمحور المركزي لجهاز الطرد المركزي (R) 5 سم، وتراوحت القيمة من 0.5 عند الطرف الداخلي إلى 0.8 عند الطرف الخارجي (= r/R، حيث r هي المسافة من الملف إلى عمود الحامل). تم استخدام جهاز HX 105 للتدوير بدرجة حرارة ثابتة (Beijing Changliu Lab Instrument Company، بكين، الصين) للتحكم في درجة الحرارة في التجربة. تم تجهيز نظام HSCCC بمضخة التدفق الثابت ذات الضغط المتوسط ​​TBP-5002 النموذجية، ونموذج كاشف الأشعة فوق البنفسجية TBP-2000 الذي يعمل عند 254 نانومتر، ومحطة عمل نموذجية V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument الشركة، شنغهاي، الصين).

كانت معدات التحليل اللوني السائل عالية الأداء (HPLC) المستخدمة عبارة عن نظام Agilent 1200 الذي يتكون من مضخة ثنائية G1312A، ووحدة أخذ العينات التلقائية G1329A، وكاشف الطول الموجي المتغير G1314A (VWD)، وحجرة العمود ذات التنظيم الحراري G1316A، ومزيل الغاز G1379B ومحطة عمل Agilent LC. . تم استخدام جهاز alltech 3300 ELSD للكشف عن النقاء. تم استخدام Agilent 6520 Q-TOF وBruker AVANCE III 500-مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد التركيب الهيكلي للمركبات. تم قياس أطياف 1 H و13C-NMR (عند 500 و125 ميجاهرتز، على التوالي) عند درجة حرارة الغرفة (22 درجة /295.1 كلفن).

3.2. الكواشف والمواد

كانت أسيتات الإيثيل، والبوتانول، والإيثانول من الدرجة التحليلية وكان الميثانول من درجة HPLC. تم شراء جميع المذيبات من شركة Tianjin Concord Technology Company (تيانجين، الصين). تم استخدام ماء Milli-Q (18.2 MΩ) (Millipore، Bedford، MA، USA) لجميع المحاليل والتخفيفات. تم جمع جذمور C. deserticola من مقاطعة منغوليا الداخلية، جمهورية الصين الشعبية، في يونيو 2009. تم التعرف على النبات من قبل البروفيسور ليجوان تشانغ، وتم إيداع عينة قسيمة (رقم 20091001) في مختبرنا.

3.3. إعداد العينة الخام

تمت إعادة إرجاع السيقان اللحمية المجففة بالهواء من C. deserticola (1 كجم) مرتين باستخدام الإيثانول المائي (8 لتر، 60٪ حجم / حجم) لمدة ساعتين في كل مرة. تم تبخير المستخلص تحت ضغط مخفض وعند درجة حرارة 60 درجة حتى التبخر الكلي للإيثانول. تم تعليق المادة المتخلفة في الماء واستخلاصها ثلاث مرات على التوالي باستخدام الكلوروفورم، وأسيتات إيثيل، وبيوتانول n، مما يوفر 5.16 جم من مستخلص بيوتانول n بعد التبخر حتى الجفاف تحت ضغط منخفض. تم بعد ذلك فصل مستخلص البيوتانويك على عمود هلام السيليكا (شبكة 200-300) باستخدام شطف متدرج تدريجي (CHCl3 –MeOH، 10:1 → 1:1) لإعطاء ثمانية كسور. تم استخدام الجزء 6 (297 مجم) لمزيد من عزل وفصل HSCCC.

سيستانش توبولوسا الطبيعي الأدوية الصينية التقليدية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. اختيار أنظمة المذيبات ثنائية الطور

تم اختيار أنظمة المذيبات ثنائية الطور وفقاً لمعامل التقسيم (K) للمكونات المستهدفة في جزء C. deserticola. تم تحديد قيم K بواسطة تحليل LC على النحو التالي: تم إذابة كمية مناسبة من مسحوق المستخلص الخام (الجزء 6) في المرحلة السفلية من نظام المذيبات وتم تحليلها بواسطة HPLC. تم تسجيل مناطق القمم على أنها A1. ثم تمت إضافة حجم متساو من الطور العلوي إلى المحلول وخلطه جيدًا للوصول إلى توازن القسم. ثم تم تحليل المرحلة السفلية بواسطة HPLC مرة أخرى. تم تسجيل مناطق الذروة الأخيرة على أنها A2. تم حساب قيم K وفقًا للمعادلة التالية: K=(A1 - A2)/A2 [15,16].

3.5. إعداد نظام المذيبات على مرحلتين ومحلول العينة

في هذه الدراسة، تم استخدام نظام المذيبات ثنائي الطور المكون من أسيتات الإيثيل-ن-بيوتانول-إيثانول-ماء (40:6:6:50، v/v/v/v) لفصل HSCCC. تمت إضافة كل مذيب إلى قمع منفصل وتمت معايرته تمامًا عند درجة حرارة الغرفة. تم فصل الطور العلوي والمرحلة السفلية وتفريغهما بواسطة صوتنة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام بوقت قصير. تم تحضير محلول العينة عن طريق إذابة 297 مجم من الكسر 6 في 15 مل من الطور السفلي من أسيتات إيثيل-ن-بيوتانول-إيثانول-ماء (40:6:6:50، v/v/v/v).

3.6. إجراءات فصل HSCCC

تم إجراء HSCCC على النحو التالي. تمت تعبئة العمود الملفوف متعدد الطبقات أولاً بالمرحلة الثابتة العضوية العلوية. تم بعد ذلك ضخ الطور المتحرك المائي السفلي إلى نهاية رأس العمود بمعدل تدفق 1.5 مل/دقيقة، وفي الوقت نفسه، تم تشغيل جهاز HSCCC بسرعة ثورة قدرها 900 دورة في الدقيقة. بعد إنشاء التوازن الهيدروديناميكي، كما هو موضح من خلال الطور المتحرك الواضح الذي يتم شطفه عند مخرج الذيل (بعد حوالي ساعتين)، تم حقن محلول عينة 15 مل يحتوي على 297 مجم من المستخلص الخام (الجزء 6) من خلال صمام الحقن. تمت مراقبة التدفق السائل للعمود بشكل مستمر تحت 254 نانومتر. تم جمع أربعة أجزاء ذروة وفقًا للكروماتوجرام ثم تبخرت تحت ضغط منخفض. تم ضبط درجة حرارة الجهاز على 25 درجة.

3.7. تحليل HPLC وتحديد كسور الذروة HSCCC

تم تحليل كسور الذروة من HSCCC بواسطة HPLC-ELSD. كان العمود المستخدم هو Accurasil C18 (250 مم × 4.6 مم، المعرف 5 ميكرومتر)، وكان الطور المتحرك عبارة عن ماء الميثانول (30:70، v / v). وكان معدل التدفق 1 مل / دقيقة. تم تشغيل ELSD في ظل الظروف التالية: درجة الحرارة 45 درجة، الغاز 1.6 لتر/دقيقة. تم إجراء التحديد الهيكلي لكسور الذروة الأربعة لـ HSCCC بواسطة التحليل الطيفي HR-ESI-MS و1 H و13C-NMR.

3.8. التعريف الهيكلي

الكسر الأول: تمت ملاحظة HR-ESI-MS عند m/z 623.2001 (M−H)−، calcd لـ C29H35O15، 623.1981. 1 H-NMR (500 ميجا هرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 1.09 (3H، d، J=6 هرتز، CH3 من رامنوز)، 2.79 (2H، t، J=7.5 هرتز، Ar- CH 2-)، 4.37 (1H، d، J=8 هرتز، H -1 من الجلوكوز)، 5.18 (1H، d، J=1 هرتز، H {{34) }} من رامنوز)، 6.27 (1H، d، J=15.5 هرتز، Ar-CH =CH-)، 7.59 (1H، d، J=15.5 هرتز، Ar-CH=CH-)، 6.5–7.1 (6H، عطري H). 13C-NMR (125 ميجاهرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 131.5 (C-1)، 117.2 (C-2)، 146.2 (C-3)، 144.7 (C-4) )، 116.4 (C-5)، 121.3 (C-6)، 72.4 (C- )، 36.6 (C- )، 127.7 (Caf-1)، 115.3 (Caf{{89) }})، 146.9 (الكاف-3)، 149.8 (الكاف-4)، 116.6 (الكاف-5)، 123.2 (الكاف-6)، 168.3 (الكاف- )، 114.8 (Caf- )، 148.1 (Caf- )، 104.3 (G-1)، 76.1 (Glc-2)، 81.7 (Glc-3)، 70.5 (Glc-4) ) ، 76.3 (Glc-5)، 62.4 (Glc-6)، 103.1 (Rha-1)، 72.3 (Rha-2)، 72.1 (Rha-3) ) ، 73.9 (Rha-4)، 70.7 (Rha-5)، 18.5 (Rha-6). بالمقارنة مع البيانات الواردة في الأدبيات [17]، الجزء الأول يتوافق مع الأكتيوسيد.

الكسر الثاني: تمت ملاحظة HR-ESI-MS عند m/z 623.1987 (M−H)−، calcd لـ C29H35O15، 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz، CD3OD) δ جزء في المليون: 1.25 (3H، d، J=6.5 هرتز، CH3 من الرامنوز)، 2.78 (2H، t، J=7 هرتز، Ar-CH 2-)، 4.33 (1H، d، J=8 هرتز، H -1 من الجلوكوز)، 5.17 (1H، d، J { {33}} هرتز، H-1 من الرامنوز)، 6.28 (1H، d، J=15.5 هرتز، Ar-CH =CH-)، 7.56 (1H، d، J=15.5 هرتز، Ar-CH=CH-)، 6.5–7.0 (6H، عطرية H). 13C-NMR (125 ميجاهرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 131.5 (C-1)، 117.2 (C-2)، 146.2 (C-3)، 144.7 (C-4) )، 116.5 (C-5)، 121.3 (C-6)، 72.4 (C- )، 36.7 (C- )، 127.8 (Caf-1)، 115.2 (Caf{{89) }})، 146.8 (الكاف-3)، 149.7 (الكاف-4)، 116.6 (الكاف-5)، 123.2 (الكاف-6)، 169.2 (الكاف- )، 115.0 (Caf- )، 147.3 (Caf- )، 104.5 (G-1)، 75.5 (Glc-2)، 84.2 (Glc-3)، 70.1 (Glc-4) ) ، 75.7 (Glc-5)، 64.7 (Glc-6)، 102.8 (Rha-1)، 72.4 (Rha-2)، 72.4 (Rha-3) ) ، 74.1 (Rha-4)، 70.5 (Rha-5)، 17.9 (Rha-6). كانت البيانات الطيفية 1 H-NMR و13C-NMR متفقة مع بيانات الإيزواكتيوسايد كما ورد في الأدبيات [18].

الكسر الثالث: تمت ملاحظة HR-ESI-MS عند m/z 6{{108}}7.2032 (M−H)−, calcd لـ C29H35O14, 607.2032. 1 H-NMR (500 ميجا هرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 1.09 (3H، d، J=6 هرتز، CH3 من رامنوز)، 2.84 (2H، t، J=7.5 هرتز، Ar- CH 2-)، 4.37 (1H، d، J=8 هرتز، H -1 من الجلوكوز)، 5.19 (1H، d، J=1.5 هرتز، H { {35}} من الرامنوز)، 6.27 (1H، d، J=16 هرتز، Ar-CH =CH-)، 7.59 (1H، d، J=16 هرتز، Ar- CH=CH-)، 6.6-7.1 (7H، العطرية H). 13C-NMR (125 ميجاهرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 130.8 (C-1)، 116.2 (C-2)، 130.9 (C-3)، 156.8 (C-4) )، 130.8 (C-5)، 116.2 (C-6)، 72.4 (C- )، 36.4 (C- )، 127.8 (Caf-1)، 114.8 (Caf{{88) }})، 149.8 (الكاف-3)، 146.9 (الكاف-4)، 116.6 (الكاف-5)، 123.2 (الكاف-6)، 168.3 (الكاف- )، 115.4 (Caf- )، 148.0 (Caf- )، 104.3 (G-1)، 76.3 (Glc-2)، 81.7 (Glc-3)، 70.4 (Glc-4) ) ، 76.1 (Glc-5)، 62.5 (Glc-6)، 103.0 (Rha-1)، 72.3 (Rha-2)، 72.2 (Rha-3) ) ، 73.9 (Rha-4)، 70.7 (Rha-5)، 18.4 (Rha-6). وفقًا للأدبيات [18]، فإن الجزء III يتوافق مع syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside.

الكسر الرابع: تمت ملاحظة HR-ESI-MS عند m/z 665.21{{20}} (M−H)−, calcd لـ C31H37O16, 665.2087. 1 H-NMR (500 ميجاهرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 1.09 (3H، d، J=6.5 هرتز، CH3 من rhamnose)، 2.00 (3H، s، OAc)، 2.72 (2H، t، J=7.5 هرتز، Ar-CH 2-)، 4.55 (1H، d، J=8 هرتز، H -1 من الجلوكوز)، 4.90 (1H، d، J=1 هرتز، H-1 من رامنوز)، 6.29 (1H، d، J=15.5 هرتز، Ar-CH =CH-)، 7.62 (1H، d ، J=15.5 هرتز، Ar-CH=CH-)، 6.5–7.0 (6H، عطرية H). 13C-NMR (125 ميجاهرتز، CD3OD) δ جزء في المليون: 131.9 (C-1)، 117.3 (C-2)، 146.1 (C-3)، 144.7 (C-4) )، 116.4(C-5)، 121.4 (C-6)، 72.7 (C- )، 36.4 (C- )، 127.7 (Caf-1)، 115.4 (Caf{{93) }})، 146.9 (الكاف-3)، 149.9 (الكاف-4)، 116.6 (الكاف-5)، 123.2 (الكاف-6)، 168.1 (الكاف- )، 114.7 (Caf- )، 148.2 (Caf- )، 101.8 (G-1)، 75.3 (Glc-2)، 80.3 (Glc-3)، 70.8 (Glc-4) ) ، 76.2 (Glc-5)، 62.3 (Glc-6)، 103.3 (Rha-1)، 72.0 (Rha-2)، 71.8 (Rha-3) ) ، 73.7 (Rha -4)، 70.8 (Rha -5)، 18.5 (Rha -6)، 171.5 (C=O)، 20.9 (OAC). كانت البيانات الطيفية 1 H-NMR و13C-NMR متفقة مع تلك الخاصة بـ 2'-أسيتيللاكتيوسيد [17].

4 - نتائج

تم إنشاء طريقة HSCCC للفصل والتنقية التحضيرية للأكتيوسيد، والإيزواكتيوسيد، والسيرينغاليد A 3'- -L-rhamnopyranoside و2'-أسيتيللاكتيوسايد من Cistanches deserticola YC Ma. تشير الدراسة الحالية إلى أن HSCCC هي تقنية قوية جدًا للفصل التحضيري وتنقية المكونات النشطة بيولوجيًا من المواد النباتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل المركبات على نطاق واسع بما فيه الكفاية وبدرجة نقاء عالية ويمكن بعد ذلك استخدامها كمواد مرجعية للكروماتوغرافيا أو دراسات النشاط الحيوي. تعتبر هذه الطريقة تقنية مجدية واقتصادية وفعالة للعزل التحضيري السريع للمنتجات الطبيعية المعقدة.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%